한방 관장 포뮬러는 S100β/RAGE/NF-κB 경로를 통해 장내 교세포 활성화를 억제하여 궤양성 대장염을 완화합니다

Xue Li; Jianxin Chen; Xuya Zhang; Yushan Gao; Yan Fu; Hong Jiang; Yi Lu

doi:10.3791/69571

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연구 논문

한방 관장 포뮬러는 S100β/RAGE/NF-κB 경로를 통해 장내 교세포 활성화를 억제하여 궤양성 대장염을 완화합니다

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DOI:

10.3791/69571

⸱

2025년 11월 28일

Xue Li¹ , Jianxin Chen¹ , Xuya Zhang¹ , Yushan Gao¹ , Yan Fu¹ , Hong Jiang¹ , Yi Lu¹

¹Beijing University of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

상귀소르바 오피시나리스, 블레틸라 스트리아타, 아카시아 카테추를 결합한 허브 관장 포뮬러가 LC-MS/MS 프로파일링, S100β 도킹, DSS 대장염 모델, LPS/IFN-γ 활성화된 장내 교세포를 통해 평가되었습니다. 이 공식은 S100β를 자극하여 교세포 활성화를 억제하고 p-NF-κB/iNOS 발현을 감소시켜 S100β-RAGE-NF-κB 축을 통한 완화를 나타냈다.

초록

장관절교세포(EGCs)의 활성화는 궤양성 대장염(UC)의 발병 기전에 기여합니다. 이 연구는 Sanguisorba officinalis, Bletilla striata, Acacia catechu를 결합한 허브 관장인 Dibai 관장 액체(DBE)가 EGC 유발 염증을 조절하는지 조사했습니다. DBE 성분과 우선순위 화합물의 LC-MS/MS 프로필이 S100β에 도킹되었습니다. 체중, 대장 길이, 조직병리학 및 사이토카인 수치(ELISA)를 사용하여 덱스트란 황산나트륨(DSS) 유발 생쥐 대장염에서 효능을 평가하였습니다. 교세포 활성화 마커는 면역조직화학, 면역형광 공동定位, 정량적 PCR(qPCR), 면역블롯팅을 통해 측정되었습니다. 시험 관 내 모델은 CRL-2690 장내 교세포를 지지다당과 인터페론-γ으로 활성화했으며, DBE가 포함된 쥐 혈청(15%)을 중재로 사용하였습니다. 도킹 결과, 여러 DBE 성분이 S100β에 강하게 결합할 것으로 예측되었다. DSS는 TNF-α과 IL-1β를 증가시키고, 밀접 결합을 파괴하며, mRNA와 단백질 수준 모두에서 S100β/GFAP를 상승시켰으며, 이는 교세포 과활성화와 일치합니다; DBE는 이러한 변화를 크게 뒤집었습니다. 시험관 내에서 DBE는 S100β, RAGE, inos(NOS2), 인산화된 NF-κB p65를 환원시켰습니다. 전체적으로 DBE는 EGC 활성화를 억제하고 S100β/RAGE/NF-κB/iNOS 축을 하향 조절하여 점막의 완전성을 보존함으로써 UC를 완화하는 것으로 보입니다.

서론

궤양성 대장염(UC)은 염증성 장질환(IBD)의 주요 아형으로, 1990년 이후 전 세계적으로 증가하는 부담이 증가하고 있으며, UC는 IBD^{발생 사례의} 상당 부분을 차지^합니다. 일반적인 증상으로는 복통과 혈변이 있으며, 이는 상당한 신체적·심리적 고통과 상당한^{치료 비용을 초}래합니다. 치료 옵션이 확대되었음에도 불구하고, 면역 조절제와 전신 면역을 억제하는 생물학적 제제에 장기간 노출되면 림프종 및 기회감염 위험이 증가하며, 일부 환자는 여전히 불내성 또는 불내성을 유지^합니다. UC는 점막 면역 항상성 파괴가 병태생리의 핵심인 면역매개 질환으로 널리 인식^됩니다. 그러나 누적된 증거는 점막 면역 기전만으로는 IBD의 모든 특징을 설명하기에 충분하지 않다는 것을 시사합니다; 장신경계(ENS)는 장 염증에 기여하여 IBD⁶ 내에서 질병 개념을 신경염증으로 확장합니다.

성체 포유류에서 장내 신경세포보다 많은 장내 교세포(EGCs)는 이제 장 항상성과 염증의 핵심 조절자로 인정받고 있습니다 ^7,8. EGC는 GDNF, TGF-β1, S100β, 15d-PGJ2와 같은 매개체를 방출하여 상피 장벽 기능을 조절하여 투과성과 점막 완전성에 영향을^줍니다. 이 매개체들 중 S100β는 RAGE/NF-κB 경로를 포함한 하류 연쇄 반응을 활성화하여 장벽 손상과 염증 증폭을 유발할 수 있습니다^10,11. EGC는 또한 connexin-43과 M-CSF를 통해 대식세포 표현형과 내장 감수성을 조절하고, 시험관 내 T 세포에 억제 효과를 가하여 UC에서 EGC 활성화를 치료 표적으로 활용함으로써 면역 반응을 형성^합니다.

