방법 논문

표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G+ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

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DOI:

10.3791/69545

⸱

2026년 3월 13일

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 기저 배반의 소추모 및 융모막에서 1차 HLA-G+ 외 영양층(EVT)의 정제, 특성 분석 및 배양을 가능하게 합니다. 1차 EVT 배양은 96시간 동안 생존 가능성을 유지하여, 샘플이 일치한 모체 면역세포와의 공동 배양과 이들의 상호작용에 대한 유동 세포 및 분자 분석을 가능하게 합니다.

초록

인간 모체-태아 인터페이스는 모체 면역 세포와 태아 외 영양소세포(EVT)가 직접 세포 접촉하여 면역 관용을 확립하고 유지하는 독특한 면역학적 환경을 나타냅니다. EVT는 HLA-G, PD-L1, PD-L2 등 내성 분자의 발현으로 특징지어지는 독특한 면역표현형을 보이며, 이들은 모체 면역 반응 조절에 중요한 역할을 합니다. 또한 인간 EVT는 HLA-C를 발현하며, 이는 모체 NK와 T 세포가 직접 인식하고 활성화를 촉진합니다. 중요한 점은, 연구에 사용되는 동물 모델에서는 HLA-C 또는 HLA-G의 정형상체가 존재하지 않으며, 쥐 영양상층은 MHC 발현이 없다는 것입니다. 따라서 생리적·병리학적 조건 모두에서 태반 조직에서 인간 EVT의 표현형 및 기능적 특성을 조사하는 것은 임신 유지 기전과 자간전증, 조산, 태아 성장 제한, 태반 부착과 관련된 태반 염증의 병태생리를 밝히는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 건강한 만기 태반 조직뿐만 아니라 조산과 자간전증 이후의 원발성 인간 EVT를 분리하고 특성화하는 포괄적인 방법론을 제시합니다. 이 과정에는 (1) 태반 및 융모막 조직의 해리; (2) 효소 소화 및 단세포 현탁액 제제; (3) FACS 정렬에 의한 EVT 정제; (4) 고차원 유세포분석을 통한 표현형 특성 분석; 그리고 (5) 최대 96시간까지 모체 면역 세포와 단기 시험관 내 배양 및 공동 배양. 면역학적 기능 분석, 단백질 및 유전자 발현 분석과 같은 후속 응용에 적합한 고순수하고 실용적인 EVT를 얻는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜의 구현은 EVT 및 모체 면역 세포 상호작용과 그것이 건강한 임신과 복잡한 임신 모두에서 미치는 영향에 대한 이해를 증진할 수 있는 견고하고 재현 가능한 플랫폼을 가능하게 합니다.

서론

인간 태반에는 영양모세포 줄기세포, 융모영양세포, 융모성 세포영양구세포, 융모 영양소세포(EVT)의 네 가지 주요 범주가 있으며, 각각은 고유한 기능과 표현형 특성을 가지고 있습니다. 그중 EVT는 HLA-G, PD-L1, PD-L2, B7 계열 구성원과 같은 면역억제 분자의 높은 발현과 다형성인 HLA-C 1,2,3,4,5,6 등 독특한 면역학적 특징을 보입니다. EVT는 모체 12류 조직, 나선동맥, 근단까지 깊숙이 침투하여 모체 면역세포와 직접 접촉하게 합니다7. EVT는 임신 중 면역 관용 유지를 위해 조절해야 하는 모체 T 및 NK 세포와의 상호작용을 조절하는 주요 매개체인 다형성 HLA-C의 두드러진 발현이 특징입니다. EVT가 발현하는 유일한 고전적 MHC 분자인 HLA-C는 또한 모체 기억 T 세포에 항원 제시를 가능하게 하고 면역 보호를 지원합니다8. 그러나 여러 연구에서 EVT는 CD8 T 세포와 NK 세포의 조절 CD4 T 세포와 관류 상태를 직접적으로 증가시켜 세포독성과 면역 거부로부터 자신을 보호한다는 것을 보여주었습니다 9,10,11,12,13. 또한, 일부 연구에서는 자간전증, 조산, 유산 후 얻은 태반의 면역 세포 및 EVT에서 건강한 대조군과 비교해 면역학적 변화가 보고되었습니다 14,15,16,17,18,19,20,21. 이러한 면역학적 변화의 근본 원인은 다음과 같습니다. 예를 들어, i) 기존의 모체 T 세포 이상; ii) EVT의 면역억제 기능 저하; 또는 iii) 두 세포 유형 간의 상호작용이 교란된다. 근본적인 메커니즘 동인을 명확히 하기 위해, 모체 면역 세포와 EVT 상호작용을 평가할 수 있는 체외 실험 모델링 시스템이 필수적입니다.

