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연구 논문

쥐에서 사이클로포스파마이드 유발 골수억제 완화에 있어 지안피성쉐 절제의 기전

567 조회수

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DOI:

10.3791/69542

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2026년 1월 2일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hunan University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine /Integrative Oncology, Hunan Cancer Hospital/The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 지엔피성쉐 응약이 통합 네트워크 약리학 및 동물 실험 접근법을 통해 사이클로포스파마이드 유발 골수억제를 완화하는 방식을 체계적으로 설명하며, 다중 표적 기전과 보조제로서의 잠재력을 밝힙니다.

초록

이 논문은 젠피성쉐 약제(JPSXD)가 네트워크 약리학과 동물 실험을 통해 화학요법으로 인한 골수억제를 어떻게 완화하는지 조사하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해 주요 성분과 표적을 분석하고, 단백질-단백질 상호작용 네트워크(PPI)와 허브-성분-표적 네트워크가 구축되었습니다. 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG)은 주요 경로를 규명했습니다. 60마리의 C57/BL6 마우스에서 사이클로포스파마이드(CTX) 유도 골수억제 모델이 확립되었습니다. JPSXD는 7일간 다양한 용량으로 투여되었습니다. 말초 혈액 수치, 사이토카인(혈전생성자[TPO], 에리트로포이에틴[EPO], 과립구-대식세포 콜로니자극인자[GM-CSF]), 흉선 지수, 골수 형태, CD34+ 세포, AKT1, JAK2, EGFR 발현을 평가하였다. 네트워크 분석에서 172개의 화합물과 454개의 표적이 확인되었으며, PI3K-Akt와 JAK-STAT 경로가 강조되었습니다. 생체 내에서 CTX는 백혈구 및 신호 단백질 수치를 감소시켰고, JPSXD는 카운트 수를 회복시키고 AKT1, JAK2, EGFR를 상향 조절했으며, 흉선 지수(p < 0.05)를 개선했습니다. 중용량 및 고용량 JPSXD는 TPO, EPO, GM-CSF, CD34+ 세포를 증가시키고 골수 구조를 개선했으며, 고용량 투여가 가장 강한 효과를 보였습니다. 결론적으로, JPSXD는 다중 표적, 다중 경로 조절을 통해 골수억제를 완화하며, 화학요법 유발 백혈구 감소증에 대한 보조 치료제로서의 잠재력을 지지합니다.

서론

화학요법은 다양한 악성 종양 치료의 초석으로, 주로 암세포 증식과 생존율을 억제하여 환자의 생존을 연장합니다. 그러나 정상 조직을 표적으로 삼는 선택성이 부족하기 때문에, 화학요법 약물은 건강한 세포와 조직에 심각한 손상을 일으켜 다양한부작용을 초래합니다. 화학요법의 가장 흔하고 심각한 부작용 중 하나는 골수억제로, 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 혈소판(PLT) 등 혈액 세포 생성이 감소하는 것이 특징입니다2,4. 골수억제는 면역 방어 체계를 심각하게 손상시켜 감염, 출혈, 빈혈 및 기타 합병증의 위험을 높입니다. 또한 환자들의 삶의 질을 크게 저하시키고 심지어 생명을 위협할 수도있습니다. 따라서 화학요법으로 인한 골수억제를 완화하고 예방하는 것은 환자의 화학요법 내성과 전체 생존율을 높이는 데 매우 중요합니다.

현재 임상 치료법은 주로 과립구 콜로니 자극인자[G-CSF], 에리트로포이에틴[EPO]와 같은 조혈 성장인자와 수혈 치료로 구성됩니다 6,7. 하지만 이러한 접근법은 종종 높은 비용, 잠재적 부작용, 제한된 효과와 연관되어 있습니다. 따라서 골수억제를 예방하고 완화하기 위한 더 안전하고 효과적인 방법을 탐구하는 것이 주요 연구 초점으로 남아 있습니다. 최근 몇 년간 전통 중의학(TCM)은 암 치료와 화학요법 유발 부작용 관리에 있어 큰 주목을 받고 있습니다 8,9. 성쉐바오10호, 디황성백11호, 인세노사이드12호 등 많은 한의학 제형은 정상 세포를 보호하고 독성 부작용을 줄일 뿐만 아니라 항종양 효과를 높여주는 등 탄력 강화 및 면역 조절 효과가 있다고 여겨집니다.

