방법 논문

미세투석 프로브 삽입을 통한 쥐 대퇴동맥 동맥정맥 간질액의 실시간 샘플링

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DOI:

10.3791/69551

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2025년 12월 30일

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1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 마취된 쥐에서 생기간질액(AISF)의 실시간 해부학적으로 정밀한 샘플링을 가능하게 하는 미세투석 기법을 도입하여, 뚜렷한 대사 변이를 밝히고 그 독특한 생리학적 중요성을 확인한다. 기존의 간질유체(ISF) 샘플링 방법과 비교할 때, 이 접근법은 분자 해상도와 샘플링 안정성을 향상시킵니다.

초록

간질액(ISF)은 세포외 미세환경의 중요한 요소로, 대사 교환과 세포 간 소통을 촉진합니다. 그럼에도 불구하고, 해부학적 깊이와 혈관 구조와의 근접성 때문에 침식성 ISF(AISF)는 오염이나 조직 파괴 없이 샘플링이 특히 어렵습니다. 본 연구에서는 마취된 쥐에서 미세투석을 이용한 실시간 최소 침습 AISF 수집 방법을 소개합니다. 대퇴동맥 심폐막과 경정맥에 각각 ISF와 혈액의 연속 샘플링을 위해 20 kDa 컷오프 프로브를 외과적으로 이식하였다. 인공 세포외액을 통한 관류는 저분자량 대사산물의 선택적 확산을 가능하게 했습니다. 주성분 분석(PCA)과 직교 부분 최소제곱 판별 분석(OPLS-DA)을 통해 AISF와 혈액 간 뚜렷한 대사 차이가 관찰되었으며, 146가지 유의미하게 차별되는 대사산물이 확인되었습니다. 락테이트와 세로토닌의 풍부화 패턴은 이 방법의 해부학적 특이성과 기능적 신뢰성을 확인시켜 주었습니다. 특히, AISF는 혈장에서 결여된 국소 합성 대사산물로 풍부해져 독특한 생리학적 중요성을 강조했습니다. 미세바늘, 흡입 물집, 역전원포 등 현재의 간질액(ISF) 샘플링 방법과 비교할 때, 미세투석은 분자 해상도 향상, 샘플링 안정성 향상, 침습성 감소를 제공합니다. 이 기술은 간질액 내 분석 물질(AISF)의 생 체 내 분석에 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공하며, 생체지표 발견과 혈관 병태생리학 연구를 발전시키는 데 큰 잠재력을 보입니다.

서론

조직액, 또는 간질액(ISF)은 세포 미세환경의 중요한 요소로, 학문적 연구는 19세기 후반까지 거슬러 올라갑니다. 1896년 스타링은 모세관 여과-재흡수 이론을 도입했는데, 이 이론은 ISF를 플라즈마 초여과를 통해 생성된 균질한 유체로 처음으로 특징지었으며, 영양분 없는 운반과 대사 폐기물 제거에 중요한 역할을했다. 지난 20년간 현미경 영상 기술과 분자생물학의 발전으로 ISF2의 해부학적 분포, 구성, 기능의 상당한 다양성에 대한 연구자들의 이해가 크게 향상되었습니다.

다양한 해부학적 부위에서 간질액(ISF)에 대한 연구를 통해 다양한 조직 내에서 그 뚜렷한 기능을 밝혀냈습니다. 예를 들어, 뇌 조직에서 ISF는 수면 중 β-아밀로이드와 같은 신경독성 대사산물의 제거를 교림계 를 통해 촉진합니다. 반대로 종양 간질액(TIF)은 젖산이 축적되어 산성 미세환경을 촉진하여 종양 침범과 면역 회피에 기여합니다. 이 발견들은 ISF가 대사 교환의 매개체일 뿐만 아니라 조직 특이적 병태생리학적 과정을 적극적으로 조절하는 역할을 함을 시사합니다. 이러한 맥락에서 수치간질액(AISF)은 그 특이한 해부학적 위치와 기능적 복잡성 때문에 독특한 연구 과제를 제시합니다. AISF는 부폐와주변 조직 5의 경계에 위치하며, 혈관벽과 신경계 및 면역계 간의 상호작용에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 깊은 해부학적 위치와 혈액 및 림프액과의 근접성 때문에 현장 샘플링 및 조성 분석에 상당한 기술적 도전이 제기되고 있습니다.