여기서 제시된 방법과 접근법은 고전적 영양층 계통, 영양층 줄기세포 모델, 또는 오르가노이드를 사용하는 기존 방법들에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 점은, 고전적인 영양층 세포주와 영양층 줄기세포 모델이 1차 EVT의 필수 특징, 즉 MHC 발현 프로필 3,5,22,23을 재현하지 못한다는 것입니다. 둘째, 인간 영양층 줄기세포(hTSC)와 여러 분자 억제제를 포함한 오가노이드 배양물의 복잡한 배양 요구량이 면역 세포 기능과 표현형에 직접적인 영향을 미쳐 EVT와 면역 세포 상호작용의 적절한 평가를 방해합니다 22,24,25,26,27. 마지막으로, 분화 후 hTSC 배양의 세포 다양성과 태반 오가노이드 구조의 내향 구조 특성은 생체 내 관련성이 없는 영양층 유형과의 면역 상호작용을 가능하게 하여 연구의 명확성을 떨어뜨린다22,27.

여기서는 인간 임기 태반 조직에서 1차 HLA-G+ EVT를 정제하는 방법을 설명하여, 면역 세포 집단의 존재 여부와 관계없이 최대 96시간간 배양할 수 있게 합니다. 이 배지는 EVT와 면역 세포 기능에 영향을 주면서도 생존력을 유지하는 분자 억제제가 없습니다. 이 접근법은 건강한 임신과 복잡한 임신에서 EVT와 면역 세포 상호작용에 대한 직접 체외 연구를 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다. 이는 모체-태아 면역 관용의 핵심 동인을 발견하고 태반 염증 해결을 위한 치료 표적을 규명하는 데 기여할 것으로 기대됩니다.

프로토콜

신시내티 어린이병원의 기관심사위원회는 이 연구 프로토콜(승인번호 #2021-0336)을 승인했으며, 이는 미국 법률에 따른 생명윤리적 고려사항, 개인정보 처리, 감염성 병원체 및 사전 동의 절차 요건을 충족합니다. 각 실험실은 실험을 시작하기 전에 국가 연구 지침을 준수하는 승인을 받아야 합니다.

이 프로토콜은 이전 프로토콜 2,28을 개선하여 2차 기능 분석에서 최대 96시간까지 생존 가능성을 유지하는 1차 HLA-G+ EVT를 배양하는 데 중점을 둡니다. HLA-G+ EVT 유사 세포주 확립에 대해서는 Hamilton 등2를, 일치하는 모체 십수 림프구 관련 연구는 Ikumi 등28을 참고하라.

1. 실험실 설치 (0일차).

참고: 샘플 취급에는 클래스 II 생물안전성(BSL2) 캐비닛을 사용하세요.

  1. 39°C와 37°C의 물탕 두 개를 설치하세요. 37°C에 가습된CO2 인큐베이터를 설치하세요.
  2. PBS 1개, 세척 배양 A, 세척 배양 B, EVT 배양 배양 배양 A, B, C (표 1 및 표 2)를 준비합니다.
  3. 10 mg/mL DNase I 용액 15 mL(표 1)와 0.25% 트립신/EDTA 500 mL를 37 °C 물욕에서 해동합니다.
  4. 액체 폐기물 수집을 위해 BSL2 캐비닛에 살균/살균 용액(예: 표백제 10%)을 담은 용기를 넣으세요. BSL2 캐비닛에 생물학적 위험 가방이 있는 폐기물 용기를 설치하세요.
  5. 흡수 패드, 멸균 해부 도구(곡선 핀셋과 6 1/2인치 가위), 멸균 금속 필터, 튜브 랙, 멸균 50mL 원뿔 튜브를 BSL2 캐비닛에 준비하세요.
  6. 50mL 원뿔형 튜브 3개(각각 1x PBS 포함 2개, 세척 미디엄 A 1개)를 준비하여 해리 중 태반 조직 조각을 채취합니다.