건피성설 약(JPSXD)은 고전 중의학 공식으로, 기를 강하게하고 피를 보충하는 치료 원리를 보여줍니다. 이 공식은 사군자약과 이지완을 결합한 정교한 변형으로, 여러 약초의 시너지 효과를 통합하여 기와 혈핍을 해결한다. 이 조제법은 인삼(Ren Shen), 황기(황기), 에피미디엇(Yin Yang Huo), 백주(atractylodes), 얌(Shan Yao), 살비아(Dan Shen), 준비된 고황(Shu Di Huang), 도더씨(Tu Si Zi), 울프베리(Gou Qi Zi), 리구스트럼(Nv Zhen Zi), 당귀(Dang Gui), 튀긴 보리(Chao Mai Ya), 튀긴 닭 모래주머니(Chao Ji Nei Jin) 등이 포함되어 있습니다. 말린 귤 껍질(천피), 코익씨(이이런), 그리고 여러 다른 허브가 있습니다. 각 약초는 공식에서 특정 역할을 하며, 한의학의 주권, 신도, 보조, 인도 원칙을 준수하여 균형 잡히고 목표 지향적인 치료 효과를 보장합니다.

사군자부는 중의학의 기초가 되는 처방으로, 기를 강화하고 비장을 강화하는 능력으로 유명합니다. 피로, 식욕 부진, 면역력 저하 등 기 부족과 혈결과 관련된 질환 치료에 널리 사용되어 왔습니다. 현대 약리학 연구들은 시준지 구제가 면역 기능을 향상시키고 조혈을 촉진하며 신체의 자기 회복 능력을 향상시키는 것으로 입증되었습니다15,16. 이 기반 위에 JPSXD는 혈액 영양 공급의 효능을 높이고 더 복잡한 결핍 문제를 해결하기 위해 추가 허브를 포함하고 있습니다. 예를 들어, 가공된 지옥과 당광은 주요 혈액 영양 허브이며, 황골과 인삼은 기(氣)를 증진시키고 전반적인 활력을 향상시키는 데 시너지 효과를 냅니다.

최근 연구들은 JPSXD의 항종양 효과 가능성을 강조했으며, 다성분, 다표적 접근법이 종양 성장을 억제하고 기존 암 치료의 효능을 높일 수 있음을 시사했습니다19,20. 이 포뮬러는 면역 반응을 조절하고 조혈 기능을 개선하는 능력으로, 화학요법이나 방사선 치료를 받는 환자들을 지원하는 데 특히 가치가 있습니다. 이들은 치료 부작용으로 기와 혈액 결핍을 자주 경험하는 경우가 많습니다21. 더 나아가, 살비아와 에피미디엄 같은 허브의 첨가는 미세순환을 개선하고 세포 수리 기전을 강화하는 것으로 나타났으며, 이는 이 포뮬러의 전반적인 치료 효과에 기여합니다22.

현대 약리학 연구들은 JPSXD의 각 허브가 조혈 기능, 항골수억제, 면역조절, 항산화 및 미세순환 개선과 관련된 약리학적 활성을 가지고 있음을 입증하여, JPSXD가 화학요법으로 인한 골수억제 완화에 사용되는 데 간접적인 연구를 뒷받침하고 있습니다. 표 1은 각 허브의 주요 약리학적 효과와 관련 참고문헌을 요약하며, 조혈, 항골수 억제 활성, 면역조절, 항산화 또는 미세 순환 촉진 특성 연구를 중점적으로 다룹니다. JPSXD의 복잡한 성분 시너지는 허브 간 협력적 상호작용과 길항적 상호작용을 모두 포함하며, 여러 경로를 겨냥해 전체론적 치료 효과를 달성합니다. 예를 들어, 인삼과 황기가 함께 힘을 보조하는 반면, 살비아와 준비된 지휘관은 혈액을 보충하고 혈액순환을 개선합니다. 동시에 말린 귤 껍질과 튀긴 보리 같은 허브는 소화를 조절하고 정체를 방지하여, 이 공식의 토르피 효과가 몸에 효과적으로 흡수되고 활용되도록합니다. 이러한 다면적인 접근법은 질병의 근본 원인을 치료하면서 증상을 다루는 중의학 철학과 일치합니다.

결론적으로, JPSXD는 기와 혈액해독의 원리를 구현한 균형 잡히고 과학적으로 뒷받침된 한의학 공식입니다. 면역 증진, 조혈 촉진, 항종양 치료 지원에 대한 잠재적 활용 가능성은 전통과 현대 의학 모두에 귀중한 자산이 됩니다. 그러나 JPSXD가 화학요법으로 인한 골수억제 완화에 효과적인지 직접 평가한 고품질 임상 근거는 여전히 부족합니다. 그 기전을 밝히고 임상 적용 전략을 최적화하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 따라서 본 연구는 전임상 기전 관점에서 JPSXD의 잠재적 치료 효과에 대한 개념 증명을 제공하는 것을 목표로 합니다.