전통 중의학(TCM)은 UC에서 점점 더 연구되고 있으며, 임상 및 실험 환경에서 유망한 효과를 보여주고 있습니다^14,15. 고전적인 산귀소르바 오피시날리스(Diyu)와 블레틸라 스트리아타(Baiji)의 조합, 그리고 아카시아 카테추(Ercha)는 오랫동안 약물 출처에서 이질 질환에 대해 문서화되어 왔으며, 중국 약전에도 정혈, 진통, 상처 치유 적응증으로 등재되어 있습니다. 현대 연구들은 이러한 식물성 성분에 대해 항균, 항염증, 항산화, 항궤양 활성을 보고하며, A. catechu는 신경 보호 효과도 입증하여 카테킨이 주요 성분으로 포함되어 있습니다^16,17. 기존의 전신 면역억제와 비교할 때, EGC 중심 신경면역 경로를 관여하는 제형은 독특한 기전을 가진 보완적 효능을 제공할 수 있으며, 전신 면역 관련 위험도 잠재적으로 적을 수 있습니다^18,19.

본 연구는 디유, 바이지, 얼차(DBE)의 복합 제제가 EGC 활성화를 억제하여 UC를 완화하는지 평가합니다. 통합 접근법이 사용되었습니다: 성분 우선순위를 정하기 위한 비표적 LC-MS/MS 프로파일링, S100β에 대한 분자 결합, 덱스트란 황산염 유발 대장염 모델에서의 검증, 그리고 EGC에서의 기전적 분석법. 이 연구는 이전 UC 치료에서 탐구되었던 신경면역 기전인 S100β/RAGE/NF-κB/iNOS 없는 기전을 강조하며, 용량 선택, 제형 최적화 및 이후 중개 연구에 대한 실질적 시사점을 제시합니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 베이징 중의대학 동물윤리위원회[BUCM-2023-0912]의 승인을 받았으며, 실험동물 관리 및 사용에 관한 기관 및 국가 지침에 따라 진행되었습니다. 인간 대상은 포함되지 않았다.
시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 시약 및 재료

분석 용매와 분자생물학 등급 시약이 전반적으로 사용되었습니다. 제조사, 카탈로그 번호, 소프트웨어 라이선스 세부 정보를 포함한 모든 상업 정보는 재료표(xlsx)에 제공되어 있습니다. 모든 준비물은 탈이온화되고 여과되었습니다. 모든 버퍼는 신선하게 준비되었거나 아래에 명시된 조건에 따라 보관되었습니다.

2. 장비 및 소프트웨어 설정

쿼드러폴 비행 시간 질량분석기와 결합된 UPLC-MS/MS 시스템; 스윙 버킷 로터가 장착된 냉장 원심분리기; 37°C, 5% CO₂, 상대 습도 ≥95%로 유지되는 CO₂ 인큐베이터; 마이크로플레이트 리더(450nm); 실시간 PCR 열사이클러; 전기영동 및 블로팅 장치; 고정 여기/방출 필터가 장착된 형광 현미경이 사용되었습니다. 계측기 제어 및 데이터 분석은 크로마토그래피 및 질량분석법 데이터를 위해 MassLynx v4.2에서, 도킹은 AutoDock 4.2와 AutoDockTools 1.5.7에서 수행되었습니다. 이미지 분석은 ImageJ/Fiji v1.53에서 수행되었습니다.

3. 디바이 관장 액체(DBE) 제조

디유(50g), 바이지(50g), 에르차(20g)로 구성된 허브 혼합물은 거칠게 으깨서 1,200mL 탈이온수에 30분간 담가두어 완전한 수분 공급을 보장했습니다. 불린 혼합물을 30분간 격렬하게 끓이고, 가끔씩 저어 달라붙지 않게 했습니다. 뜨거운 도장은 멸균 다층 의료용 거즈를 통해 무균 유리 제품에 걸러져 불용성 물질을 제거했습니다. 여과액은 45°C를 넘지 않는 수욕에서 진공 농축되어 최종 농축액 1.98 g/mL에 해당하는 농축액(고용량 스톡)을 얻었습니다. 0.99 g/mL 및 0.50 g/mL의 중저용량 작동 용액을 멸균 탈이온수로 희석하여 각각 100 mL의 최종 부피로 제조하였다. 각 용액은 0.22 μm 두께의 막을 무균 조건에서 통과시킨 후, 라벨이 붙은 멸균 용기에 분제되어 최대 7일간 4°C에서 보관되었습니다. 사용 전에 용액을 부드럽게 섞었으며; 적절한 외관은 눈에 띄는 입자 없이 투명하거나 약간 오팔빛이 나는 상태였다.

