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방법 논문

교세포섬유산성 단백질 및 그 질병 관련 변이체의 생화학적 분석에 대한 실험적 접근법

1.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69523

⸱

2025년 11월 28일

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

이 논문에서

요약

본 연구는 GFAP와 그 병을 유발하는 돌연변이를 생화학적으로 특성화하기 위한 실험적 방법을 개략적으로 제시하며, 필라멘트 조립, 응집, 번역 후 변형에 중점을 둡니다. 고순도 GFAP 단백질을 분석하여 알렉산더병 기전에 대한 통찰을 밝혀내어 잠재적 치료 표적 연구와 GFAP 돌연변이 및 관련 질환 이해에 대한 틀을 제공하였습니다.

초록

교세포섬유산성 단백질(GFAP)은 중추신경계에서 성상교세포의 구조적 완전성과 기능을 유지하는 데 중요한 중간 필라멘트 단백질입니다. GFAP의 돌연변이는 Alexander disease(AxD)의 근본 원인으로, GFAP 수치가 상승하고 Rosenthal 섬유 형태로 GFAP가 축적되는 드문 신경퇴행성 질환입니다. 여기서는 GFAP와 그 질병 유발 변이의 생화학적 특성화를 위한 포괄적인 실험적 접근법을 개괄합니다. 최적화된 발현과 첨단 정제 기법을 사용하여 야생형 및 돌연변이 GFAP 단백질 모두에서 높은 수율과 순도를 달성했습니다. 생화학적 분석법을 사용하여 병원성 돌연변이가 필라멘트 조립, 용해도, 응집에 미치는 영향을 평가하였습니다. 또한, GFAP 응집에서 이상한 번역 후 변형의 역할과 필라멘트 특성에 미치는 영향도 탐구했습니다. 이 연구는 AxD에서 GFAP의 역할에 대한 이해를 진전시키고, GFAP 기능 장애를 표적으로 하는 치료 전략 개발의 기초를 마련합니다. 더 나아가, 여기서 제시된 방법론은 GFAP 돌연변이의 생화학적 결과를 조사하고 GFAP 관련 질환에 대한 개입을 발전시키는 데 유용한 도구로 활용됩니다.

서론

알렉산더병(AxD)은 주로 성숙한 성상교세포에서 발견되는 III형 중간섬유 단백질(GFAP)1을 암호화하는 유전자의 우성 돌연변이로 인해 발생하는 유전 질환입니다. AxD는 GFAP 상향조절 2, 반응성 아스트롤리오시스3, 그리고 주로 GFAP와 αB-결정체4 , 유비퀴틴5와 같은 관련 단백질로 구성된 로젠탈 섬유의 축적이 특징입니다. GFAP 유전자의 돌연변이는 정상적인 필라멘트 조립6을 방해하여 비정상적인 집합, 세포 스트레스 반응7의 유도, 그리고 인산화8, 산화9, 유비퀴틴화10과 같은 이상한 번역 후 변형(PTMs)을 통한 추가 불안정화를 초래합니다.

GFAP이 AxD 병리학에서 중심적인 역할을 함에도 불구하고, 돌연변이 GFAP가 필라멘트 조립을 방해하고 응집을 촉진하며 세포 스트레스를 유발하는 분자 메커니즘은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 지식 격차는 GFAP 응집과 독성을 다루기 위한 표적 치료제 개발을 방해합니다. GFAP와 그 AxD 관련 변이체의 생화학적 특성을 연구하는 것은 질병 진행의 분자 메커니즘을 밝히는 데 매우 중요합니다. 그러나 GFAP의 집결 취약성과 질병 관련 변이에서 변화된 조립 행동은 실험 분석에 독특한 도전 과제를 제시합니다. 통제된 생화학적 연구에서는 동물 모델이나 재조합 발현을 통해 얻은 정제된 GFAP가 필요하며, 이를 통해 AxD 돌연변이가 필라멘트 조립, 응집 및 병리학적 변형에 미치는 영향을 조사합니다.