네트워크 약리학은 체계적이고 통합적인 특성을 지니고 있어 한의학의 활성 성분을 식별하고 그 작용 기전을 밝히는 데 널리 사용되어 왔습니다24,25. 본 연구에서는 네트워크 약리학을 활용하여 골수억제 맥락에서 JPSXD가 영향을 미치는 신호 전달 경로와 주요 표적을 분석하였습니다. 또한, 관련 지표를 평가하고 JPSXD가 골수억제에 미치는 영향을 평가하기 위해 사이클로포스파마이드(CTX) 유도 골수억제 마우스 모델이 구축되었습니다. 네트워크 약리학을 통해 확인된 주요 표적과 경로에 대한 예비 검증도 수행되었습니다. 이 연구는 네트워크 약리학과 동물 실험을 체계적으로 통합하여 JPSXD가 PI3K-AKT 경로와 같은 신호 전달 경로의 다중 표적 조절을 통해 화학요법으로 유도된 척수억제를 완화하는 분자 메커니즘을 밝히는 최초의 연구로, 이 화합물의 조혈 보호 효과에 대한 기전적 이해의 공백을 메웠습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 실험동물 관리 규정과 후난 암병원 실험동물센터의 윤리 지침을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 후난성 암병원 동물윤리위원회(승인 번호: KNZY-202416)의 승인을 받았습니다. 연구 전반에 걸쳐 연구자들은 사용되는 동물 수를 최소화하고 고통을 완화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

동물 조리
총 60마리의 10주 된 수컷 C57/BL6 마우스가 후난 슬랙 징다 실험동물 주식회사(허가 번호: SCXK [Hu] 2021-0002)에서 확보되었습니다. 모든 쥐는 후난 암병원 실험동물센터에 수용되었으며, 온도 23± 2°C, 습도± 50% 10%, 12시간의 밝고 어둠 주기(8:30-20:30)를 유지했습니다. 쥐들은 자유롭 게 음식과 물을 섭취할 수 있었습니다. 실험 전에는 3일 동안 매일 5분간 만져주며 환경에 적응시켰습니다. 적응 후, 60마리 모든 쥐는 체중에 따라 층화되어 컴퓨터 생성 난수 표를 사용해 6개 그룹(n=10명)으로 무작위로 배정했습니다. 그룹은 다음과 같았습니다: 블랭크 대조군, 모델군, 생리식염수(NS) 대조군, 고용량 JPSXD(40 mg/kg), 중용량 JPSXD(30 mg/kg), 저용량 JPSXD(20 mg/kg). 무작위화 과정은 그룹 간 평균 체중 차이를 보장하지 않았습니다(p > 0.05). 무작위화 시퀀스는 편향을 최소화하기 위해 후속 실험 절차에 참여하지 않은 연구자들에 의해 생성 및 실행되었습니다.

재료 준비
안전성과 폐기물 처리: 이 연구에는 매우 독성이 강한 화학요법제인 CTX가 사용되었습니다. 모든 절차는 유해 화학물질 안전 관리 규정과 생물안전 2단계 실험실 기준에 엄격히 따라 수행되었습니다. 구체적인 예방 조치로는 모든 인원이 일회용 보호복, 니트릴 장갑, N95 방독 마스크, 보호 고글을 착용하는 것이 포함되었습니다. CTX 준비 및 투여는 Class II 생물안전 캐비닛 내에서 수행되었습니다. CTX 주입 용액의 준비는 에어로졸 형성을 방지하기 위해 전용 장비를 사용하여 연기 후드에서 수행되었습니다. 주사기, 장갑 등 CTX에 오염된 샤프와 용품은 구멍 방지 용기에 버려졌습니다. 기타 오염 물질(예: 침구, 동물 조직)은 10% 차아염소산나트륨에 24시간 동안 담가 비활성화한 후 인증된 의료 폐기물 처리 업체에 의해 소각되었습니다. CTX 유출 시 해당 부위는 즉시 흡수성 면으로 덮고 1% 티오설페이트 나트륨 용액으로 중화시켰습니다. 이 사건은 안전 감독관에게 보고되었습니다.

약물 및 시약: CTX 주사는 독일 Baxter Oncology GmbH에서 획득했습니다(배치 번호: HJ20160467). JPSXD는 후난성 암병원 중의학과에서 작성하였습니다. 이 실험은 15종의 전통 허브로 구성되어 있었는데, 여기에는 판낙스 인삼, 암골 멤브라나세우스, 에피미디트 브레비코르눔, 아트랙틸로데스 크로케팔라, 디오스코레아 오포시타, 살비아 밀티오리자, 레만니아 글루티노사, 쿠스쿠타 치넨시스, 리시움 바르바룸, 리구스트럼 루시둠, 엔젤리카 시넨시스, 튀긴 맥아, 닭모래주머니 안감, 말린 귤 껍질, 코익씨드 등이 고전적 적합성 비율에 따라 결합되었다20. 증액은 최종 농도인 3 kg/L(즉, 3 g/mL)로 농축되었습니다. 개비지 전에는 농축물을 NS로 희석하여 각 용량군에 필요한 농도를 얻었다: 고용량군은 4 mg/mL(40 mg/kg), 중용량군은 3 mg/mL(30 mg/kg), 저용량군은 2 mg/mL(20 mg/kg)26. 가비지 부피는 체중 10g당 0.1 mL로 계산되었으며, 최종 투여량은 마우스당 0.2-0.25 mL(체중 범위 20-25g)로 나타났습니다27.