4. UPLC - DBE의 MS/MS 분석

각 약용 성분의 분말은 50mg으로 정확히 무게를 측정하고, 상온에서 30분간 초음파 교반을 통해 80%(v/v) 메탄올 1.0mL로 추출했습니다. 추출물을 초음파 검사 후 실온으로 되돌려 15,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리한 후, 상청액은 0.22 μm 막을 통해 오토샘플러 바이알로 여과했습니다. 크로마토그래피 분리는 35°C에서 유지된 반상 캡슐(2.1 × 100 mm, 1.8 μm; 극 끝 C18형)에서 수행되었으며; 칼럼, 브랜드/모델, 카탈로그 번호는 재료표에 제공되어 있습니다. 이동상 A: 물에 0.1% 개미산; 이동상 B: 아세토니트릴. 유량: 분당 0.30 mL; 주입 부피: 10 μL. 기울기: 0-2분 동안 5% B 투여; 2분→20분 동안 595% B; 20-23분 동안 95% B; 23.0분부터 23.1분까지는 95→5% B; 5% B에서 26분까지 재평형을 유지하세요(전체 구배 표는 표 1에 제공됨).

질량분석법은 양/음수 스위칭을 가진 전기분무 이온화와 저에너지 및 고에너지 스캔(MSE) 탐색을 통한 데이터 독립적 획득을 사용했습니다. 질량 범위: m/z 100-1,500; 모세관 전압: 2.0 kV; 샘플링 콘: 20 V; 원원 온도: 120 °C; 해독 온도: 360 °C; 콘 가스: 50 L/h; 용해가스: 600 L/h. 고에너지 함수는 20-50 eV의 단계적 충돌 에너지를 사용했습니다. 데이터는 MassLynx v4.2에서 잠 질량 보정과 표준 피크 검출 매개변수를 적용하여 처리되었습니다. 보 충표 1에는 105개의 확인된 성분(분자식, 관찰된 m/z, 보존 시간, 신뢰도 점수)이 포함되어 있습니다.

5. 분자 도킹

도킹은 유도 적합 프로토콜에 따라 AutoDock 4.2에서 수행되었습니다. S100β(PDB 3HCM)의 3차원 구조는 결정학적 물 분자를 제거하고 극성 수소를 첨가한 후 콜만 전하를 부여하여 준비되었습니다. 특징적인 DBE 성분을 나타내는 리간드 구조가 구축되어, 생리적 pH에서 프로톤화되고 에너지가 최소화되었습니다. 결합 부위는 네이티브 리간드 좌표로 정의되었으며; 원래의 리간드에서 6 Å 이내의 아미노산 잔기는 도킹 시 유연하게 처리되었습니다. 격자 박스는 0.375 Å의 격자 간격으로 포켓 전체를 감싸고 있었습니다. 라마르크 유전 알고리즘 매개변수는 다음과 같다: 인구 크기 150; 최대 2.5 × 10⁶ 에너지 평가; 리간드당 100개의 독립 분주. 최종 자세는 예측된 결합 자유 에너지로 순위를 매기고 RMSD로 군집화되었으며; 상호작용 패턴(수소 결합, 소수성 접촉, π-π 상호작용)은 알려진 S100β 복합체와의 일관성을 위해 시각화되었습니다.

6. DSS 유발 대장염 및 DBE 치료의 동물 모델

수컷 C57BL/6J 마우스(8주, 20-22g)는 22± 2°C, 50%-60% 상대습도, 12시간 밝고 어두운 주기에서 최소 7일간 적응시켰으며, 자유롭게 식사와 물을 제공했습니다. 동물들은 무작위로 6개 그룹(n=10/그룹)으로 배정되었습니다: 대조군, 덱스트란 황산나트륨(DSS) 모델, 설파살라진(SASP) 양성 대조군, 그리고 저용량, 중용량, 고용량 DBE 치료. 조직학적 점수 매기기 및 영상 정량화를 담당하는 인력은 그룹 배정에 대해 눈가림이 없었습니다.

실험적 대장염은 7일간 식수에서 2.0% DSS(w/v) DSS를 투여한 후 3일간 1.0% DSS, 그리고 안락사 전 4일간 일반 물을 투여하여 유도하였습니다. DBE는 직장에 2.5cm 삽입된 유연한 카테터를 사용하여 10 mL/kg의 관장으로 하루 한 번 투여하였으며; 누수를 최소화하기 위해 동물들은 30분간 수직으로 보관되었습니다. 일일 DBE 용량은 각각 저, 중, 고그룹의 12.35, 27.4, 49.4 g/kg/kg이었습니다; SASP는 양성 대조군으로 0.5 g/kg/일 용량으로 투여되었습니다. 체중, 대변 질도, 대변 잠혈을 매일 기록하여 질병 활동성 지수를 계산하였습니다. 종말 시점에 쥐들은 펜토바르비탈 나트륨 50 mg/kg i.p.로 마취되었고; 후안와동에서 헤파린화된 모세혈관을 이용해 혈액을 채취했으며; 동물들은 경추 탈구로 안락사되었습니다. 회측근 접합부에서 직장까지 대장을 절제하고 부드럽게 펴서 최소한의 장력으로 길이를 측정했습니다. 대표 구간은 4% 파라포름알데히드에 고정되었고; 남은 조직은 액체 질소에 급동하여 −80 °C에 저장되었습니다.