심지 방법과 외과적 배액 등 전통적인 ISF 샘플링 기법은 혈액 오염과 조직 손상 위험으로 인해 고순도 AISF 샘플 획득에 큰 어려움을 겪고 있습니다. 예를 들어, 혈관 상피의 외과적 제거는 말초 신경이나 림프관에 손상을 일으켜 비표적 생체분자가 혼합될 수 있습니다. 더불어, 이러한 방법들은 낮은 샘플링 속도, 불안정성, 간섭에 대한 취약성, 그리고 재현성 저하로 인해 제한되며, 이는 종종 피하 심지삽입으로 인한 염증과 근육 이식 시 발생하는 세포 손상 때문입니다. 미세투석의 발전은 ISF 연구에 더 효과적인 접근법을 제시합니다. 이 기술은 반투과성 막 프로브를 사용하여 혈관 구조를 손상시키지 않고 ISF 내에서 대사산물과 사이토카인 같은 소분자를 현장 및 동적으로 포획할 수 있게 합니다. 프로브는 혈관 상피 공간 내에 정밀하게 위치할 수 있어 혈액이나 림프액에 의한 오염 위험을 줄일 수 있습니다. 또한, 연속 샘플링을 가능하게 하여 다양한 조건에서 ISF 대사의 동적 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 실험 중 이러한 대사 과정을 지속적이고 안정적으로 모니터링하세요.

프로토콜

이 동물 실험은 베이징 연합 의과대학 동물윤리위원회의 승인을 받은 후 진행되었습니다. 모든 절차는 정해진 프로토콜을 엄격히 준수했습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 실험적 준비

  1. 그림 1에 나타난 미세투석 샘플링 시스템과 관련 수술 기구를 설명해 주세요.
  2. 153.5 mM Na, 4.3 mM K, 0.41 mM Mg, 0.71 mM Ca, 139.4 mM Cl, 1.25 mM 포도당을 포함한 인공 세포외액(aECF)을 준비하고 pH를 7.4로 조절합니다.
  3. 20-kDa mD 프로브 두 개를 준비하고 이를 프로브 1(조직액 프로브)과 프로브 2(혈액 프로브)로 지정합니다. 프로브 1을 멸균된 여과 탈이온수(dH₂O)에, 프로브 2를 1% 나트륨 헤파린에 넣어 프로브 팁이 지속적으로 촉촉하게 유지되도록 합니다.
  4. "유입"과 "유출"에 대해 두 개의 경로 쌍(경로 1과 2)을 설정하세요. PE50 튜빙을 사용해 1m 길이의 FEP 튜빙 두 세그먼트를 연결하여 데드 스페이스를 최소화합니다. 각 유입관을 1mL Exmire 주사기에 연결하세요: 주사기 1에는 dH₂O를, 주사기 2에는 1% 나트륨 헤파린을 채웁니다. 마이크로 주사기를 프로브에 연결하고, 프로브를 경정맥에 삽입한 후 aECF 주입을 준비하세요.
  5. mD 펌프를 작동시키고 유량을 분당 1.5 μL로 설정하여 유체가 유체를 배출할 때까지 유지하세요. 유출관을 샘플 수집 라인에 연결하세요.
  6. 필터링된 aECF를 두 개의 마이크로 주사기에 채우고 분당 1 μL로 펌핑을 시작하세요.

2. 동물 조리

  1. 280 ± 20g (n = 6) 성인 스프래그-도울리 쥐 선택.
  2. 3% 이소플루란을 사용해 마취를 유도하고, 1.8%-2.2% 이소플루란을 공기/산소 혼합물에 넣어 유지하면서 심박수를 모니터링합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따라). 통증 반응이 없고 심박수가 감소한 것으로 확인하여 심마취를 확정하세요(340-390 bpm). 쥐를 온도 고정 담요 위에 올려놓고 사지를 고정하세요.
  3. 목과 왼쪽 뒷다리, 그리고 왼쪽 하복부까지 제모 크림을 바르세요. 제약 부위를 요오도포르로 두 번 소독하고, 75% 의료용 알코올로 잔류 요오드를 제거하세요.