ELISA 키트: 마우스 육아세포-대식세포 콜로니자극인자(GM-CSF), EPO, 혈전생성(TPO)용 상업용 ELISA 키트가 사용되었습니다. 검사 전에 혈청 샘플을 PBS 버퍼(pH 7.4)에 1:5 희석하였다. 표준 단위는 우물당 100 μL 단위로 재구성되었습니다.

2차 항체: HRP 결합 염소 항토끼 IgG를 5% 무지방 건조유와 0.05% Tween-20이 포함된 TBST 완충액에서 1:5000(최종 농도: 0.04 μg/mL)으로 희석하였습니다. 용액은 갓 준비되어 상온에서 1시간 배큐되었습니다.

웨스턴 블롯에 대한 1차 항체는 GAPDH(토끼 다클론), AKT(토끼 다클론), JAK2(토끼 단클론), EGFR(마우스 단클론)을 사용하였습니다. 모든 항체는 5% BSA를 포함한 TBST 버퍼에 희석하였으며, GAPDH(1:1000), AKT(1:1000), JAK2(1:800), EGFR(1:800)을 포함하였습니다. 배양 용량은 막당 100 μL였습니다.

조직 고정제: PFA 분말을 PBS(pH 7.4)에 녹여 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 제조하였습니다. 휴지는 24시간 동안 고정되어 있었습니다.

헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색액: 헤마톡실린 용액(0.1% Harris 헤마톡실린)과 에오신 Y 용액(0.5%)이 표준 병리 프로토콜28에 따라 준비되었습니다. 헤마톡실린은 5분, 에오신은 3분으로 염색 지속 시간이 걸렸습니다.

면역형광 차단 버퍼: 염소 혈청 10%와 BSA 1%를 포함한 PBS 완충액을 차단에 사용했으며, 30분 배양하였습니다.

면역형광을 위한 항체 희석 버퍼: 면역형광을 위한 1차 항체(CD34+, TPO, EPO, GM-CSF)는 제조사 권장 희석 비율(1:200)에 따라 1% BSA가 포함된 PBS 버퍼에 희석하여 최종 농도는 2.5 μg/mL를 얻었습니다. 인큐베이션 용량은 조직 절편당 50 μL였습니다.

동물 모델의 유도
60마리의 쥐를 무작위로 6개 그룹(그룹 당 n = 10개)으로 나누었습니다: 빈 대조군, 모델군, 고용량, 중용량, 저용량, 그리고 자연 조련군. 빈 대조군을 제외한 모든 마우스는 3일 연속 CTX(20 mg/kg) 복막 내 주사를 받아 골수억제 모델을 확립하였습니다. 모든 모델 마우스는 백혈구 < 1.8 × 109/L, PLT < 85 × 10⁹/L, 그리고 최종 주사 후 24시간 기준 골수 핵세포 수가 >55% 감소하였습니다. 이 프로토콜은 확립된 CTX 유도 골수억제 모델과 일치합니다29,30. 주사 후에는 쥐들은 활동량, 털 외모, 체중 변화 등 전반적인 상태를 매일 모니터링했습니다. 모델링이 시작된 시점부터 실험이 끝날 때까지, 매일 같은 시간에 전자 저울을 사용해 체중을 기록했습니다. 체중 변화율은 다음과 같이 계산되었습니다: (최종 체중 / 초기 체중) x 100% × JPSXD의 전반적인 생리적 상태와 잠재적 보호 효과를 평가하기 위함. 주사 후, 쥐들은 개별 환기된 케이지(IVC)에 수용되었으며, 각각은 CTX 오염됨으로 명확히 표시되어 있었습니다. 침구는 2일마다 교체되었고, 사용한 침구는 위에서 설명한 유해 폐기물 규정에 따라 폐기되었습니다.