2. 샘플 채취 (0일차)

참고: 임신 24주에서 42주 사이에 제왕절개를 통해 얻은 막이 있는 인간 태반을 사용하세요. 태반을 질식으로 분만하면 EVT가 적을 수 있습니다.

  1. 태반을 즉시 BSL2 캐비닛에서 처리하기 시작하는데, 이상적으로는 출산 후 1-2시간 이내에 가능하며, 이를 통해 생존 가능한 세포의 생산량을 극대화하세요. 태반은 항상 실온에 유지하세요.
  2. 태반을 검사하고 필요하다면 크기, 무게, 대략적인 형태 외관을 기록하세요.

3. 조직 박리 (0일차)

  1. 막 해리
    1. 태반을 태아 쪽을 향하게 하여 위로 놓으세요(탯줄 삽입 부위가 보입니다). 양막을 제거하려면 측면 막에서 탯줄 삽입 부위 쪽으로 손으로 벗겨내어 제거합니다; 양막을 잘라서 버려.
    2. 맥락막을 태반 밑부분에서 위쪽으로 2인치 정도 줄여 자르고, 막 띠는 태반에 붙인 채로 두세요.
    3. 맥락막 막 스트립을 두 손가락에 끼우고 십지류 면이 위를 향한 방향으로 두고, 멸균 굽은 팁 겸자로 모체막 부위를 부드럽게 긁어내세요.
      참고: 효율적으로 작업하고 융모막이 마르지 않도록 하세요.
    4. 융모막을 50mL 원뿔형 튜브에 20mL 세척 미디엄 A를 채취합니다.
    5. 50mL 원뿔형 튜브에서 20mL PBS와 함께 120ml의 십엽 림프구 분리를 위해 두엽 십박 세포를 채취하고, Ikumi 등이 설명한 림프구 분리 프로토콜을 따르세요.28.
    6. 50 mL 튜브 안에서 융모막을 가위로 잘라 < 2 mm2 크기의 작은 조각으로 만듭니다.
      참고: 절단 후 침전된 막의 총 양은 이상적으로 30mL입니다.
    7. 워시 미디엄 A를 버리고 상상액이 맑아질 때까지 PBS로 여러 번 세척합니다.
  2. 태반 박리
    1. 태반을 산모 쪽을 향하게 놓고 혈전을 제거하세요. 죽음, 석회화, 허혈 부위를 피하고 무균 가위로 태반 기저판 조각(길이 2cm, 너비 2cm, 깊이 0.5cm)을 절단하세요.
    2. 배모(태아 쪽)를 위로 향하는 손가락 위에 디세두아 베이스살리스 조각을 올려놓습니다. 가위로 디클리두아 기저부에서 융모를 조심스럽게 제거하여 2-3mm 두께의 막을 얻고, 디시두아 기저부에는 얇은 융모층만 남습니다.
    3. 20mL PBS가 포함된 50mL 원뿔관에 기저 치부제거 조직을 채취합니다. 데시두아 베이스살리스를 <2 mm2 크기의 작은 조각이 될 때까지 잘라내세요.
      참고: 절단 후 침전된 조직의 총량은 이상적으로 15mL입니다.
    4. PBS를 버리고 세수령 기저물을 PBS로 여러 번 세척하여 상정액이 피가 보이지 않는 투명해질 때까지 유지합니다.
    5. 조직 현탁액 15mL를 두 개의 50mL 원뿔 튜브(각 튜브에 7.5mL)로 나누었습니다.
      참고: 기저 흉부에서 림프구 분리 프로토콜은 이 프로토콜과 구별됩니다. Hamilton 등에서 제공된 프로토콜을 참고하세요.