3. 이중 부위 탐침 위치(대퇴부 심폐막과 경정맥)

  1. 그림 2A에 나타난 대로 10mm 능동 투석 창(CMA-20, 컷오프 20 kDa, 축 직경 0.5mm)을 가진 프로브를 사용하세요.
  2. 가이드 바늘과 찢어짐 튜브를 준비하세요(그림 2B).
  3. 쥐의 뒷다리를 무릎 관절과 서혜부 주름의 중간점을 연결하는 선이 몸의 종축에 수직이 되도록 확장하세요. 서혜부 피부를 따라 뒷다리 방향으로 2cm 구간을 측정하여 수술 기준 부위를 정의합니다(그림 2C). 이 서혜부 영역의 중간점을 마이크로윈도우 위치 점으로 식별합니다. 이 위치 지점에서 2cm 옆으로 천공 부위를 표시하세요(그림 2D).
  4. 동물을 입체현미경 아래에 두세요.
  5. 서두부 주름 중앙점에 0.5-0.8cm 절개를 하여 시야를 쉽게 하고 탐침을 혈관 주위 막 내에 정확하게 위치시키세요. 피하 조직을 둔하게 해리하여 대퇴동맥과 정맥, 복재정맥, 그리고 표재성 복벽정맥을 노출시킵니다(그림 2E).
  6. 천공 바늘의 바깥층을 찢어질 수 있는 튜브에 넣어 가이드 바늘을 만듭니다.
  7. 천자 부위 피부 아래에 혈관이 없는지 확인하세요. 바늘을 피부를 수직으로 통과시키고, 각도를 45°로 조정하여 복재정맥 주변 조직 공간에 들어가게 합니다.
  8. 대복재정맥 내 혈류 방향으로 바늘을 앞으로 나가며, 시술 내내 혈관 벽과 밀접하게 접촉한 상태를 유지하세요. 입체 현미경을 사용해 바늘 위치를 실시간으로 모니터링하고 혈관 손상이나 혈액 오염을 예방하세요. 그 후 바늘을 대퇴정맥의 복엽에 넣습니다(그림 2F).
  9. 찢어진 튜브는 조직 내에 그대로 두면서 천자 바늘을 빼세요(그림 2G).
  10. 조직액 탐침을 찢어질 수 있는 카테터에 삽입하고, 조심스럽게 카테터를 열어 샘플링 부위를 노출시키고 조직 샘플을 채취합니다(그림 2H). 탐침이 대퇴동맥과 정맥의 재문막 내에 정확히 위치하도록 하세요(그림 2I). 봉합하기 전에 프로브를 피부에 고정하세요(그림 2J). 모든 시술은 엄격한 무균 조건 하에서 수행하며, 혈관 부활막의 교란을 피하고 조직 염증이나 이물질 반응으로 조직액 수집을 방해할 수 있는 것을 방지해야 합니다.
  11. 수술용 자와 고정 프로브를 함께 촬영하여 노출 길이를 기록하고, 그림 2I에 표시된 이미지와 같이 프로브 위치를 확인하세요.
  12. 목 중앙선에서 약 0.5cm 측면, 흉골 절절 위쪽 1cm 지점에서 피부 절개를 2cm 정도 합니다.
  13. 흉쇄유돌근을 둔하게 절개하여 경동맥 외측에 위치한 경정맥을 노출시키는데, 이 정맥은 짙은 파란색으로 구별됩니다. 촉촉한 면봉을 사용해 미주신경과의 접촉을 피하고 부드럽게 근막을 분리하세요.
  14. 현미경 겸자를 사용해 경정맥의 외막을 부드럽게 올려 주변 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 최소 1cm 이상의 자유혈관 길이를 확보합니다. 4-0 실크 봉합사를 근위부에 삽입하여 백업 결찰 역할을 합니다(그림 2K).
  15. 정맥 천공의 경우, 혈관 직경의 약 3분의 1 크기인 45° 각도로 비스듬히 절개합니다. 마이크로포셉을 사용해 절개 부위를 부드럽게 열고 프로브 삽입을 위한 입구를 만듭니다.
  16. 탐침 팁을 정맥에 조심스럽게 삽입하고 천천히 3.5-4.0cm 깊이로 밀어 끝이 오른쪽 심방 입구에 도달하도록 합니다(그림 2L).
  17. 근위 실크 결찰을 이중 매듭으로 조여 프로브를 고정하세요. 4-0 비크릴 봉합사로 근육층을 봉합한 후, 끊은 봉합으로 피부를 봉합하세요. 프로브의 외부 부분을 피부 표면에 고정하여 이동을 방지하세요.