위내 투여
고용량, 중용량, 저용량군의 쥐들은 각각 40 mg/kg, 30 mg/kg, 20 mg/kg 용량으로 JPSXD를 가베지(가베지)로 받았습니다. 식염수 대조군은 동일한 양의 자연 박수(NS)를 투여했습니다. 개비지 용액은 각각 4 mg/mL, 3 mg/mL, 2 mg/mL 농도로 준비되어 체중 10g당 0.1 mL의 부피로 투여되었습니다. 모든 쥐는 7일 연속 하루 2회 가베네이션을 받았습니다. 식염수 대조군은 쥐당 0.2-0.25mL의 뇌 신경 주장을 받았습니다. 빈 그룹과 모델 그룹에는 어떠한 처리도 이루어지지 않았다. 기침이나 버티기 힘들어함이 없다는 것은 올바른 투여 방법을 시사합니다.

혈액 채취 및 혈청 준비
CTX 주사3일째 에 꼬리정맥에서 0.2mL의 혈액을 채취하여 완전 자동 혈액학 분석기를 이용해 말초혈구 수를 측정하여 모델 구축 성공 여부를 평가했습니다. JPSXD의 최종 개비지 후 24시간 후, 무작위로 선정된 쥐(그룹당 n = 10명)의 안와 부동에서 혈액을 채취하였다. 혈액의 일부는 완전한 혈구 수치 분석에 사용되었고, 나머지는 혈청 준비를 위해 처리되었다. 샘플은 3,000 x g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리되었습니다. 상청액(투명하고 연한 노란색 상층)은 혈청으로 채취되어 -80 °C에서 저장되어 이후 ELISA 검사와 간/신장 기능 검사를 위해 사용되었습니다. 혈청층은 혈액 세포층과 명확히 분리되어 있었으며, 용혈이나 탁도 징후가 없었다. 측정된 혈액학적 지표에는 BBC, RBC, PLT, 헤모글로빈(Hb) 수치가 포함되었습니다.

간 및 신장 기능 평가
완전 자동화된 생화학 분석기를 사용해 혈청 간 기능 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)와 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제(AST)와 신장 기능 지표인 혈중 요소 질소(BUN), 크레아티닌(Cre)을 측정했습니다. 모든 절차는 기기의 표준 작동 프로토콜을 따랐다. 구체적으로, 100 μL의 혈청을 해당 분석키트(ALT, AST, BUN, CRE)와 혼합하여 37 °C에서 5분간 배양했습니다. 흡광도는 340nm에서 측정되었습니다. 각 샘플은 중복하여 검사되었고, 평균값을 사용해 분석했습니다.

장기 지수 계산
JPSXD의 최종 가비지 투여 후 24시간 후, 쥐들은 점진적 이산화탄소(CO2) 흡입(유속: 분당 20% 챔버 부피)으로 안락사시키고, 이후 2차 방법으로 자궁경부 탈구를 시행했다31. 안락사 직후에는 간, 신장, 비장, 흉선을 복측 중앙선 절개를 통해 무균적으로 채취했습니다. 장기는 주변 결합 조직과 지방에서 부드럽게 해부한 후, 얼음처럼 차가운 생식식염수(NS)로 헹구어 잔여 혈액을 제거했습니다. 기관은 표준화된 압력(3회 부드럽게 누르기)하에 미리 무게를 재운 필터 페이퍼로 닦아내고, 즉시 보정된 전자 저울(정확도: ±0.1 mg)에서 실온(22 ± 1°C)에서 무게를 측정했습니다.

모든 시술은 자가용해를 최소화하기 위해 미리 냉각된 스테인리스 트레이 위에서 시행되었습니다. 장기 지수는 장기 무게(mg)를 체중(g)으로 나눈 값으로 계산하여 JPSXD가 주요 장기에 미치는 영향을 평가하였습니다. 각 조직의 일부는 웨스턴 블롯 분석용으로 예약되었고, 나머지 샘플은 이후 조직학적 평가를 위해 4% PFA에 고정되었습니다.

엘리사
TPO, EPO, GM-CSF의 혈청 농도는 제조사 지침에 따라 ELISA 키트를 사용해 측정되었습니다. 샘플 세척과 시약 재구성을 포함한 모든 원심분리 단계는 실온에서 1,000 x g 에서 5분간 수행되었습니다. 세척 단계는 PBST 버퍼(PBS 포함 0.05% Tween-20)를 사용하여 각 웰당 300 μL의 세척액을 추가하고 3회 반복하여 수행했습니다. 세척 후에는 우물 바닥에 잔류 액체가 남아 있지 않았습니다. 색이 발현된 후 뚜렷한 파란색 침전물이 보였습니다. 반응이 종료된 후 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450nm 구간에서 흡수율을 측정했습니다.