7. 약물 함유 혈청 제제

수컷 스프래그-도울리 쥐는 대조군과 DBE 그룹으로 무작위로 배분되었습니다(n=6개/그룹). DBE 그룹은 7일간 하루 1회 경구 개베이지로 12.34 g/kg/을 받았으며; 대조군은 동일한 용량의 정제수를 받았습니다. 최종 투여 후 24시간 후, 동물들에게 마취를 시행하고 복부 대동맥에서 전혈을 채취했습니다. 혈청은 상온에서 30분간 응고한 후 4°C에서 1,500× g 에서 10분간 원심분리했다. 혈청은 56 °C에서 30분간 열로 비활성화된 후, 멸균 조건에서 0.22 μm 막을 통과한 후 저장되었습니다. 혈청은 멸균 튜브에 분리되어 −80 °C에 보관되었다. 414 nm 근처에서 흡수도가 상승한 용혈 샘플은 제외되었습니다.

8. 조직학적 검사(H&E)

대장 조직은 4% 파라포름알데히드에 24시간 고정된 후 등급 에탄올로 탈수되고, 자일렌에 정화된 후 파라핀에 박혀 있습니다. 5 μm 절면은 절단, 탈파라핀, 재수화, 헤마톡실린으로 5분간 염색, 흐르는 물에 5분간 청색 처리, 2분간 에오신으로 교환 염색을 했습니다. 슬라이드는 수지로 마운트되어 납골 구조, 고블릿 세포 밀도, 상피 연속성, 염증 침윤 여부를 검사하였다. 대표적인 변경은 화살표/화살촉으로 표시되며 도형 전설에 정의됩니다; 축척 바(예: 200 μm)와 미리 정의된 시각적 임계값은 범례에 명시됩니다.

9. 면역조직화학(IHC)

파라핀 절편은 시트레이트 버퍼(pH 6.0)에서 95-98 °C에서 15-20분간 항원 회취를 받고, 내인성 과산화효소는 3% 과산화수소로 10분간 소결하며, 5% 정상 혈청으로 1시간 동안 실온에서 차단하였습니다. 1차 항체는 4°C에서 가습 챔버에서 하룻밤 배양하였습니다. 세척 후, 절단은 DAB로 현상한 스트렙타비딘-과산화효소 검출 시스템(현미경 모니터링)을 사용해 헤마톡실린으로 염색한 후 탈수 후 장착했습니다. 각 배치에는 1차 항체가 없는 음성 대조군이 포함되었습니다.

10. 면역형광(IF) 분석

파라핀 함침 절편은 탈파라핀되어 EDTA 버퍼(pH 8.0)에서 항원 회취를 받았다. 냉각 후에는 3% 소 혈청 알부민으로 상온에서 1시간 동안 비특이적 결합을 차단하였습니다. 절편들은 4°C에서 GFAP(1:500)과 S100β(1:200)에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션되었고, 이어서 형광포체 결합 2차 항체(1:500)를 실온에서 어두운 환경에서 1시간 동안 투여하였다. 핵은 DAPI로 카운터 스테인팅되었고, 슬라이드는 페이드 방지 매체에 장착되었습니다. 이미지는 동일한 대물렌즈, 고정된 노출 시간 100ms, 검출기 이득 1.0을 사용해 그룹별로 촬영되었습니다. 평균 형광 강도는 픽셀 크기 보정, 배경 감산(롤링 볼 반경 50픽셀), DAPI 양수 영역으로의 정규화 후 ImageJ/Fiji v1.53에서 정량화되었습니다. 그룹당 최소 5개의 생물학적 복제와 3개의 겹치지 않는 영역이 분석되었습니다.

11. 세포 배양 및 처리

쥐의 장내 교세포(CRL-2690 지정)는 DMEM에서 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 DMEM에서 37°C의 가습 인큐베이터에 5% CO₂를 첨가하여 배양하였습니다. 세포 정체는 단거리 반복 프로파일링으로 확인되었으며, 배양 결과는 마이코플라즈마가 없었습니다. 실험은 5번부터 15번까지의 통로에서 수행되었다. 세포는 2.0 mL/웰 배지에 6웰 플레이트에 2.0 mL/웰 배지에 10⁵ 세포× 시딩하여 24시간 동안 부착했습니다. 실험군은 무처리 대조군, 차량 대조군, 모델군, DBE 혈청, 억제제군으로 구성되었습니다.