4. 샘플 채취 및 프로브 회수

  1. 샘플 채취: 조직 투석과 샘플 채집관 내 이동 간의 관계를 평가합니다. 프로브와 수집기 사이에 총 부피를 20 μL로 유지하세요.
    1. 샘플이 프로브와 튜빙을 통과해 튜브 끝에 도달할 때까지 20분간 시간을 두어 1 μL/min의 유량으로 채취합니다. 분석에 필요한 농도를 달성하기 위해 충분한 부피를 채취하세요. 채취관당 30μL의 투석액을 채취하세요.
  2. 샘플 저장: 0.5 mL 폴리프로필렌 채집관을 4 °C까지 미리 냉각합니다. 수집 직후 튜브를 뚜껑을 닫고 액체 질소에 30초간 급동한 후 2분 이내에 -80 °C 냉동실로 옮기세요.
  3. 기초 샘플: 샘플 채취를 시작하기 전에 완전한 샘플 평형화. 마취 상태에서 쥐 한 마리당 3개의 샘플을 채취하여 안정적인 측정 기준선을 설정하세요.
  4. 프로브 제거: 샘플 채취가 완료되면 동물의 머리에서 프로브를 제거하여 1% 나트륨 헤파린이 들어 있는 저장 바이알에 넣습니다. 과도한 이소플루란을 흡입하여 동물을 안락사시키세요.
  5. 프로브 보존: 프로브를 식염수로 충분히 헹구고 식염수 용액이 담긴 바이알에 보관하세요. 미생물 증식을 막기 위해 주사기로 관을 식염수로 세척하세요. 프로브가 충분한 유량을 유지하고 막이 온전할 때만 재사용하세요.

5. 데이터 분석

  1. MetaboAnalyst 6.0을 사용하여 주성분 분석(PCA), 직교 부분 최소제곱 판별 분석(OPLS-DA), 추가 통계 분석을 수행합니다. OPLS-DA를 사용해 예측 변수 중요도(VIP)를 결정하세요.
  2. P값 평가와 접힘 변화 분석을 포함한 비모수 검정을 적용하여 차등 대사산물을 조사합니다. 차등 대사산물 스크리닝의 임계 임계치를 VIP > 1, FC ≥ 2, FC ≤ 0.5, P < 0.05로 설정하세요.
  3. KEGG 화합물 데이터베이스를 사용하여 확인된 대사산물에 주석을 달아라.

6. HPLC - MS/MS

  1. 전기분무 이온화(ESI) 소스가 장착된 AB Sciex 6500+ 삼중 쿼드러폴 질량분석기를 이용해 양이온 모드로 대사물 정량을 수행합니다.
  2. 계기 매개변수는 다음과 같이 설정하세요: 커튼 가스 40 psi; 충돌 가스, 10 psi; 이온 소스 가스 1(GS1), 50 psi; 이온 소스 가스 2(GS2), 55 psi; 이온 분사 전압 4500 V; 그리고 원천 온도는 550 °C입니다.
  3. 시스템을 다중 반응 모니터링(MRM) 모드로 작동시킵니다. 각 대사산물별로 MRM 전이, 탈클러스터링 전위, 충돌 에너지를 개별적으로 최적화합니다. Analyst 1.7.1 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집을, MultiQuant 3.0.3을 사용하여 정량적 분석을 수행합니다.
  4. 크로마토그래피 분리를 위해서는 45 °C에서 유지된 C18 컬럼(2.1 × 100 mm, 1.7 μm)을 사용한다. 이동상은 (A) 0.1% 개산과 (B) 아세토니트릴에 0.1% 개산으로 준비합니다. 유량을 0.35 mL/min, 주입 부피를 6 μL로 설정하세요. 분석 전 오토샘플러 온도를 4 °C로 유지하세요.
    참고: 이 연구의 각 러닝은 총 약 25분간 지속되었습니다.