이 연구에서 제시된 실험적 접근법은 대체 기법에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 세포 기반 모델11 과 면역조직화학 연구12 는 GFAP의 발현 및 국소화에 대한 귀중한 통찰을 제공하지만, 세포 환경의 복잡성 때문에 필라멘트 조립과 응집의 정확한 생화학적 메커니즘을 포착하지 못하는 경우가 많습니다. 반면, 여기서 설명한 방법들, 예를 들어 시험관 내 필라멘트 조립 분석, 침적 분석, PTM 특성 분석은 GFAP와 그 질병 관련 변이체의 내재적 생화학적 특성을 통제된 조사를 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 연구자들이 필라멘트 조립과 집집 거동을 단순화된 시스템에서 분석할 수 있게 하여 GFAP 기능 장애의 분자 메커니즘을 규명하는 데 도움을 줍니다. 이전 연구들은 데스민13 과 케라틴14를 포함한 IF 단백질 분석에 이러한 생화학적 기법의 유용성을 입증하여 GFAP 연구에 적용할 수 있음을 강조했습니다.

또한, 이 원고는 독자들이 설명된 방법들이 특정 응용에 적합한지 판단하는 데 도움이 되는 정보를 제공합니다. GFAP의 생화학적 특성, 조립 거동(PTM)을 연구하려는 연구자들은 이러한 기법이 질병 관련 변이와 그 병리학적 영향을 조사하는 데 특히 유용할 것입니다. 이러한 생화학적 접근법을 세포 기반 연구나 동물 모델과 같은 다른 실험 시스템과 통합함으로써, 연구자들은 AxD 및 기타 관련 성상세포병증에서 GFAP 기능 장애에 대해 보다 포괄적인 이해를 이룰 수 있습니다.

이 방법의 전반적인 목표는 GFAP와 그 AxD 관련 변이체의 생화학적 분석을 위한 실험적 접근법, 단백질 정제 기법, 시험관 내 필라멘트 조립 분석, 침적 분석, PTM 특성 분석을 제시하는 것입니다. 이 방법들은 AxD에서 GFAP 기능 장애의 분자적 기초에 대한 중요한 통찰을 제공하며, 치료 개발의 길을 열었습니다. 더 나아가, 이러한 실험 기법의 적용은 AxD 내 GFAP 생화학에 대한 이해를 진전시키고 IF 연구의 더 넓은 분야에 기여할 것입니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 동물은 R237H knock-in 돌연변이11을 가진 AxD 모델 쥐입니다. 모든 동물 실험은 국립 칭화대학교 생명과학 및 의학대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회(NTHU IACUC 승인 번호 109088 및 111060)의 승인을 받았으며, 실험동물 관리 및 사용 농업 가이드북의 지침에 따라 진행되었습니다.

1. 박테리아로부터 재조합 GFAP의 정제 (그림 1)