4. 조직 소화 (0일차)

  1. 3구역에서 융모막과 기저 십총을 마지막으로 세척한 후, 모든 튜브에 1x PBS를 채우고 200× g 에서 1분간 원심분리한 후 상원액을 부어냅니다.
  2. 조직 소화 효소 칵테일을 준비하세요 (표 1). 따뜻한 조직 소화 효소 칵테일 150mL를 300mL 유리병에 넣고, 그 다음 30mL의 융모막을 병에 넣습니다.
  3. 따뜻한 DMEM/F20 20ml와 따뜻한 조직 소화 효소 칵테일 80mL를 300mL 유리병 두 개에 넣고, 각 병에 7.5mL의 데시두아 베이스살리스를 추가하세요.
  4. 융모막이 든 병은 39°C 물조에서, 두 병은 37°C 물조에서 배양하세요. 15분 동안 모든 병을 3-4분마다 흔들어 주세요(첫 소화 단계).
  5. 소화 후에는 금속 체(메쉬 크기 40)로 소화된 조직을 걸러냅니다. 조직에 세척용 미디엄 B를 넣어 헹구고 젤라틴 같은 물질을 녹여줍니다.
  6. 세포 현탁액을 100μm 필터를 통해 조직 유형과 소화 수치가 표시된 50mL 튜브로 여과합니다.
  7. 두 번째 소화를 진행하려면 소화되지 않은 조직을 300mL 배양지로 다시 옮기고, 4.2단계에서 설명한 조직소화 효소 칵테일을 추가한 후 4.2-4.6단계를 반복합니다.
    참고: 모든 기저 흉부 조직은 300 mL 병 하나에 이식됩니다. 첫 번째 소화 후 얻은 세포와 두 번째 소화 후 얻은 세포를 분리해 두세요.
  8. 세포 현탁액을 650 × g 에서 8분간 돌린 후 상정액을 버립니다.
  9. 같은 조직 유형과 소화 수를 가진 펠릿을 한 튜브에 합치되(첫 번째와 두 번째 소화는 분리) 워시 미디엄 B를 최대 25mL까지 채우세요.

5. 피콜 밀도 구배 (0일차)

  1. 조직 유형과 소화 번호가 표시된 50 mL 원뿔형 튜브 4개를 준비합니다. 튜브에 12mL의 피콜을 부으세요.
  2. 셀 서스펜션을 조심스럽게 Ficoll에 장착하세요. 800 × g 에서 20분(실온) 동안 브레이크 없이 원심분리합니다.
  3. 원심분리 후 섬유-배지 경계면의 세포층을 조직 유형과 소화 수가 표시된 깨끗한 50 mL 원뿔 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
    참고: 멸균 전이피펫을 사용해 인터페이스를 손상시키지 않고 층을 조심스럽게 수집하세요.
  4. 튜브에 워시 미디엄 B를 채우고 650 × g에서 원심분리기를 8분간 하세요.
  5. 상청액을 버리고 남은 배지(약 0.5mL)와 함께 세포 펠릿을 재현탁합니다. 필요하다면 세포 현탁액의 약 10%를 표현형 분석용으로 분리하고, 90%를 세포 분류에 사용하세요. 세포 수를 세어 세포 수와 생존 가능성을 판단하세요.