모델 유도를 위해 세포는 지질다당류(LPS, 1 μg/mL)와 IFN-γ(20 ng/mL)를 완전 배지에서 24시간 동안 노출시켰습니다; IFN-γ에 해당하는 U/mL 값은 로트 특이적 효능에 따라 재료 표에 보고됩니다. DBE 혈청 처리를 위해 세포는 15%(v/v) 열 비활성화(56 °C, 30분), 0.22 μm 여과 DBE 함유 쥐 혈청을 완전 배지에 24시간 동안 투여했습니다(용량 범위는 CCK-8 절에서 명시된 생존 최적화에 사용됨). 억제제 치료에는 선택적 S100β 억제제 SBI-4211(10-50 μM; 주요 측정 시 45 μM)을 24시간 동안 적용하였습니다. 차량 제어 장치는 동일한 매질과 용매 함량(0.1% DMSO (v/v))을 일치시켰습니다. 특별한 언급이 없는 한, 처리는 미리 가열된 37 °C의 배지에서 준비되었으며, 세포는 2× PBS로 세척한 후 처리 교체를 하였습니다. 치료 후에는 세포를 채취하여 RNA 추출, 단백질 분석, 면역형광 검사를 수행했으며, 이후 섹션에서 자세히 설명했습니다. 생물학적 복제는 각 조건당 n≥ 5개의 독립 배양이었습니다.

12. CCK-8 세포 생존 가능성 분석

세포는 100 μL 배지에 5× 10³ 셀/웰에 96웰 플레이트에 시딩되어 하룻밤 동안 접착되었습니다. 배지는 DBE 처리 혈청이 포함된 배지로 교체되었으며, 5%, 10%, 15%, 또는 20%(v/v)로 24시간 동안 배양되었다. CCK-8 시약(10 μL/웰)을 추가하고, 플레이트는 37°C에서 1시간 배양했다. 흡광도는 450nm에서 블랭크 뺄셈(배양지 + 시약, 세포 없음)으로 측정되었습니다. 실현 가능성은 차량 통제 비율로 표현되었습니다. 각 조건은 n≥ 5개의 생물학적 복제(독립 배양)를 사용했으며, 각 배양당 3개의 기술적 복제가 있었습니다.

13. 조직 사이토카인을 위한 ELISA

대장 조직은 프로테아제 억제제를 포함한 PBS(1:9, w/v)에서 얼음 위에 균질화되었습니다. 균질체는 4°C에서 10분간 12,000× g 으로 정제되었고; 상청액은 키트 프로토콜에 따라 IL-1β와 TNF-α 검사를 하였다. 표준과 샘플은 중복 실행되었고, 곡선은 R² ≥ 0.99의 4파라미터 로지스틱(4PL) 모델로 적합되었습니다; 역계산 기준은 명목 기준의 85%-115% 이내에서 수용되었습니다. 흡수도는 450nm에서 측정되었으며, 가능한 경우 620-650nm 기준값이 사용되었습니다. 사이토카인 농도는 조직 중량(pg/mg 조직)에 정규화되었습니다. 각 그룹은 n≥ 5개의 생물학적 복제체를 포함했습니다.

14. 정량적 실시간 PCR(qPCR)

대장 조직(또는 해당 세포)에서 추출한 총 RNA는 규소막 스핀 컬럼 키트를 사용했습니다. RNA 무결성은 A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1 및 진혈-겔 검사로 검증되었습니다. 1 μg RNA에서 유전체 DNA 제거를 통해 첫 가닥 cDNA를 합성했습니다. qPCR은 보정된 열사이클러에 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용했으며, 프로그램은 95 °C 30초; 95 °C 5초, 60 °C 30초 40주기; 녹는 곡선은 65-95 °C, 0.5 °C/5초 간격으로 조정됩니다. GAPDH는 내인성 대조군 역할을 했습니다. 상대 발현은 프라이머 효율(표준 곡선 기울기에서 90%-110%)을 검증한 후 2⁻ΔΔCt로 계산하였습니다. 무-RT 및 노-템플릿 컨트롤이 포함되었습니다. 프라이머 서열은 표 2에 나열되어 있습니다. 각 그룹은 샘플당 ≥ 5개의 생물학적 복제와 2개의 기술적 반복을 가졌습니다.

15. 서부 블롯 분석

대장 조직(또는 세포)에서 단백질을 프로테아제/인산효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼에서 추출하여 BCA 분석으로 정량화하였습니다. 균등한 단백질(30 μg/lane)을 변성하여 4-20% 구배 SDS-PAGE에서 분해한 후 PVDF(0.45 μm; ≤ 20 kDa 타겟에 대해 0.2 μm)로 전달했습니다. 막은 5% 탈지유에 2시간 동안 실온에서 차단한 후, GFAP(1:1,000), S100β(1:1,000), iNOS(1:1,000), NF-κB p65(1:1,000), 인산-NF-κB p65(Ser536, 1:1,000), 옥클루딘(1:1,000), 클라우딘-1(1:1,000), GAPDH(1:5,000)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하였습니다. HRP 결합 2차 항체(1:5,000)를 상온에서 1시간 동안 적용하였다. 신호는 ECL로 개발되었으며; 노출 시간은 선형 동적 범위(10-90초)로 제한되었습니다. 전이 현상은 차단 전에 가역성 막 염색을 통해 확인되었습니다. 밴드 강도는 배경 감산 후 ImageJ/Fiji v1.53에서 정량화되어 GAPDH로 정규화되었습니다. 예상 분자량: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, 옥클루딘 ~65 kDa, 클라우딘-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. 각 분석에는 4≥ 5개의 생물학적 복제가 포함되었습니다.