  1. 대 장균 BL21(DE3) pLysS 균주를 wt 또는 돌연변이 GFAP의 cDNA를 포함한 pET 23b 벡터로 변환합니다.
  2. 1L의 Luria-Bertani 배지에 배양 박테리아를 넣고, 100 μg/mL 암피실린과 34 μg/mL 클로로암페니콜을 37°C에서 OD600 ~0.2 정도로 보조했습니다.
  3. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG, 0.5 M)를 최종 농도인 0.5 mM에 첨가하여 37 °C에서 4시간 동안 GFAP 발현을 유도합니다.
  4. 6,371 xg 에서 4 °C에서 30분간 원심분리하여 박테리아를 채취합니다.
  5. 용해 박테리아를 50 mL TEN 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl)에 0.2 mM 페닐메탄설폰닐 플루오라이드(PMSF)를 보조하여 Dounce 균질화로 투여합니다.
  6. 원심분리기 박테리아 용해액은 22,045x g 에서 4 °C에서 20분간 투여한 후, Triton X-100 버퍼(1% (v/v) Triton X-100 포함)에서 추출합니다.
  7. 동일한 조건에서 원심분리 후, 생성된 펠릿을 고염 버퍼(TEN, 1% (v/v) Triton X-100 및 1.5 M KCl)에서 추출합니다.
  8. 같은 조건에서 원심분리 후 펠릿을 TEN 버퍼로 세척하세요.
  9. 최종 펠릿을 실온에서 3시간 저어 10mL 요소 버퍼(8 M 요소, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.2 mM PMSF)에 용해시킵니다.
  10. 원심분리기는 4°C의 테이블탑 초원심분리기에서 80,000 xg 의 요소로 20분간 추출합니다.
  11. 폴리에틸레네이민(1% (v/v))을 요소 용해 분획에 최종 농도인 0.06%(v/v)로 첨가한 후 얼음 위에서 5분간 배양합니다.
  12. 80,000x g 4 °C에서 20분간 원심분리한 후, 상청액 분량을 완충 A(6 M 요소, 20 mM MES, pH 6.0, 14.4 mM β-머캅토에탄올)에 대해 전액 분해합니다.
  13. 부하 이석액은 NGC 크로마토그래피 시스템의 버퍼 A에서 미리 평형화된 CM-세파로스 이온 교환 컬럼에 부착됩니다.
  14. 1시간 동안 완충기 A에서 1 mL/min 유량으로 선형 구배 0-0.5 M NaCl을 사용하는 단백질을 유출합니다.
  15. GFAP 함유 분획을 모아 완충 B(6M 요소, 10 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA)에 대해 이물질로 전환합니다.
  16. 완충 B에서 미리 평형화된 음이온 교환 컬럼에 적재 이물질을 투여합니다. 0-0.5 M 선형 구배를 가진 NaCl 단백질을 1시간 동안 완충 B에서 1 mL/min 유량으로 유출합니다.
  17. SDS-PAGE와 Coomassie 블루 염색을 이용한 컬럼 분율을 분석합니다. 정제된 GFAP가 포함된 것은 수집하여 -80 °C에서 보관하세요.
    참고: 박테리아 용해는 여러 번의 냉동 및 해동 과정을 통해 촉진될 수 있습니다. 폴리에틸에네이민의 최종 농도는 0.06%(v/v)를 넘지 않아야 하며, 이 이상을 넘어 단백질도 침전됩니다. PMSF와 β-머캡토에탄올과 같은 유해 물질을 다룰 때는 유해 폐기물 처리에 대한 명확한 안전 지침과 지침을 포함하는 것이 매우 중요합니다. PMSF는 매우 독성이 강하며 피부, 눈, 호흡기에 자극을 줄 수 있습니다. PMSF 용액을 신선한 상태로 후드에서 준비하고 직접 접촉을 피하세요. β-머캅토에탄올은 강한 독성 가스를 배출하므로 환기가 잘 되는 곳에서 사용하세요.

2. 시험관 내 조립 및 침전 분석 (그림 2)

  1. 정제된 WT 또는 돌연변이 GFAP를 6 M 요소에 0.3 mg/mL로 희석하고, 저염 완충제(10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 14.4 mM β-머카페탄올)에서 투여합니다.
  2. 샘플을 4M과 2M 요소를 포함한 저염 완충제에 대해 실온에서 4시간 동안 투석합니다.
  3. 4°C에서 요소가 없는 저염 완충제에 대해 하룻밤 동안 샘플을 투석합니다.
  4. 조립 완충제(10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl, 14.4 mM β-머카페페탄올)를 실온에서 12-16시간 동안 이분해합니다.
  5. 조립 완충제 내 0.2mL 0.85 M 자당이 들어 있는 자당 쿠션 위에 조립 혼합물을 옮깁니다.
  6. 고속 침전 분석에서는 테이블탑 마이크로 초원심분리기를 사용하여 20 °C 환경에서 80,000x g 압력으로 20분간 혼합물을 원심분리합니다.
  7. 메탄올/클로로포름 침전을 수행하여 상청액 분획에 조립되지 않은 GFAP를 농축합니다. 재현탁 침전물은 0.2 mL의 Laemmli 샘플 버퍼(25 mM 트리스-HCl(pH 6.8), 1% 도데실 황산나트륨(SDS), 12.5% (v/v) 글리세롤, 0.01% (w/v) 브로모페놀 블루, 355 mM β-머카프토에탄올) 내에 침전됩니다.
  8. 조립된 GFAP를 Laemmli 샘플 버퍼의 펠릿 분획에 재현탁합니다.
  9. 상청액과 펠릿 분획을 10% SDS 플라이크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 젤과 10mL 쿠매시 블루 염색에 검사합니다.
  10. 저속 침전 분석에서는 벤치 탑 원심분리기를 사용해 3,000 xg 압력에서 20 °C에서 5분간 혼합물을 조립합니다.
  11. 상정액 분획에 비응집형 GFAP에 0.2mL의 Laemmli 샘플 버퍼를 첨가합니다.
  12. 응집된 GFAP를 Laemmli 샘플 버퍼 내 펠릿 분율에 직접 재현탁하며, 상상액 분율에 비례하는 부피로 재현탁합니다.
  13. 상청액과 펠릿 분획을 10% (w/v) SDS-PAGE 겔로 분석한 후 쿠매시 블루 염색을 합니다.
    참고: 메탄올과 클로로포름은 독성 용매이며 심각한 건강 문제를 일으킬 수 있습니다. 피부 접촉과 흡입은 피하세요. 유출을 방지하기 위해 연기 후드에서 조심해서 다루세요.