6. EVT 분류 (0일차)

  1. 재현탁된 세포 펠릿을 조직 유형과 소화 번호가 표시된 멸균 FACS 튜브에 넣습니다. 항-CD45-BV785(1:100), 항 HLA-G-APC(1:125), 항-EGFR1-BV711(1:160)(표 3)을 추가하라. 튜브를 실온에서 어두운 환경에서 20분간 부화시키세요.
  2. 워시 미디엄 B 1mL를 넣고 650 × g 에서 원심분리해 8분간 가열하세요.
  3. 상원액을 버리고 세포 펠릿을 세척 배지 B로 재현탁하여 약 1×10개의 6 세포 / mL 세포 현탁액을 만듭니다.
  4. 세포 분류 직전에 40 μm 세포 체감을 통해 세포를 여과하고, 그림 1A에 설명된 게이팅 전략에 따라 CD45-HLA-G+EGFR+ EVT를 1 mL의 EVT 배양 배양 A가 포함된 튜브에 분류합니다.
    참고: 최적의 영양층 생존 가능성을 위해서는 100 μm 노즐과 함께 제트 인 에어 셀 분류기(예: Bigfoot 또는 MoFlo)를 사용해야 합니다. 유체공학 기반 분류기(예: DB S6 또는 Sony Nano)는 영양층 생존력을 감소시킬 수 있으며, 자기세포 분류 전략(예: Easysep이나 MACS)은 생존 가능성을 유지하지만 순도가 낮아 배양 내 기공 세포 과증식을 초래할 수 있습니다.
  5. 분리된 세포로 FACS 튜브를 원심분리하고, 상청액을 버린 후 세포 펠릿을 EVT 배양 배양 배양 B로 재현탁합니다.
    참고: 다음 섹션에서 세포를 분류하는 동안 배양판을 준비하세요.

7. 2차 분석(0일차 - 1일차)을 위한 1차 HLA-G+ EVT 배양

  1. 평평한 바닥 96웰 배양판의 웰에 50 μL 20 μg/mL 피브로넥틴(표 2)을 실온에서 45분간 코팅합니다.
  2. 피브로넥틴을 제거하고 EVT 배양 배양지 B와 함께 웰에 세포 현탁액을 추가하세요. 매개체/웰 200 μL당 0.5 × 10개의5 기저 EVT 셀, 200 μL 매개체/웰 10개당 1.0 개의5 맥모 EVT 셀 1.×0개를 목표로 하세요. 세포 배양 플레이트를 가습CO2 인큐베이터에서 37°C(0일차 배양)에서 12-18시간 배큐합니다.
  3. 1일째에는 배지 B를 제거하고, 세포를 1배 PBS로 부드럽게 세척한 후, T 세포 유무에 관계없이 EVT 배양 배양 C를 추가하여 추가 (공동 배양) 배양을 진행합니다(8절 참조).

8. 활성화된 T 세포와 1차 HLA-G+ EVT의 공동 배양 (0일 - 4일)

  1. 3인 기증자의 CD8+T 세포 자극 (0-1일차)
    1. HLA-G+ EVT 분류(0일차) 동안, 표가 쌍을 이룬 모체혈이나 관련 없는 혈액 기증자로부터 말초혈 면역 세포 집단을 분리하며, 이는 참고된 인간 CD8+ T 세포 풍부화 칵테일( 재료표 참조)과 이어서 Ficoll 밀도 구배 원심분리(FACS 정렬)를 사용합니다.
    2. 림프구 세포 배양 배지에서 원하는 대로 항 CD3/28 구슬 또는 사이토카인(예: IL2, IL15, IL12, IL18)으로 T 또는 NK 세포를 사전 자극합니다.
  2. 활성화된 T 세포와 함께 공동 배양 EVT (1-4일차)
    1. 림프구 수를 세고 0.5 × 106 / mL 농도로 림프구 세포 배양 배지를 사용해 세포 현탁액을 만듭니다. 1차 EVT 웰에 1× 10개의5 개 림프구를 추가합니다(EVT 배양지 C의 부피 : 림프구 세포 배양 배지 = 1:1). 플레이트를 37°C의 가습CO2 인큐베이터에서 24-72시간 부양합니다.
    2. 유동 세포검사 분석을 위해 림프구를 채취하고, 세포카인 분석을 위해 상청액을 수집합니다.
    3. 트립신화를 이용해 EVT를 채취하고, 4일째에 유세포분석(9절 참조)을 위해 FACS 튜브에 EVT를 수집합니다.

9. 1차 HLA-G+ EVT의 표현형 분석

참고: 즉시 유세포 염색을 진행하시고, EVT와 필요한 모든 용액은 항상 실온에 보관하세요.