결과

데이터셋은 합산과 로그 변환을 적용하여 정규화되었고, 이후 포괄적인 통계 분석을 거쳤습니다. 주성분분석(PCA)이 수행되었으며(그림 3A), 뚜렷한 분리와 대사 차이가 드러났습니다. 이후 직교 최소제곱판별분석(OPLS-DA) 모델이 개발되었으며, 결과 점수는 그림 3B에 나타나 모델의 판별적 효과를 입증했습니다. 618종의 대사산물 평가에서 AISF와 혈액 샘플을 비교한 화산 플롯에서 146종의 차등 대사산물이 확인되었으며, 조직액에서는 하향 조절과 상향 조절된 대사산물이 모두 나타났습니다(그림 3C). 또한, 상위 50가지 차등 대사산물의 비교 개요를 제공하기 위해 히트맵이 제작되었습니다(그림 3D).

샘플링 방법의 신뢰성을 평가하기 위해 조직액 성분과 혈액을 각각 양성 대조군으로 세로토닌과 젖산을 사용하였습니다. 결과는 그림 4에 나타난 것처럼 다양한 체액 전반에 걸쳐 이들 성분의 확립된 분포 패턴과 일치했습니다. 보조 그림 1은 -80 °C에 보관된 미세이산액 알리코트 내 락테이트와 세로토닌의 안정성을 보여줍니다.

146개의 차등 대사산물은 여러 범주로 체계적으로 분류되었습니다: 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 그 유사체; 지방산 및 그 유도체; 아미노산, 펩타이드 및 그 유사체; 탄수화물 및 탄수화물 결합물; 유기산 및 그 유도체; 생체 아민; 퓨린과 피리미딘; 비타민과 스테로이드; 그리고 다른 화합물들(그림 5A)도 포함됩니다. 보충 표 1은 혈액에서 검출된 차등 대사산물을 보여줍니다. 히트맵 분석은 생체 아민과 아미노산, 펩타이드 및 그 유사체의 다양한 체액 내 농축 패턴을 추가로 밝혀줍니다(그림 5B, C). 차등 대사물 풍부 분석은 그림 6에 제시되어 있습니다. 보충 표 2는 세 차례의 연속된 혈관 주위 조직액 샘플에서 무작위로 선정된 15가지 대사산물의 변동 계수(CV)를 나열하고 있습니다.