3. 음수 염색 및 전자현미경 (그림 2)

  1. 글로우 방전 청소 시스템에서 20 mA로 Formvar/탄소 코팅 구리 그리드를 45초간 방전합니다.
  2. 조립 혼합물을 발광 방전 그리드에 전달하고 샘플이 지지 필름에 60초 동안 결합하도록 합니다.
  3. 격자 가장자리를 흡수 종이로 흡수하여 과잉 액체를 제거하세요.
  4. 그리드를 증류수로 세척한 후, 1% 우라닐 아세테이트 20 μL로 60초간 염색합니다.
  5. 과도한 염색 용액을 제거하고 그리드를 30초간 자연 건조시키세요.
  6. H-7600 투과전자현미경(TEM) 하에서 100 kV의 가속 전압에서 고해상도 모드를 사용하여 그리드를 관찰합니다.
    참고: 단백질 샘플을 추가하기 전에 진공 증발기에서 그리드를 광 방전하면 샘플 흡착이 향상됩니다. 우라닐 아세테이트는 전자현미경에서 음성 염색을 위해 흔히 사용되는 방사성 및 매우 독성이 강한 화학물질입니다. 이를 다루려면 안전 프로토콜과 유해 폐기물 처리 지침을 엄격히 준수하여 인원과 환경에 대한 노출 위험을 최소화해야 합니다. 공기 중 입자나 증기 흡입을 방지하기 위해 우라닐 아세테이트 용액은 반드시 연기함에서만 준비하세요.

4. 산화 변형 (그림 3)

  1. GFAP를 6M 요소에 0.3 mg/mL로 희석하고, 저염 완충제(10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA 및 14.4 mM β-머카페탄올)를 실온에서 2시간 동안 희석합니다.
  2. 실온에서 4M 요소가 함유된 저염 완충제에 대해 2.5시간 동안 투석합니다. 자기 교반기를 사용해 완충제를 부드럽게 저어 균일한 분포를 유지하고 농도 구배를 방지하세요.
  3. 2.5시간 후에는 투석막을 실온에서 2M 요소가 함유된 저염 완충제에 2.5시간 더 옮기며, 과정 내내 부드럽게 저어줍니다.
  4. 요소 없는 저염 완충제에 4°C에서 18시간 동안 투석합니다.
  5. 투석된 샘플을 10 mM H2O2 로 15분간 처리한 후, 10 또는 100 mM 디티오트레이톨(DTT)으로 상온에서 추가로 15분간 처리합니다.
  6. 표준 10% (w/v) SDS-PAGE로 단백질 샘플을 β-머카페탄올 없이 분석하고, 10 mL의 쿠마시 블루로 염색합니다.
    참고:H2O2를 사용할 때는 강한 산화제이므로 화상을 유발할 수 있으므로 주의하여 다루어야 합니다. 피부와 눈 접촉을 피하기 위해 개인 보호 장비를 착용하세요. DTT는 피부, 눈, 호흡기계에 자극을 줄 수 있습니다. DTT와 H2O2를 다룰 때는 위험을 최소화하기 위해 적절한 안전 프로토콜을 따르는 것이 필수적입니다.

