이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 이용해 교모세포종 샘플로부터 충분한 고품질 신생혈관 조직을 성공적으로 준비하여 종양 혈관형성의 정량적 단백질체학 분석을 수행하여, 전통적으로 주로 혈관형성 인자에 초점을 맞춘 연구의 한계를 극복하고 교세포종 혈관신생의 대규모 단백질체학 프로파일을 제공하였습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
교모세포종은 중추신경계의 원발성 악성 종양으로, 발생률과 사망률이 유의미합니다. 종양 혈관형성은 교모세포종 병태생리의 특징이며 종양 환경에서 중요한 사건입니다. 종양 신생혈관화의 이상한 구조는 영양 공급원이자 종양 세포가 혈류로 침범할 수 있게 하는 전이성 관문이라는 두 가지 역할을 합니다. 항혈관신생 치료는 암 분야에서 뜨거운 이슈입니다. 이전 연구의 대부분은 종양 혈관형성의 활성화 인자와 억제 인자에 초점을 맞추었으며; 그러나 이는 종양 혈관신생을 매우 제한적인 범위에서만 명확히 할 수 있습니다. 비정상적인 단백질 발현 또는 번역 후 변형은 교모종 내 혈관의 비정상적인 형태에 기여합니다. 이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부(LCM)를 사용하여 교모세포종 조직에서 적절한 양의 신생혈관 조직을 분리 및 정제했으며, 이는 동위원소 표지된 정량적 단백질체학 분석에 사용되어 교세포종 신혈관 조직에서 대조군과 비교하여 차이가 있는 단백질을 식별하는 데 사용되었습니다. 이 데이터는 종양 혈관형성의 병리학적 기전을 규명하고, 항혈관형성 치료 표적을 발견하며, 종양 혈관형성 기반 바이오마커를 구축하는 데 중요한 과학적 기초를 제공합니다.
서론
교모종은 신경세포에 구조적·대사적 지원을 제공하는 교세포에서 유래하는 매우 이질적인 중추신경계(CNS) 종양으로,조직학적으로 아형으로 분류됩니다: 성상세포종, 희돌기교모종, 그리고 방관막종2. WHO 등급 체계에 따르면, 교모세포종 1등급과 II등급은 저등급 교모종(LGG)으로, 일반적으로 성장 속도가 느리고 장기적으로 안정성이 잠재적이며 해부학적 위치에 따라 수술적 절제가 가능한 경우가 많습니다. 반면, III급과 IV급은 고등급 교모종(HGG)으로, 주로 미분화이며 악성이며 매우 침습적인 행동과 예후가 좋지 않습니다. 현재의 치료법은 여전히 제한적이고 대체로 효과가 없습니다; 최대 안전 절제와 수술 후 방사선 치료/화학요법의 병행은 예후를 중간 정도 개선하지만, 종양의 확산성 침윤성 성장과 명확하지 않은 경계로 인해 근본적 절제를 막는 상당한 한계와 독성이 여전히 존재합니다 4,5. 인간 교모종, 특히 고등급 교모종은 혈관이 매우 많은 악성 종양으로, 성장, 증식 및 침범은 비정상적인 신생혈관화에 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 의약서는 산둥 제1의과대학 의학윤리심사위원회(승인 번호 R202211090133)의 승인을 받았으며, 환자와 환자의 가족으로부터 사전 동의를 받았습니다. 본 연구에 사용된 교모종 샘플은 모두 중앙남부 대학교 시앙야병원 신경외과에서 신경외과 절제된 표본에서 채취했으며, 이 중 7건은 3등급 성상세포종 조직이었습니다. 정상 대조 혈관(n = 3)은 뇌 외상으로 인해 손상된 뇌 조직 내 미세혈관에서 채취한 것입니다. 모든 환자는 수술 전 방사선 치료나 화학요법을 받지 않은 첫 환자였으며, 모두 중남대학 상야병원 병리과에서 진단을 받았습니다. 샹야 병원에서 외부 압력에 의해 손상된 정상 뇌의 매우 미세한 혈관을 신경외과 수술로 제거하여 세 개의 정상 대조 혈관 조직을 얻었습니다(교모세포종 없음). 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. LCM을 이용해 신생혈관 조직을 인간 교모종 조직에서 분리하는 방법
- LCM 슬라이드 준비: 재사용 가능한 금속 슬라이드에 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 멤브레인을 수동으로 코팅하고, 코팅된 슬라이드는 -80°C에 보관합니다.