그림 1
그림 1: 실험 장치의 이미지. (A) 냉장 분획 수집기. (B) 주사기 펌프. (C) 마이크로 주사기. (D) 혈관 가위와 핀셋 등 외과 기구. (E) 마취기. (F) 미세투석 탐침. (G) 미세투석 탐침, 조직 가이드 바늘, 찢어질 수 있는 관. (H) 조직 가이드 바늘 조립체. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2
그림 2: 연구의 주요 단계들. (A) 수술 부위의 위치와 탐침의 방향을 나타내는 도식적 표현. (B) 탐침 위치 정밀한 관찰을 위해 중요한 혈관 접합부를 식별하는 것. (C) 가이드 바늘이 피부를 관통하여 조직 공간으로 진출하는 것. (D) 가이드 핀 바늘의 수축을 빼면 찢어질 수 있는 관이 조직 내에 남게 됩니다. (E) 미세투석 탐침이 기존 채널 을 통해 조직에 주입됩니다. (F) 찢어질 수 있는 관을 부드럽게 당겨. 탐침을 고정한 후 찢어질 수 있는 관을 부드럽게 당겨 넣습니다. (G) 대퇴동맥 및 정맥 혈관의 상피에 위치한 탐침의 시각화. (H) 경정맥에서 조직을 분리하는 것. (I) 경정맥에 프로브를 삽입하는 것. (J) 미세투석 탐침이 피부 표면에 고정되어 있습니다. (K) 경정맥 분리. (L) 경정맥에 탐침을 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3
그림 3: 간질액(ISF)과 혈액의 다변량 통계 분석. (A) 데이터는 유의미한 분리를 강조하도록 축소되어 ISF와 혈액 성분 간의 뚜렷한 차이를 보여준다. (B) 직교 부분 최소제곱 판별 분석(OPLS-DA) 모델 점수는 각각 R2Y 및 Q2 값 0.925와 0.811을 나타냅니다. (C) 화산 그래프에는 146종의 차등 대사산물이 나타나 있으며, ISF에서 85종은 하향 조절, 61종은 상향 조절됩니다. (D) 이에 대응하여, ISF와 혈액 내 상위 30가지 대사산물을 비교한 히트맵은 두 구성 요소 사이에 명확한 구분을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4
그림 4: 일련의 박스 플롯을 제시하여 ISF와 혈액 내 락테이트와 세로토닌의 농축 수준을 밝혔다. 모든 데이터 포인트는 SEM ± 평균을 나타냅니다; 모든 정량적 패널에 대해 오차 바가 표시되어 있습니다. 패널 (A)은 ISF 샘플이 혈액 샘플에 비해 유의미하게 더 높은 락테이트 농도를 보임을 보여줍니다. 반면, 패널 (B)은 혈액 샘플에서 세로토닌이 더 풍부하게 작용하며, 동시에 낮은 락테이트 수치를 보인다는 것을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5
그림 5: 차등 대사산물의 분류 고리 차트와 아미노산, 펩타이드 및 유사체, 그리고 생체 아민의 열지도가 나타난다. (A) 각 색상 블록은 고유한 대사산물 계열에 해당합니다. 아미노산, 펩타이드 및 유사체가 가장 큰 범주로 전체 중 19.29%를 차지하며, 그 다음으로 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 유사체(15%), 지방산 및 유도체(12.86%), 탄수화물 및 탄수화물 결합체(7.86%), 유기산 및 유도체(10%), 생체 아민(7.14%), 퓨린/피리미딘(5.71%), 비타민 및 스테로이드(8.57%), 그리고 인돌, 아제핀, 피리딘, 벤젠 등 기타 화합물(13.57%)이 있습니다. (B) 간질액(ISF)에서 생체 아민 범주 내 디옥시카르니틴과 스페르미딘과 같은 화합물의 농축 수준이 혈액에 비해 유의미하게 높으며, 세로토닌(D4), 세로토닌, 트립타민 및 관련 화합물의 농도는 유의미하게 감소합니다. (C) ISF에서는 아미노산, 펩타이드 및 유사체와 관련된 대사산물의 대사산물이 혈액에서 관찰되는 것보다 현저히 낮습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6
그림 6: 정상 간질액의 대사체 집합 농축 분석(MSEA)은 대사 활동이 주로 에너지 생산, 산화환원 항상성, 아미노산 회전과 관련된 경로에 분포되어 있음을 밝혀냈습니다. 상위 농축 경로로는 부타노에이트 대사, 퓨린 대사, 글루타티온 대사가 있으며, 이는 생리적 조건에서 미토콘드리아 에너지 공급과 항산화 능력의 유지를 반영합니다. 또한, 아르기닌과 프로린 대사, 트립토판 대사, 시스테인 및 메티오닌 대사 등 여러 아미노산 관련 경로가 나타나 세포외 미세환경에서 활발한 아미노산 전환과 질소 균형 조절을 시사합니다. 이 발견들은 정상 간질성 대사체가 생체에너지 과정, 산화 방어, 아미노산 대사 간의 동적 균형을 유지하여 조직의 항상성과 미세 순환 안정성을 지원한다는 것을 시사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 1: -80 °C에 보관된 미세이해제 알리코트에서 락테이트와 세로토닌의 안정성. 데이터는 SEM 평균± (시간대당 n = 6회 복제). 72시간 동안 분석제가 기준선에서 >5% 이상 이상 발생하지 않았습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보충표 1: 혈액 내 차별 대사산물 및 간간액 미세이해제액. 여기에는 대사체 이름, 접힘 변화(FC), 학생의 t-검정 P 값, 그리고 VIP(OPLS-DA)가 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 2: 세 차례의 연속된 혈관주조직액 샘플에서 무작위로 선정된 15가지 대사산물의 변동계수(CV). 모든 이력서는 <20%입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