5. AxD 쥐 뇌에서 GFAP 정제 (그림 4A, B)

  1. Douce 균질기를 사용해 10mL의 TEN 완충제(10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA)를 사용하여 뇌 조직을 추출합니다.
  2. 뇌를 원심분리하여 76,000 xg , 4 °C에서 20분간 균질화한 후, 10 mL의 Triton X-100 버퍼(1% (v/v) Triton X-100, TEN 버퍼)로 추출합니다.
  3. 76,000 xg 압력, 4 °C에서 20분간 원심분리한 후, 10 mL의 자당 버퍼(0.85 M 자당 및 0.5% (v/v) Triton X-100 in TEN 버퍼)로 추출합니다.
  4. 76,000 xg 전압에서 4 °C에서 20분간 원심분리한 후, 10 mL의 고염 버퍼(1.5 M KCl 및 0.5% (v/v) Triton X-100 in TEN 버퍼)로 추출합니다.
  5. 76,000 xg 양 4 °C에서 20분간 원심분리한 후, 10 mL의 요소 완충제(8 M 요소, 10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 5 mM EDTA)로 최종 펠릿을 추출합니다.
  6. 상청액 분획을 채취하여 Q 컬럼 버퍼(6 M 요소, 10 mM 트리스-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 14.4 mM β-머캅토에탄올)에 대해 이물질로 투입합니다.
  7. 다이애리세이트를 NGC 크로마토그래피 시스템의 음이온 교환 컬럼에 적재합니다.
  8. 결합된 단백질을 0-0.5 M NaCl의 선형 구배로 Q 완충액에서 1 mL/min의 유량으로 용출합니다.
  9. GFAP 함유 분획을 모아 S 컬럼 버퍼(6 M 요소, 20 mM MES, pH 6, 14.4 mM β-머캅토에탄올)에 대해 이물질로 전환합니다.
  10. 이양온 교환 컬럼에 투석액을 적용한 후, 0-1 M NaCl in S 버퍼의 선형 구배로 1 mL/min 유량으로 결합된 단백질을 용출합니다.
  11. SDS-PAGE와 Coomassie 블루 염색으로 용출된 분획을 분석하고, 정제된 GFAP가 포함된 분획을 수집합니다.

6. 면역블롯팅을 통한 GFAP 유비퀴틴화 분석 (그림 4C)

  1. 정제된 GFAP를 10% (w/v) SDS-PAGE 젤에 사용하세요.
  2. 젤에서 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 옮깁니다.
  3. 3% (w/v) 소 혈청 알부민 10mL를 Tris 완충 식염수(TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl)에 0.1% (v/v) Tween 20 (TBST) 함유 1시간 실온에서 배양하여 막을 차단합니다.
  4. 5 μL 항-GFAP와 5 μL 항-유비퀴틴 1차 항체를 5 mL TBST에 희석하여 4 °C에서 하룻밤 배양합니다. 멤브레인을 TBST로 세 번 세척하세요.
  5. 5 μL 2차 항체를 형광 염료와 결합한 2차 항체를 5 mL TBST 용액에 희석하여 실온에서 최소 1시간 이상 배양합니다. 멤브레인을 TBST로 세 번 세척하세요.
  6. 형광 영상 검출 시스템을 사용해 이미지를 획득하세요.
  7. 2.1단계부터 2.13단계, 3.1단계부터 3.6단계까지 설명한 동일한 절차를 사용하여 TEM 및 침강 분석법(그림 5)으로 자연 GFAP의 시험관 내 조립을 분석합니다.

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결과

AxD를 유발하는 돌연변이가 GFAP 조립 특성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 우리는 PET 기반 발현 시스템을 사용하여 박테리아에서 재조합 단백질을 생산했습니다. 우리는 WT GFAP를 예로 들어 GFAP를 발현하고 정제하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. IPTG 유도(그림 1A, 레인 2) 후, GFAP는 포함체 준비(그림 1B)와 이온 교환 크로마토그래피(CM 컬럼(그림 1C, 레인 1)와 Q 컬럼(그림 1C, 레인 2, 3)을 이용한 3단계 과정을 통해 정제되었습니다.