  1. FACS 튜브를 1차 EVT로 650 × g 에서 7분간 원심분리한 후 상상액을 버립니다.
  2. 카스파제 3/7 염색액(표 3)을 셀 펠릿에 넣고 부드럽게 섞으세요.
  3. 항체로 세포를 염색하고(표 3), 부드럽게 섞은 후 추가로 20분간 배양합니다(총 30분 배양).
  4. EVT 배양 배지 C 1mL를 추가하고, 650 × g 에서 튜브를 원심분리해 7분간 보관한 후 상원액을 버립니다.
  5. 세포 펠릿을 0.4mL 세포 EVT 배양 배양 C로 재현탁합니다. 7-AAD 염색액(5 μL/세포 현탁액)을 튜브에 첨가하고 즉시 유식세포계에서 분석합니다.

결과

기대 셀 수율

15 mL의 디시두아 기저 세포에서 기대되는 HLA-G+ EVT는 첫 번째 소화에서 0.1-0.3 × 106 세포, 두 번째 소화에서 0.1-0.6 × 106 세포를 생성한다(총 0.2-0.8 × 106 세포). 30mL의 융모막에서 예상되는 HLA-G+ EVT 수확량은 첫 번째 소화에서 10개의6 세포× 0.4-1.0, 두 번째 소화에서는 0.4-1.5 × 106 세포로 총 0.8-2.5 × 6개의 세포입니다. 분리 내 카스파제 3/7-7-AAD-생 EVT의 비율은 90-95%로 예상됩니다.

1차 HLA-G+ EVT 배양

계통 마커(HLA-G, HLA-C, EGFR)와 세포 사멸 마커의 유동 세포분석 결과, 이 프로토콜이 4일차(분류된 EVT 플레이트 후 96시간)까지 유효한 1차 EVT 배양을 제공함이 확인되었습니다(그림 1B-D). 1차 융모세포 및 기저 굴절성 HDA-G+ EVT의 대표적인 광학 현미경 이미지는 배양 후 24, 48, 72시간 후에 보여줍니다(그림 2A-F).

1차 HLA-G+ EVT와 T 세포의 공동 배양

이 프로토콜은 태반에서 분리된 후 96시간 후 1차 EVT의 생존 가능성을 높였으며, 이는 이전 보고서 1,2,10과 비교해 개선된 수치입니다. 따라서 이는 산모-태아 경계부의 급성 염증을 모방하는 사전 자극 림프구와의 동배양 후 EVT 반응 분석을 가능하게 합니다. EVT는 세포외 유세포 염색을 통해 결정된 다형성 HLA-C 및 면역억제 공동억제 분자인 PD-L1, PD-L2, PVR(CD155로도 알려짐), B7H3, HLA-E를 발현합니다(그림 3A,B). EVT는 HLA-C뿐만 아니라 PD-L1, PD-L2, HLA-E의 발현을 증가시켰으나, 프로토콜 8절에 따르면 활성화된 림프구와 72시간 동안 공동 배양했을 때 PVR과 B7H3의 발현은 증가하지 않았습니다(그림 4A,B). 또한, 7AAD와 카스파제 3/7 염색(그림 4C,D)에서 EVT 사망 증가가 관찰되지 않았습니다.