16. 통계 분석

데이터는 GraphPad Prism 8.0에서 분석되었으며, SEM 평균± 제시됩니다. 다그룹 비교에서는 일원 ANOVA 후 Tukey의 사후 검정을 사용했으며; 쌍대 비교의 경우, 적절한 경우 쌍이 없는 양측 학생 t-검정을 적용했습니다. 시간-경로 또는 2요인 설계(예: 용량 × 처리 또는 시간 × 치료)의 경우, 그림 판례에 명시된 대로 투키 또는 던넷 보정과 함께 2자 ANOVA(해당 시 반복 측정)를 사용했습니다. 샤피로-윌크와 레벤의 검정은 모수 검정 이전에 정규성과 동등분포성을 평가하는 데 사용되었다; 가정이 위반될 경우, 데이터는 로그 변환 또는 적절한 비모수 검정(Kruskal-Wallis, Dunn's post hoc; 페어와이즈를 위한 맨-휘트니 대학교). 정확한 p-값과 효과 크기 측정값(ANOVA의 η², t-검정의 코헨의 d)은 해당 시 그림 판례로 보고됩니다. 양측 p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 도표 전설은 다음과 같은 표기법을 사용해 의미를 표기합니다: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 대 컨트롤; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 대 DSS; 중요하지 않다.

17. 기대 결과 및 품질 관리

DSS는 대장 길이를 단축시키고, 질병 활동성 지수를 높이며, 조직학적 손상(지하 구조 왜곡, 고블릿 세포 고갈, 상피 침식)을 유발할 것으로 예상됩니다. DBE 치료는 용량 의존적으로 이러한 지수를 개선하고 장-교세포 활성화 표지를 감소시켜야 합니다. 웨스턴 블롯은 위에 나열된 분자량 밴드를 나타내며, DSS 신호와 DBE 또는 SBI-4211 시 감쇠가 증가해야 합니다; 노출은 선형 동적 범위 내에 있어야 합니다. GFAP와 S100β에 대한 면역형광은 DSS에서 평균 강도가 상승하고 DBE 치료 후 감소를 보여야 합니다. LC-MS/MS 크로마토그램은 기준 이온에 대해 안정적인 보존 시간(드리프트 ≤ 0.2분)과 5 ppm ±이내의 질량 정확도를 보여야 하며, 주요 성분에 대해서는 특성적 조각 이온이 있어야 합니다. 음성 대조군(예: 1차 항체 누락)은 특이적 신호를 제공하지 않아야 합니다. 유효한 정량적 비교를 위해 이미징 획득 매개변수(대관, 노출, 이득, 감마)는 그룹 간에 고정되어야 합니다.

18. 문제 해결 노트

DBE 용액 내 탁도나 입자는 여과 또는 침전이 부족함을 나타냅니다; 0.22 μm 여과를 반복하고 pH 6.5-7.5를 확인한다. DSS 노출 중 과도한 사망률이나 심각한 체중 감소는 과유도를 시사합니다; DSS 농도를 낮추고, 배치 분자량을 확인하며, 매일 DSS 용액을 교체합니다. 불일치한 면역형광 정량은 일반적으로 노출 변화를 반영합니다; 노출 시간과 게인을 수정하고, 배치 보정을 위한 참고 슬라이드를 포함하세요. 약한 웨스턴 블롯 밴드는 부하 부족이나 전달 비효율성을 반영할 수 있습니다; 단백질 정량 확인, 적절한 겔 비율 또는 구배 선택, 가역적 막 염색으로 전달을 확인합니다. ELISA 적합도가 좋지 않다(R² < 0.99 또는 표준 역계산 85-115% 이상)은 표준 곡선을 반복하고 희석된 샘플을 재분석할 필요가 있습니다. qPCR 런을 90-110% 이상의 프라이머 효율로 실행할 경우, 분석 전에 어닐링 온도나 프라이머 농도를 재최적화하세요.