정제된 재조합 GFAP는 투석을 통해 시험관 내에서 조립되었고, 우라닐 아세테이트로 음성 염색 후 전자현미경으로 시각화되었습니다. WT GFAP는 전형적인 10nm 필라멘트를 형성했으며(

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토론

이 프로토콜은 GFAP와 그 질병 관련 돌연변이체의 생화학적 특성 분석을 위한 포괄적인 실험적 틀을 확립합니다. 신뢰할 수 있고 표준화된 접근법을 제공함으로써, 이 방법은 특히 AxD 맥락에서 GFAP의 생물학적 역할과 병리학적 함의에 대한 이해를 증진시키는 귀중한 자원입니다. 이 섹션에서는 프로토콜의 여러 중요한 측면, 예를 들어 잠재적 수정 및 문제 해결 전략, 방법의 한계, 기존 접근법과 비교한 중요성, 그리고 특정 연구 분야에서의 광범위한 중요성과 응용 분야를 논의합니다.

본 연구에서는 재조합 WT GFAP 및 그 질병 관련 변이체의 정제를 위한 표준화된 프로토콜을 수립하여 이후 시험관 내 분석을 용이하게 하였습니다. 이 상세한 프로토콜은 IF 연구 커뮤니티에 귀중한 참고 자료로서, 고수율과 순도를 모두 갖춘 GFAP의 신뢰성 높은 준비를 보장...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스 와이즈만 센터의 트레이시 하게만 박사님께 R237H 녹인 쥐를 제공해 주셔서 감사드립니다. 이 연구에 대한 Albee Messing 교수님(위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스 Waisman 센터)의 제안과 지원에 깊이 감사드립니다. 이 작업은 과학기술부(111-2320-B-007-008 및 112-2320-B-007-006)로부터 N.-H. L. 및 M.-D.P.에 대한 보조금으로 지원받았습니다. 또한 이 연구에 장비 사용에 주신 국립 청화대학교 BioTEM(MOST-104-2731-M-007-002)에도 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
30% 아크릴아마이드/Bis 용액 37.5:1바이오라드1610158
과황산암모늄(APS)바이오라드1610700
암피실린USB11259
항GFAP 항체세포 신호 전달 기술12389
항유비퀴틴 항체밀리포어ST 1200클론 FK2
아반티 J-26S XP 원심분리기벡맨
클로로암페니콜USB23660
CM-세프로즈시티바1707 1901
쿠매시 블루 염료USB32826
구리 격자테드 펠라01753-F
CS 150 NX 마이크로 울트라센트퓨지히타치NA
둔스 균질화휘튼
DTTURDTT
대장균 BL21(DE3) pLysS 균주애질런트
이지글로우테드 펠라
ECL 시약퍼킨엘머넬 105001
EDTAUSB15699
H2O2시그마-올드리치18312
HiRes S 칼럼시티바2927 5877
하이트랩 Q 칼럼시티바1711 5301
IPTGURIPTG
KCl허니웰12636
LB 미디엄 (LB 아가)USB75851
LB 미디엄 (LB 육수)BD 디프코244620
머캅토에탄올시그마-올드리치M3148
MES시그마-올드리치M8250
나클허니웰31434S
NGC 크로마토그래피 시스템바이오래드
옵티마 XE-90 초심심분리기벡맨
PMSF아크로스 오가닉스215740050
폴리에틸레네이민시그마-올드리치P3143
로터벡맨
S55S 로터히타치
S80AT3 로터히타치
SDSUSB75819
SDS-페이지바이오라드
StarBright Blue 520 염소 안티마우스 IgG 바이오라드12005867
StarBright Blue 700 염소 안티토끼 IgG 바이오래드12004161
자당시그마-올드리치S5391
테메드USB76320
투과 전자현미경 H-7700)히타치NA
트리스USB75825
트리톤 X-100시그마-올드리치T9284
우라닐 아세테이트전자현미경 과학부;22400
요소허니웰15604H

참고문헌

  1. Brenner, M., et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 27 (1), 117-120 (2001).
  2. Hagemann, T. L., et al. Gene expression analysis in mice with elevated glial fibrillary acidic protein and Rosenthal fibers reveals a stress response followed by glial activation and neuronal dysfunction. Hum Mol Genet. 14 (16), 2443-2458 (2005).
  3. Hagemann, T. L. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 72, 140-147 (2022).
  4. Iwaki, T., et al. Alpha B-crystallin and 27-kd heat shock protein are regulated by stress conditions in the central nervous system and accumulate in Rosenthal fibers. Am J Pathol. 143 (2), 487-495 (1993).
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