그림 1
그림 1. 배양된 EVT 후 유세포분석의 게이팅 전략과 유세포분석 플롯. (A) 기저 십자(decidua basalis EVT)와 융모 EVT를 분류하는 대표적 게이팅 전략. R1은 전방향 산란 그래프의 라이브 셀 게이트입니다. R2는 CD45+ 백혈구를 배제하는 게이트입니다. R3는 HLA-G+EGFR+EVT 게이트입니다. R4는 7-AAD-카스파세3/7-라이브 EVT입니다. R4 게이트가 반드시 정렬에 필요한 것은 아니지만, 여기서는 1차 EVT의 실현 가능성을 보여주기 위해 제시합니다. (B) 96시간 체외 배양 후 분류된 HLA-G+EGFR+EVT의 대표적 유세포검사 플롯. (C, D) 카스파제 3/7-7-AAD의 빈도는 분류(0일차)와 배양 96시간(4일차) 동안 생체 EVT에서 발생했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2
그림 2. 시험 관 내 배양 중 EVT의 형태학. (A) 24시간, (B) 48시간, (C) 72시간 배양 후 연골 EVT의 대표 광학 현미경 이미지, (D) 24시간, (E) 48시간, (F) 72시간 배양 후 기저 십추 EVT를 촬영한 것입니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 3
그림 3. 1차 EVT의 면역학적 표현형. (A) 세포외 유세포 염색(0일차)을 통해 1차 EVT에서 HLA와 공억제성 분자의 대표적인 흐름 플롯. (B) 쌍 선 플롯은 0일차에 d. basalis EVT(파란색)와 융모세포 EVT(녹색)의 각 마커의 IgG 조절 MFI와 완전한 염색을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4
그림 4. 활성화된 림프구가 있든 없든 1차 EVT의 면역학적 표현형(4일차). (A) 활성화된 제3자 림프구가 있든 없든 72시간 배양(4일차) 후 EVT의 대표적 흐름 플롯. (B) 쌍 선 그래프에서 활성화된 제3자 림프구가 있든 없든 EVT의 MFI가 나타납니다. 파란색 플롯은 기저 분리 EVT, 초록 플롯은 융모 EVT를 나타냅니다. (C) 4일차에 활성화된 제3자 림프구가 유무에 관계없이 카스파제 3/7-7-AAD-생체 EVT를 대표하는 플로우 셀토메트리 플롯. (D) 쌍 선 플롯은 활성화된 제3자 림프구가 있든 없든 카스파제 3/7-7-AAD- 생 유전적 EVT의 빈도를 보여줍니다. 파란색 플롯은 기저 분리 EVT, 초록 플롯은 융모 EVT를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1. 조직 해부와 소화를 위한 핵심 시약. 1, 2, 24도 참고하세요. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2. EVT 배양 및 T 세포와의 공동 배양을 위한 핵심 시약. 1, 2, 24도 참고하세요. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3. 분류 및 유세포분석 분석을 위한 주요 항체 및 시약. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

프로토콜의 핵심 단계

유효한 EVT를 얻으려면, 분만 직후 태반에서 세포 분리를 시작하고, 분리부터 분류까지 모든 절차를 실온에서 수행하는 것이 중요합니다. EVT는 림프구에 비해 더 크고 더 잘 붙기 때문에, 막힘을 방지하기 위해 다음과 같은 주의사항을 지켜야 합니다: i) 분류 전에 세포 현탁물을 40 μm 세포 체에 통과시키기, ii) 세포 현탁을 위해 DNase가 포함된 배지를 사용하기, iii) 세포 현탁액의 과농축 방지(이상적으로는 10⁶ 세포당 ~1 ~× ), iv) 최소 100 μm 크기의 노즐 사용을 고려할 것. Jet-in-Air 분류기(예: 빅풋, 모플로)는 유체 기반 셀 분류기(예: BD 분류기, 소니 나노)보다 더 높은 유효 EVT 수율을 달성합니다.

메서드의 수정 및 문제 해결

Decidua basalis EVT의 첫 소화 후 과소화 또는 과소화

기저 백두아 조직의 소화 효율은 태반마다 다릅니다. 과소화된 조직은 금속 체를 통과하기 어려운 크고 끈적한 덩어리를 형성합니다. 일반적으로 10-30mL의 세척 미디엄 B를 첨가하면 여과 과정에서 이러한 응집체가 분산되는 데 도움을 줍니다. 이 방법으로 문제가 해결되지 않으면 1-2mL의 DNase를 조직에 직접 첨가하세요. 첫 번째 소화에서 과소화가 발생하면 두 번째 소화를 위해 조직 소화 효소 칵테일 농도를 80%에서 70%로 줄이세요. 첫 번째 소화 후 잔류 조직 부피는 약 절반 이하로 줄여야 합니다. 잔류 조직 부피가 변하지 않는다면, 두 번째 소화를 위해 조직 소화 효소 칵테일 농도를 80%에서 90-100%로 증가시키세요. 융모막 조직은 태반을 통해 일관되게 소화됩니다. 따라서 조직 소화 효소 혼합물의 농도를 조절하는 것은 일반적으로 필요하지 않습니다.