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결과

DBE 성분 및 약물 함유 혈청의 식별

LC-MS/MS는 DBE에서 105개의 고유한 화학 성분을 확인했으며, 질량 오차는 10ppm<. 분자식, 동위원소 패턴, 조각 일치로 확인되었습니다. 주요 분류로는 트리테르펜, 플라보노이드, 비페난트렌, 유기산이 포함되었습니다. 약물 함유 혈청은 공백 뺄셈 후 59개의 DBE 유래 성분을 밝혀냈습니다. 대표적인 TIC는 그림 1A, B에 표시되어 있으며, 전체 주석(이름, 공식, 관찰 m/z, 보존 시간, 오류, 주요 단편)은 보충 표 1에 나타난다. 5가지 생리활성 화합물인 계피산, 피시온, 하이퍼로사이드, 3,4-디하이드록시벤조산, 토멘틱산이 결합 및 기전 분석에 우선순위...

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토론

궤양성 대장염(UC)은 다인성 병인성을 가진 만성 염증성 장 질환입니다. 면역 반응 조절 이상뿐만 아니라 장 상피 장벽 기능 장애와 장내 미생물군 이위들이 잘 알려진 원인이며, 장신경계(ENS) 이상이 UC 진행의 주요 원인으로 점점 더 확인되고 있다²³. 특히, ENS의 구조적 및 기능적 조절 장애는 점막 염증과 질병 중증도를 악화시킬 수 있습니다. 더 나아가, 전임상 연구들은 장내 교세포(EGC) 활성화를 억제하면 UC 모델에서 장 염증과 불안 유사 행동을 감소시키는 것으로 나타났습니다²⁵. 이 결과들은 EGC 활성화가 UC 발병의 핵심 동인임을 시사합니다²⁶.

이 연구는 신경정신질환의 바이오마커이자 EGC 유발 병리에서 염증 촉진 매개체 역할을 ...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 국가중의학국 고수준 중위의학 분야 건설 프로젝트(ZYYSZX-2023256)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
오토독 4.2	분자 도킹 소프트웨어	-	스크립스 연구소
덱트론 황산나트륨 (DSS)	쥐에서 대장염을 유발하는 화학물질	9011-18-1	시그마-올드리치
디바이 관장 액체(DBE)	궤양성 대장염 치료용 한방 혼합물	-	베이징 중의대
DMEM (둘벡코 변형 독수리 중간)	세포 배양 배지	11965-092	써모피셔
태아 소 혈청 (FBS)	세포 배양용 보충제	16000-044	써모피셔
형광 현미경	면역형광 영상 기기	-	올림포스
LC-MS/MS 시스템	LC-MS 분석을 위한 질량분석기	-	워터스 코퍼레이션
지지방다당류(LPS)	세포 배양에서 염증 유도제	L2630	시그마-올드리치
PCR 열 사이클러	qPCR 장비	T100	바이오-래드
1차 항체 (S100)	S100 단백질 검출을 위한 항체	ABC1234	앱캠
단백질 분석 키트(BCA)	단백질 정량화 키트	23225	써모피셔
재조합 인터페론 - (IFN)	세포 배양에서 EGC 활성화를 위한 사이토카인	-	시그마-올드리치
2차 항체(HRP 결합)	면역조직화학을 위한 2차 항체	XYZ5678	써모피셔
설파잘라진 (SASP)	궤양성 대장염에 대한 양성 대조군	-	시그마-올드리치
웨스턴 블롯 장비	단백질 분석을 위한 전기영동 시스템	-	바이오-래드