간질액(ISF)은 모든 조직 세포를 감싸는 수성 미세 환경으로, 세포외액 구획의 약 75%를 차지합니다. 혈장의 모세관 여과로 생성되는 ISF는 혈액의 세포 및 고단백 함량은 없지만 전해질, 소량 용질, 그리고 물을 유지합니다. 이 구성은 ISF를 혈관 세계와 세포 세계 사이의 핵심 인터페이스로 자리매김합니다. 기능적으로 ISF는 역동적인 수송 매체입니다. 산소, 포도당, 아미노산, 미량 영양소를 혈류에서 세포로 운반하는 동시에 이산화탄소, 요소 및 기타 대사 노폐물을 수집하여 순환계로 되돌립니다10. 이 유체는 또한 윤활제이자 완충제 역할을 하여 간질층 삼투압, pH, 이온 균형을 안정화합니다. 대사 외에도 ISF는 백혈구, 항체, 사이토카인을 조직 공간을 통해 전달하여 면역 감시를 지원하며, 호르몬과 파라크린 신호의 통신 고로 역할을 합니다12,13. 혈액과 비교할 때, ISF는 본질적으로 세포 없는 저단백 여과물입니다. 혈관나무에 국한된 혈액에는 적혈구와 백혈구, 혈소판, 그리고 높은 농도의 알부민과 응고 인자가 포함되어 있습니다. 산소와 영양 농도는 혈액에서 가장 높고 세포 흡수로 인해 ISF에서는 점차 낮아지며, 노폐물은 림프나 정맥 회류로 들어가기 전에 ISF에 축적됩니다10. 정상 ISF에서 큰 단백질과 세포가 없으면 암막 압력이 최소화되고 빠른 확산이 가능하지만, 염증 상태는 일시적으로 이 프로필을 변화시킬 수 있습니다15.

그러나 ISF 연구는 명확하고 신속하며 신뢰할 수 있는 표본추출 방법론의 부재로 인해 제한적입니다. 현재 방법으로는 마이크로니들(MN) 패치, 흡입 물집, 역전원포리시스, 열 소작술, 미세투석 등이 있습니다. MN 패치는 피부를 통해 ISF 추출을 위한 마이크로채널을 생성하며, 코어-셸 변형은 30초 이내에 ISF를, 삼투압 하이드로겔 MN은 약 3분 만에 추출합니다. 이들은 센서와 결합해 온패치 분석을 할 수 있지만, 부피에 제한되어 강도와 부기 사이의 균형이 필요합니다. 흡인기 물집은 혈액 오염이 최소화된 순수 ISF를 제공하지만 침습적이고 고통스럽고 느립니다.16, 17, 18. 역전원포어(RI)는 저전류를 이용해 포도당과 리튬 이온과 같은 전하 분석 물질을 피부 표면으로 운반하여 비침습적 모니터링을 수행합니다. 하지만 낮은 처리량, 개체별 변동성, 잠재적 피부 자극 등의 도전 과제도 존재합니다19,20. 경피 투여(TA)는 국소적인 가열로 각질층을 파괴하여 ISF가 수동적으로 친수성 마이크로채널에 진입할 수 있도록 합니다. 장치 설계는 더 단순하지만, 5 μL 미만의 유체를 수집하므로 매우 민감한 감지와 신중한 열 관리가 필요해 연소를 방지합니다21,22. 반면, 미세투석(MD)은 이식된 반투과성 프로브를 통한 확산에 의존하며, 10 kDa의 포도당과 100 kDa의 단백질 및 사이토카인 등 조절 가능한 분자량 차단(MWCO) 막을 통해 독특한 분자 선택성을 제공합니다23,24. 이 기술은 지속적이고 최소 침습적인 샘플링을 지원합니다. 그러나 MD는 운영상으로는 복잡하며, 생체 내 보정이 필요하고, 소수성 종에 대해 회수 속도가 다양합니다. 특히, MD는 대형 생체분자의 크기 선택적 분리가 가능한 유일한 기술입니다25. 혈관 부근 채취 투석액과 혈액 간 비교 연구에서는 유산과 세로토닌 프로필이 뚜렷하게 나타나 MD 접근법의 안정성과 특이성을 검증하였습니다.