H&E 염색
안락사 후에는 흉선과 대퇴골을 채취했습니다. 흉선 무게를 측정하여 흉선 지수(흉선 체중 [mg]/체중 [g])를 계산했습니다. 체중 측정 후 흉선 일부를 서부 블롯 분석에 사용했고, 나머지와 대퇴골은 4% PFA로 고정되었습니다. 대퇴골 샘플은 등급별 에탄올 탈수(70%, 80%, 95%, 100%, 각각 1시간 동안 진행됨)를 받았습니다. 적절한 탈수는 부드러움이나 변형 없이 균일하게 흰색으로 보이는 것으로 나타났다. 파라핀 내재 조직 블록은 고정밀 텅스텐-카바이드 블레이드(Type H31)가 장착된 회전식 미세분기체를 사용해 두께 4μm 크기로 절획되었습니다. 주름을 제거하기 위해 0.5% 젤라틴 용액이 포함된 40°C 수조에 절편을 띄운 후 현미경 슬라이드에 장착했습니다. 모든 절편은 형태가 온전하고, 가장자리가 매끄럽으며, 광미경 검사에서 균일한 반투명도를 보여 최적의 절면 품질을 확인했습니다. H&E 염색이 이루어졌고, 이어서 수용성 매체28로 마운팅했습니다. 염색 후 핵은 파란색으로, 세포질은 분홍색으로 변했으며, 현미경으로 현미경으로 관찰하면 세포 구조가 명확하게 드러났습니다. 조직형태학적 분석은 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 각 H&E 염색 단면마다 200배 배율로 세 개의 무작위 필드가 선택되었습니다. 소프트웨어는 관심 영역을 수동으로 구분한 후 단위면적당 핵화된 세포 수를 자동으로 정량화했으며, 결과는 평균 ± 표준편차(x̄ ± s)로 표현되었습니다.

서부 블롯
흉선 조직(50± 2 mg/샘플)은 1개의 프로테아제 억제제 혼합액을 포함한 얼음 냉각 RIPA 버퍼에서 100 mg 조직당 1mL 완충제의 정확한 비율로 동질화되었으며, RNase 무 연약이 장착된 모터 구동 펠릿 공약 균질기를 사용했습니다. 동질화는 얼음에서 15번의 펄스(1초 펄스/2초 정지)로 수행된 후 얼음에서 30분간 배양하고 10분마다 소용돌이가 발생했습니다. 동질액은 12,000 x g 에서 4°C에서 20분간 원심분리되었고, 생성된 상원액을 단백질 정량화를 위해 수집되었습니다. 상청액은 투명하고 투명했으며, 침전물이나 지질층이 없었다. 단백질 농도는 표준 곡선 범위 0-2000 μg/mL의 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였습니다. 서부 블롯을 수행하여 흉선 조직에서 AKT1, JAK2, EGFR의 발현 수준을 평가했으며, 내부 대조군으로 GAPDH를 사용하였습니다. 전기영동 및 막 전달 후 단백질 마커(10-200 kDa)는 명확한 밴드를 보였고, 표적 밴드는 예상 분자량(AKT1: 60 kDa, JAK2: 130 kDa, EGFR: 170 kDa, GAPDH: 37 kDa)과 일치했다.

서부 블롯 밴드에 대한 덴시토메트릭 분석은 소프트웨어를 사용해 수행되었습니다. 분석 전에 띠를 육안으로 검사하여 번짐이나 확산이 없음을 확인하였습니다. 분석 절차에는 다음과 같은 내용이 포함되었습니다: 이미지 가져오기 후 목표 밴드 영역을 수동으로 선택하고, 소프트웨어가 자동으로 엣지 검출을 수행한 후, 밴드 인접 영역을 이용한 로컬 배경 감산을 통해 회색값을 보정하는 작업이 포함됩니다. 그 후 상대적 정량화를 위해 표적 단백질과 내부 대조군 간의 회색값 비율을 계산했습니다. 사용된 정규화 공식은 다음과 같다:

표적 단백질의 상대적 발현 = (표적 밴드 −국소 배경의 회색값) / (내부 대조군의 회색값 −국소 배경)

면역조직화학
대퇴골 절편에 면역조직화학 염색이 시행되었습니다. 슬라이스는 0.1% Triton X-100으로 10분간 투과화한 후 30분간 블로킹을 했습니다. 1차 항체는 4°C에서 하룻밤 배큐했고, 2차 항체는 상온에서 1시간 배양하였습니다. 염색 후 광각 현미경 하에서 배경이 낮고 비특이적 염색이 없는 뚜렷한 양성 신호가 관찰되었습니다. 슬라이드는 DAPI가 포함된 페이드 방지 매체를 사용해 핵을 파란색으로 염색했습니다. 이후 CD34+, TPO, EPO, GM-CSF의 발현을 평가하였습니다. 면역조직화학 영상은 디지털 병리 소프트웨어(버전 2.1.0)를 사용해 분석하였습니다. 분석 전에는 과노출이나 신호 저하가 없는 이미지가 검증되었습니다. 분석 절차32에는 다음이 포함되었습니다:

모델 선택: 사전 학습된 골수 분할 모델(U-Net 기반)을 사용하여 조직 영역을 자동으로 식별하였다33.
임계값 설정: 음성 대조군을 기준으로 양성 신호 임계값을 정의하였다. 배경 평균보다 3표준편차나 높은 염색 강도를 가진 영역은 양성으로 분류되었습니다.
ROI 정의: 소프트웨어는 각 필드를 500개 × 500 μm 격자 영역으로 자동으로 나누고, 단위 면적당 양수 셀 수(양의 셀 수/필드 면적)를 계산했습니다.
데이터 내보내기: 양성 세포 밀도에 대한 통계 보고서가 자동으로 생성되었습니다.

통계 분석
통계 분석은 SPSS 소프트웨어(버전 22.0)를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 x̄ ± s로 표현되었습니다. 집단 간 비교 이전에 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 사용해 평가했으며, 분산의 균일성은 Levene 검정으로 평가하였습니다. 정규 분포(p > 0.05)와 분산 동질성(p > 0.05)이 모두 확인된 경우, 그룹 비교에 일원 ANOVA가 사용되었습니다. 사후 다중 비교는 최소 유의차이(LSD) 방법을 사용하여 수행되었으며; 제1형 오차를 통제하기 위해 모든 사후 P-값을 본페로니 보정법으로 조정했으며, 조정된 p < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.

데이터가 정규성 또는 분산의 균일성 가정(두 검정에서 p ≤0.05)을 충족하지 못할 경우, Kruskal-Wallis 검정을 적용한 뒤, Bonferroni 보정을 적용한 사후 분석용 던스 검정이 적용되었습니다. 모든 통계 그래프와 시각화는 GraphPad Prism(버전 9.0)을 사용해 생성되었습니다. 유의수준은 α = 0.05로 설정되었습니다. 보고된 모든 p값은 조정된 값입니다. 이상치는 그럽스 검정(α = 0.05)을 사용해 식별되었으며, 실험 오류에 명백히 기인한 경우에만 제외되었습니다. 나머지 모든 데이터는 최종 분석에 포함되었습니다. 결과는 x̄ ± s로 제시됩니다.

네트워크 약리학 방법론
이 연구는 JPSXD가 화학요법으로 인한 골수억제를 완화하는 잠재적 메커니즘을 탐구하기 위해 네트워크 약리학 접근법을 사용하였습니다. 첫째, JPSXD의 화학 성분과 해당 표적을 전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)에서 추출하였습니다. 선별 기준은 다음과 같이 설정되었습니다: 경구 생체이용률(OB) ≥30%, 약물 유사성(DL) ≥0.18. TCMSP 데이터베이스에 포함되지 않은 화합물의 경우 SwissTargetPrediction 플랫폼(https://www.swisstargetprediction.ch/)을 사용하여 표적 예측이 수행되었습니다.

선택된 화합물이 JPSXD의 주요 생리활성 성분을 포함하도록 하기 위해, 중화인민공화국 약전(Pharmacopeeia)34를 참고하였습니다. 구체적으로, 각 허브의 식별 및 분석 섹션을 검토하여 진세노사이드, 아스트라갈로사이드 IV, 이카린, 살비아놀산 등 마커 화합물을 확인했습니다. 이 화합물들은 일반적으로 품질 관리 마커35로 사용되며, 정의된 화학 구조와 정량적 요구사항을 가지고 있습니다. 정확성을 위해 약전의 일반 공지 및 부록을 교차 참조하여 명명 규칙과 분석 방법(예: 고성능 액체 크로마토그래피, HPLC)을 확인하였습니다. 분석 결과, 선별 기준(OB ≥30%, DL ≥0.18)이 진세노사이드 Rg1과 Rb1(산삼 유래), 황골로사이드 IV(암골루스 멤브라나세우스), 이카린(에피미디 브레비코르눔)과 같은 주요 약사 성분을 포함해 공식36의 핵심 성분을 효과적으로 포착함이 확인되었으며, 선택된 화합물들이 JPSXD의 기 및 혈액 강화에 책임이 있는 주요 활성 성분을 대표하고 있음을 나타냅니다 효과.

이후 골수억제와 관련된 유전자 표적을 GeneCards 데이터베이스에서 검색하여 결과를 스프레드시트에 다운로드했습니다(https://www.genecards.org/). 관련성 점수 ≥44를 가진 유전자가 추가 분석을 위해 선정되었습니다. 약물 표적과 질병 관련 유전자의 교차는 벤 다이어그램을 사용해 시각화되었고, 겹치는 유전자들은 STRING 데이터베이스에 가져왔다(https://string-db.org/). 유기체는 인간으로 설정되었고, 상호작용 출처는 실험과 데이터베이스로 제한되었고, 최소 요구 상호작용 점수는 0.7> 있었다. 생성된 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크는 위상학적 특성을 분석하여 핵심 표적을 식별하고 Cytoscape 3.10.2를 사용해 시각화하였습니다.