참고문헌

Lin, D., et al. Global, regional, and national burden of inflammatory bowel disease, 1990-2021: Insights from the global burden of disease 2021. Int J Colorectal Dis. 39 (1), 139(2024).
Le Berre, C., Honap, S., Peyrin-Biroulet, L. Ulcerative colitis. Lancet. 402 (10401), 571-584 (2023).
Cui, Y., et al. Integrated network pharmacology, molecular docking and animal experiment to explore the efficacy and potential mechanism of Baiyu decoction against ulcerative colitis by enema. Drug Des Devel Ther. 17, 3453-3472 (2023).
Rosh, J. R., Gross, T., Mamula, P., Griffiths, A., Hyams, J. Hepatosplenic T-cell lymphoma in adolescents and young adults with Crohn's disease: A cautionary tale. Inflamm Bowel Dis. 13 (8), 1024-1030 (2007).
Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: Lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol. 4, 280(2013).
Capoccia, E., et al. Enteric glia: A new player in inflammatory bowel diseases. Int J Immunopathol Pharmacol. 28 (4), 443-451 (2015).
Sharkey, K. A., Mawe, G. M. The enteric nervous system. Physiol Rev. 103 (2), 1487-1564 (2023).
Fung, C., Boesmans, W., Cirillo, C., Foong, J. P. P., Bornstein, J. C., Vanden Berghe, P. VPAC receptor subtypes tune purinergic neuron-to-glia communication in the murine submucosal plexus. Front Cell Neurosci. 11, 118(2017).
Bubeck, M., Becker, C., Patankar, J. V. Guardians of the gut: Influence of the enteric nervous system on the intestinal epithelial barrier. Front Med. 10, 1228938(2023).
Da Silva Sousa, J. J., et al. Colonic mast cells trigger enteric neuronal death through the S100β/RAGE/NFκB pathway on inflammatory bowel diseases. Med Hypotheses. 170, 111004(2023).
Xie, H., et al. Enteric glial cells aggravate the intestinal epithelial barrier damage by secreting S100β under high-altitude conditions. Mol Biomed. 4 (1), 31(2023).
Grubišić, V., et al. Enteric glia modulate macrophage phenotype and visceral sensitivity following inflammation. Cell Rep. 32 (10), 108100(2020).
Kermarrec, L., Durand, T., Neunlist, M., Naveilhan, P., Neveu, I. Enteric glial cells have specific immunosuppressive properties. J Neuroimmunol. 295 - 296, 79-83 (2016).
Liu, D., et al. Flos lonicerae flavonoids attenuate experimental ulcerative colitis in rats via suppression of NF-κB signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (12), 2481-2494 (2020).
Zhao, Y., et al. Gegen Qinlian decoction maintains colonic mucosal homeostasis in acute/chronic ulcerative colitis via bidirectionally modulating dysregulated Notch signaling. Phytomedicine. 68, 153182(2020).
Zhu, L., Gu, P., Shen, H. Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats. Int Immunopharmacol. 68, 242-251 (2019).
Zhang, S., et al. International clinical practice guideline on the use of traditional Chinese medicine for ulcerative colitis by Board of Specialty Committee of Digestive System Disease of World Federation of Chinese Medicine Societies (2023). Phytother Res. 38 (2), 970-999 (2024).
He, X., et al. Bletilla striata: Medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 195, 20-38 (2017).
Kumari, M., et al. Acacia catechu (L.f.) Willd.: A review on bioactive compounds and their health promoting functionalities. Plants. 11 (22), 3091(2022).
Yasueda, A., et al. Sanguisorba officinalis L. derived from herbal medicine prevents intestinal inflammation by inducing autophagy in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 9972(2020).
Garg Jyoti, V. Acacia catechu Willd. and Acacia arabica Willd. decrease the extent of anxiety behavior by reducing oxidative stress and moderating neurochemicals. J Ethnopharmacol. 312, 116496(2023).
Ban, J. Y., et al. 3,4-Dihydroxybenzoic acid from Smilacis chinae rhizome protects amyloid β protein (25-35)-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons. Neurosci Lett. 420 (2), 184-188 (2007).
Olech, M., Ziemichód, W., Nowacka-Jechalke, N. The occurrence and biological activity of tormentic acid: A review. Molecules. 26 (13), 3797(2021).
Wang, Q., et al. Hyperoside: A review on its sources, biological activities, and molecular mechanisms. Phytother Res. 36 (7), 2779-2802 (2022).
Xun, L., et al. Physcion and physcion 8-O-β-glucopyranoside: A review of their pharmacology, toxicities and pharmacokinetics. Chem Biol Interact. 310, 108722(2019).
Cirillo, C., et al. Increased mucosal nitric oxide production in ulcerative colitis is mediated in part by the enteroglial-derived S100B protein. Neurogastroenterol Motil. 21 (11), 1209-e112 (2009).
Li, Y., et al. Inhibiting the activation of enteric glial cells alleviates intestinal inflammation and comorbid anxiety- and depressive-like behaviors in the ulcerative colitis mice. Neurochem Int. 178, 105789(2024).
Cirillo, C., et al. S100B protein in the gut: The evidence for enteroglial-sustained intestinal inflammation. World J Gastroenterol. 17 (10), 1261-1266 (2011).
Esposito, G., et al. Enteric glial-derived S100B protein stimulates nitric oxide production in celiac disease. Gastroenterology. 133 (3), 918-925 (2007).
Yang, Y. H., Qian, W., Hou, X. H., Dai, C. B. Bifidobacterium bifidum and Bacteroides fragilis induced differential immune regulation of enteric glial cells subjected to exogenous inflammatory stimulation. Inflammation. 45 (6), 2388-2405 (2022).
Le Berre, C., Naveilhan, P., Rolli-Derkinderen, M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 809, 137315(2023).
Schroeter, M. L., et al. Mood disorders are glial disorders: Evidence from in vivo studies. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2010, 780645(2010).
Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (12), 720-727 (2015).
Fan, M., et al. Electroacupuncture at ST36 relieves visceral hypersensitivity based on the vagus-adrenal axis in the remission stage of ulcerative colitis. Neuromodulation. 28 (5), 812-824 (2025).
Lechner, M., Lirk, P., Rieder, J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: The two sides of the same coin. Semin Cancer Biol. 15 (4), 277-289 (2005).
Nomura, Y. NF-kappaB activation and IkappaB alpha dynamism involved in iNOS and chemokine induction in astroglial cells. Life Sci. 68 (15), 1695-1701 (2001).

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한방 관장 포뮬러는 S100β/RAGE/NF-κB 경로를 통해 장내 교세포 활성화를 억제하여 궤양성 대장염을 완화합니다

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