참고: 미리 코팅된 금속 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
정량적 단백질체학을 위해 충분한 양의 LCM 분리 단백질 샘플이 확보되었습니다
교모세포종 신생혈관 조직에서 차등 발현 단백질의 신뢰할 수 있는 단백질체 프로파일을 얻기 위해, 본 연구는 가장 흔한 교모종 아형인 성상세포종 3등급을 선정하고, 신생혈관이 풍부해진 신혈관의 가용성을 고려하여 LCM을 사용하여 분리한 신생혈관 조직을 선정하였습니다. 더불어, 정량적 단백질체학은 샘플당 ≥ 400 μg 단백질을 필요로 합니다. 본 연구는 LCM 기술을 사용하여 3등급 성상세포종 조직 7건에서 신생혈관 조직을 정밀하게 분리하여 총 8.4mg LCM 분리 신생혈관 조직을 얻었습니다(표 4). 또한, 정상 대조군 미세혈관에서는 뇌 외상으로 인해 손상된 뇌 조직 3건에서 총 27.5mg이 검출되었습니다(표 4).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
LCM과 동위원소 표지 정량 프로테오믹스를 결합하여 교모종 혈관신생의 최초의 대규모 프로테옴 프로파일을 확인했습니다
종양 혈관형성은 교모세포종의 중요한 병리학적 특징으로, 고침습성과 치료 저항성과 밀접하게 연관되어 있습니다 6,7. 기존의 항혈관신생 치료(예: VEGF 억제제)는 표적 단조성과 보상 저항성으로 인해 임상적 효능이 제한적이다 19,20,21,22.종양 혈관신생을 목표로 한 연구는 상당한 과학적 가치를 지니고 있습니다. 종양 혈관신생의 대규모 프로.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
이 연구는 중국자연과학기금(중국자연과학기금81272798 X.Z., 82203592 N.L.), 산둥성 자연과학기금(ZR2022QH112 N.L.), 산둥성 태산 학자 공학 프로젝트 특별기금(번호 20221143 → X.Z.), 중국 국가 고급 외국 전문가 프로그램(H20240743; 외국 전문가: X.Z.), 그리고 산둥 제1의과대학 신흥 전략 분야 과학 연구 육성 프로젝트(202403).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰판 | 서모 피셔 사이언티브 (미국) | 468667 | 소모품 |
| 아세톤 | 난징 시약 (중국) | C0720114023 | 시약 |
| 아세토니트릴 | 머크 (중국) | CN34892 | 시약 |
| BCA 단백질 분석 키트 | 앱캠 (영국) | ab102536 | 시약 |
| 소 혈청 알부민(BSA) 표준 | 솔라비오 (중국) | PC0001-1 | 시약 |
| 원심분리관(50ML) | 키르겐 (중국) | KG2811 | 소모품 |
| 크라이오스타트 미세토름 | 라이카 (독일) | 1900년경 | 장비 |
| 시스테인 | 알라딘 (중국) | C108238 | 시약 |
| DL-디티오트레이톨(DTT) | 암레스코 (미국) | D8220 | 시약 |
| EASY-Spray C18 역상 HPLC 컬럼 | 서모 사이언티픽 (미국) | ES800A | 소모품 |
| 전자 저울 | 사르토리우스 (미국) | BSA224S | 장비 |
| 임베딩 매체 | 라이카 (독일) | 39475237 | 소모품 |
| 엠포레 SPE 카트리지 C18 | 시그마-올드리치 (미국) | 66872-U | 소모품 |
| 에펜도르프 튜브 | 키르겐 (중국) | KG2211 | 소모품 |
| 필터 페이퍼 | 시티바 (미국) | 42학년 | 소모품 |
| 개미산 | 알라딘 (중국) | F112032 | 시약 |
| 유리 비이커 | 슈보 (중국) | 1015479 | 소모품 |