동물 연구에 따르면 심장과 폐의 시너지 조절을 받아 ISF는 큰 동맥, 정맥, 말초 신경과 관련된 음활막으로 흐를 수 있습니다 5,9. 일반적으로 ISF는 혈장에서 직접 유래하거나 조직 내에서 국소적으로 합성되는 대사산물을 포함하고 있습니다 26,27,28. 따라서 AISF와 혈장에서 대사산물의 중첩과 차이가 확인된 것은 ISF 순환계가 혈관을 따라 조직에서 영양분과 대사산물의 운반과 제거에 관여하고 있음을 나타낼 가능성이 있습니다. 여기서 도입된 AISF 샘플링 기법은 전신 ISF 순환이 신체 여러 장기와 조직에서 대사 조절에 미치는 연구를 크게 향상시킬 것입니다.

본 연구에서 사용된 20 kDa 분자량 차단막(MWCO)은 포도당, 젖산, 피루브산, 아미노산 등 소량 대사산의 정량적 회수에 최적화되어 있습니다. 하지만 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 세포외효소와 같은 생물학적으로 중요한 다대분자는 일관되게 과소 샘플링하거나 완전히 배제합니다. 임상 및 방법론적 리뷰들은 표준 20 kDa 카테터가 소량 친수성 대사산물을 수집하는 데 효과적이지만, 단백질과 염증 매개체에 대한 회복률이 낮다는 점을 강조했습니다29. 따라서 정확한 사이토카인 정량화를 위해서는 MWCO가 더 높은 막(예: 100 kDa)이나 대체 샘플링 전략이 필요합니다30,31. 따라서 우리 연구팀은 앞으로 MWCO가 더 큰 막을 사용하여 말초 간질액의 고분자 조성을 특성화할 예정입니다. 이 연구에서는 투석액을 전신마취 하에 채취하였습니다. 미세투석은 이전에 깨어 있고 자유롭게 움직이는 동물에서 검증되었으며, 여러 "개방 흐름" 미세 관류 기법이 의식 모델에 적용되었습니다32. 그러나 깨어 있는 동물에 적용할 수 있도록 탐침 설계 및 이식 프로토콜을 조정하려면 줄링, 동물 스트레스, 탐침 안정성, 움직임 아티팩트, 장기 인내성 등 여러 문제를 해결해야 합니다. 현재 경량 테더-스위블 시스템을 개발 중이며, 이후 연구에서는 의식적인 샘플링을 계획하고 있습니다.

공개 사항

공개해야 할 재정적 이해 상충은 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가중점연구개발계획(2025YFC3507601)과 중앙 공공복지연구기관 기초 연구기금(번호)의 지원을 받았습니다. ZZ-YC2023007).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
심전도 모니터링 시스템AD 인스트루먼츠, 호주파워랩장비
겸자F.S.T(순수 과학 도구) 독일11252-00외과 기구
헤파린 나트륨시그마-올드리치, 미국9041-08-1재료
고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석기(HPLC-MS/MS)SCIEX, 미국엑시온LC-20AC장비
IRIS 표준 가위F.S.T(순수 과학 도구) 독일14060-09외과 기구
이소플루란RWD 라이프 사이언스, PRCR510-22-10재료
저유량 마취 시스템켄트 사이언티픽, 미국솜노스위트장비
미세투석 관류액 T1CMA 미세투석, 스웨덴P000034재료
마이크로투석 프로브, 20 엘리트CMA 미세투석, 스웨덴8010436재료
미세투석 주사기 1 mL 가스 밀폐CMA 미세투석, 스웨덴8309020재료
냉장 분획 수집기CMA 미세투석, 스웨덴470장비
CMA 20 프로브용 스플릿 튜빙CMA 미세투석, 스웨덴8309019재료
입체 현미경올림푸스, 일본SZ61장비
주사기 펌프CMA MD AB, 스웨덴800310장비

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