식별된 핵심 목표를 바탕으로 DAVID 데이터베이스(https://david.ncifcrf.gov/)를 사용하여 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 풍부화 분석이 수행되었습니다. 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: 카운트 ≥5, EASE 점수 ≥0.05, p-값 < 0.01. 농축 결과는 Microbiological Letter 플랫폼(http://www.bioinfo-cloud.org/)을 통해 시각화되었습니다. 경로 분석을 통해 주요 신호 전달 경로와 조절 마커가 명확히 밝혀져 JPSXD가 화학요법으로 인한 골수 억제를 완화하는 잠재적 메커니즘을 밝혀냈습니다.

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결과

네트워크 약리학 분석
활성 화합물 및 표적 식별
우리는 먼저 JPSXD에서 각 허브의 주요 표지 화합물을 문헌을 바탕으로 식별하여포괄적선정을 보장했습니다. 구체적으로, 관련 허브(예: Panax 인삼, Astragalus membranaceus, Angelica sinensis)에 대한 약사 항목을 참고하여 공식에 포함된 15가지 허브 성분 모두에 대한 공식 마커 성분 목록을 작성했습니다. 여기에는 인 삼에서 유래한 진세노사이드 Rg1, Re, Rb1이 포함됩니다; 아스트라갈로사이드 IV( 아스트라가루스에서 유래); 이카린( 에피미디엄에서 유래); 살비아놀산 B( 살비아 밀티오리자에서 유래); 카탈폴( Rehmannia glutinosa에서 유래); 리구스티라이드(

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토론

전 세계적으로 암 발생률이 증가하는 가운데, 의료계는 암 치료 자체뿐만 아니라 특히 골수 억제가 흔하고 심각한 부작용인 부작용 관리라는 두 가지 도전에 직면해 있습니다43. 본 연구는 네트워크 약리학과 동물 실험을 결합하여 쥐에서 CTX로 인한 골수억제 완화에 있어 JPSXD의 역할과 잠재적 기전을 체계적으로 조사하였습니다. 결과는 JPSXD가 다중 표적, 다중 경로 조절 기전을 통해 골수억제 증상을 개선할 수 있음을 시사하며, TCM이 다중 성분과 표적을 활용하는 독특한 장점을 강조합니다.

네트워크 약리학 분석 결과, JPSXD에서 kaempferol, Gomisin B, Licoagrocarpin, Licoagroisoflavone 등 주요 화합물이 확인되었습니다. 이 화합물들은 항염증, 항산화, 조혈 등 다양한 약리학적 활성을 이...

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공개 사항

저자들은 이해 상충이 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 후난성 전통중의학관리청의 자금 지원을 받은 '통합 서양전통 중의학 집중-DCA 모드 개입 프로젝트(프로젝트 번호 A2023053)의 재정 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% 파라포름알데히드 (PFA)시그마-올드리치P6148
AKT (팬) 래빗 mAb세포 신호 전달 기술#4691
자동 마이크로플레이트 와셔바이오텍 (애질런트)ELx405
BC-2800vet 자동 혈액학 분석기마인드레이BC-2800vet
크라이오스타트 미세토름써모피셔 사이언티브크라이오스타 NX50
사이클로포스파마이드 주입백스터 종양학 GmbH해당 없음 (배치: HJ20160467)
E100 현미경니콘E100
EGFR 항체 (A-10)산타크루즈 바이오테크놀로지SC-373746
임베딩 머신라이카EG1150
EPO(마우스) ELISA 키트R& D 시스템즈MEP00B
GAPDH 토끼 다클론 항체단백질 기술10494-1-AP
GM-CSF(마우스) ELISA 키트R& D 시스템즈MMC00B
염소 항토끼 IgG HRP 결합잭슨 면역연구소111-035-003
H& E 스테인 키트시그마-올드리치HT10
고속 냉장 원심분리기써모피셔 사이언티브소르발 ST 16R
고처리량 조직 분쇄기서비스바이오KZ-II
면역조직화학 펜벡터 연구소H-4000
JAK2 토끼 mAb앱캠AB108596
건피성설 약(JPSXD)후난성 암 병원 약국맞춤형 조형
마이크로플레이트 리더바이오텍 (애질런트)시너지 H1
생리식염수백스터2B1324X
회전 미세토름라이카RM2016
조직 프로세서라이카ASP300S
TPO (마우스) ELISA 키트R& D 시스템즈MTP00B
보텍스 믹서서비스바이오MX-F

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