위 프로토콜에서 설명한 것보다 더 큰 조직 부피의 소화를 위해

30mL 이상의 융모막 또는 15mL 이상의 기저 분리 조직 소화를 할 경우, 조직 소화 효소 혼합 병을 추가로 사용하세요. 한 병에 조직 부피를 늘리면 소화 부족이 발생하는 경향이 있습니다.

방법의 한계

질 배출 태반은 EVT 수율이 낮아질 것으로 예상됩니다. EVT는 냉동 보존이 불가능한데, 이는 동결-해동 스트레스에 민감하여 생존 가능성과 기능을 크게 제한하기 때문입니다. 따라서 이 프로토콜에는 어떤 스톱 포인트도 포함되어 있지 않습니다.

기존 방법과 비교한 방법의 중요성

우리는 이전에 조직배양 배지 B와 콜라겐 코팅 플레이트를 사용하여 임기 태반에서 HLA-G+ EVT 유사 세포주를 확립하는 프로토콜을 보고했습니다. 그러나 배지와 콜라겐 내 여러 억제제는 공동 배양 시스템에서 T 세포 기능에 영향을 미칠 가능성이 있습니다2. 조직배양 배지 B를 사용하지 않은 이전 보고서에서는 공동 배양 중인 T 세포 평가는 가능했으나, 세포 변이성 때문에 EVT는 평가할 수 없었다 1,10. 현재 프로토콜의 장점은 배양 배지의 영향을 최소화하면서 생존 가능한 1차 유전적 유전자(EVT) 배양을 가능하게 한다는 점입니다. 이 프로토콜은 EVT의 면역학적 기능과 주변 면역 세포에 대한 반응 변화를 조사할 수 있는 실험적 플랫폼을 제공하며, 이는 지금까지 충분히 연구되지 않은 영역입니다.

공개 사항

이 연구와 관련된 이해 상충은 없습니다.

감사의 글

신시내티 어린이병원 의료센터 류마티스내과 부서의 셰리 손튼과 연구 플로우 사이토메트리 코어에 플로우 사이토메트리 센터가 플로우 사이토메트리와 세포 분류에 도움을 주신 데 대해 감사드립니다; 태반 자료 수집에 기여한 참여 병원의 모든 간호사와 의사에게; 틸버그 연구실 모든 구성원과 CCHMC 면역학 교수진의 유익한 토론; 이 연구는 NIH R01HD116852(T.T.)의 지원을 받았습니다. 신시내티 아동 연구 재단(T.T.); 버로우스 웰컴 펀드 넥스트 젠 임신상 #NGP10115(T.T.); 그리고 March of Dimes 오하이오 협력 보조금(T.T.)을 받았습니다. S.T.는 JSPS KAKENHI 보조금 번호 22KK0287 및 25K12697의 지원을 받고 있습니다.

재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL 원심분리 튜브Thermo Fisher14-955-238
-20 °C 냉동고어느 공급업체
37 °C 5% CO2 인큐베이터어느 공급업체
4 °C 냉장고어느 공급업체
50 mL 원추형 원심분리 튜브Thermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” 가위어느 공급업체
7-AAD 생존성 염색 용액Biolegend420403
-80 °C 냉동고 어느 공급업체
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE 세포 분석기BD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 생물안전 캐비닛어느 공급업체
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
세포 분리 체Millipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
세포 체인저 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
원심분리기어느 공급업체
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
볼록한 끝의 핀셋어느 공급업체
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA 소프트웨어BD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo 소프트웨어FlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB 혈청Corning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
자석 분리기promegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400176
페니실린과 스트렙토마이신 Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X 용액ThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
연구 등급 FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °C어느 공급업체
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543

참고문헌

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