| 유리 눈금식 실린더 | 슈보 (중국) | 1601 | 소모품 |
| 고해상도 액체 크로마토그래피-질량분석법 | 서모 사이언티픽 (미국) | Q-익스액티브 | 장비 |
| 단열 용기 | 페폰 (중국) | LCZYX-12 | 소모품 |
| 역현미경 | 라이카 (독일) | XDS-1 | 장비 |
| 요도아세트아마이드 | 솔라비오 (중국) | I8010 | 시약 |
| 이소프로판올 | 알라딘 (중국) | I112018 | 시약 |
| iTRAQ 시약 | 시그마-올드리치 (미국) | 4381663 | 시약 |
| KCl | 비요타임 (중국) | ST1596 | 시약 |
| KH2PO4 | 상하이 위안예 (중국) | S24278 | 시약 |
| 레이저 캡처 미세 해부 | 라이카 (독일) | LMD 6000 | 장비 |
| 레이저 캡처 미세해부 슬라이드 | 라이카 (독일) | 3800040 | 소모품 |
| 라이카 하이프로필 일회용 블레이드 | 라이카 (독일) | 14035838926 | 소모품 |
| 액체 질소 용기 | 키이크료 (중국) | YDS-3 | 장비 |
| 자기 핫플레이트 교반기 | 상하이 사일(중국) | 연구소-0002-0068-SHSL | 장비 |
| 마이크로플레이트 리더 | TECAN (스위스) | 인인니트 F200 | 장비 |
| PEN 막 | 라이카 (독일) | 11505189 | 소모품 |
| pH 미터 | 사르토리우스 (미국) | PB-10 | 장비 |
| 피펫 | 에펜도르프 (독일) | 3123000268 | 장비 |
| 피펫 | 에펜도르프 (독일) | 3123000241 | 장비 |
| 피펫 | 에펜도르프 (독일) | 3123000225 | 장비 |
| 폴리설포에틸 A | 폴리LC 주식회사 (미국) | 104SE0303 | 소모품 |
| 프로테아제 억제제 | 로슈 (스위스) | 05892791001 | 시약 |
| 냉장 원심분리기 | 벡맨 (미국) | 알레그라TM X-22R | 장비 |
| 냉장고 | 메이링 (중국) | BCD-180KCT | 장비 |
| 도데실 황산나트륨 (SDS) | 암레스코 (미국) | 1027P033 | 시약 |
| 스테인닝 항아 | 비요타임 (중국) | FG005 | 소모품 |
| 스테인리스 스틸 스쿱 | 무자싱 (중국) | XYS-101 | 소모품 |
| 팁 | 키르겐 (중국) | KG1313 | 소모품 |
| 톨루이딘 블루 염색 용액 | 시그마-올드리치 (미국) | 198161-5G / 198161-25G | 시약 |
| 트리플루오로아세트산 | 알라딘 (중국) | T103293 | 시약 |
| 트리스-HCl | 암레스코 (미국) | T8230 | 시약 |
| 트립신-EDTA 용액 | 솔라비오 (중국) | T1300 | 시약 |
| 초저온 냉동고 | 산요 (일본) | MDF-382E | 장비 |
| 초순수 정수기 | ELGA (영국) | PureLAB 플렉스 | 장비 |
| 초음파 셀 디스럽터 | QSONICA (미국) | Q500 | 장비 |
| 진공 동결 건조기 | 열모 (미국) | SNL 315SV | 장비 |
| 보텍스 믹서 | 크리스탈 테크놀로지 & 산업 (미국) | HYQ-3110 | 장비 |
| 물욕 인큐베이터 | 상하이 이헝 기술 기기 (중국) | HWS-26 | 장비 |
| 종이 무게 측정 | 콜-파머 (미국) | 133802 | 소모품 |
참고문헌
- Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
- Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025)....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
