방법 논문

포유류의 대량 배란: Lagostomus maximus의 자연 자발 다배란 및 유도 다배란 분석 기법

DOI:

10.3791/69653

⸱

2026년 2월 6일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudios Biomédicos Básicos, Aplicados y Desarrollo (CEBBAD), Universidad Maimónides, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 자연 배란과 유도 배란을 분석하는 방법을 설명하며, 자연, 호르몬 유도 또는 정액 혈장 유도 배란 후 난자 회복을 포함합니다. 이 연구는 고다배란성 포유류 모델에서 난소 반응성과 생식 생리학을 연구하는 포괄적인 틀을 제공합니다.

초록

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남아메리카 평원 비스카차( Lagostomus maximus)는 배란율이 가장 높은 포유류 종으로 알려져 있으며, 배란율은 최대 300개에 달합니다. 이 놀라운 다배란 현상은 독특한 생식 생리학을 반영하는 여러 방법론적 접근법을 통해 연구할 수 있습니다. 자연 배란은 번식기 동안 난자 방출로 평가되며, 이는 난관과 자궁 뿔을 세척하여 난자를 회수하여 종의 자발 배란 메커니즘에 대한 통찰을 제공합니다. 또한, 생식선자극제와 같은 외부 호르몬을 이용한 배란 유도를 실험적으로 수행하면 난소 반응성을 통제할 수 있게 되어, 히스트리코그나스 설치류의 내분비 조절을 이해하는 데 유용한 모델을 제공합니다. 세 번째 접근법은 자가정액혈장을 배란의 생리적 유발 요인으로 사용하는 것으로, 이 종에서 유도된 기전과 자발적 기전의 공존을 강조합니다. 이 기술들은 모낭 모집과 난자 방출의 역학을 밝힐 뿐만 아니라, L. maximus 를 생식 생물학의 비교 모델로 자리매김하게 하여 포유류의 배란 조절 이해에 잠재적 번역적 시사점을 지니게 합니다.

서론

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남아메리카 평원 비스카차(Lagostomus maximus)는 뛰어난 생식 생리학으로 구별되는 히스트리코그나스 설치류로, 주기당 300개의 난자를 초과할 수 있는 놀라운 배란율이 특징이다 1,2. 이 독특한 특징은 L. maximus를 포유류의 난소 기능과 배란 조절을 연구하는 자연스러운 모델로 자리매김하게 했습니다 3,4,5,6,7,8,9,10,11.

일반적인 자발 배란자와 달리, L. maximus는 자발적 배란과 유도 배란 기전 모두를 보인다2. 이 이중성은 대규모 난포 성장과 비동기 배란과 결합되어 내분비 또는 조직학적 종말에만 근거한 기존 접근법에 도전한다 4,12,13,14. 따라서 난자 방출의 시기와 크기를 정확히 결정하기 위해서는 직접적이고 정량적인 기법의 사용이 필수적입니다.

성체 암컷 비스카차는 아르헨티나 부에노스아이레스 주 베라사테기의 페레라 이라올라 공원(Estación de Cría de Animales Sirvestres, ECAS, 34°49′57" S, 58°06′12" W 등)에서 자연적으로 거주하는 개체군에서 채취되었습니다. 우리는 천연자원에 대한 주권 권리가 부에노스아이레스 주의 독점 재산임을 인정합니다. 포획된 가축 수는 부에노스아이레스 주 농업부에서 승인한 것입니다. 암컷은 연중 여러 시점에 굴 입구에 설치된 생포를 이용해 포획되었습니다.

포획 기간은 Llanos & Crespo15가 설정한 종의 자연 생식 주기에 따라 선정되었고, 현장 경험 7,8,10,14를 바탕으로 정밀하게 조정되었습니다. 이 종은 늦여름(3월)부터 봄이 시작되는 9월 말까지 주요 번식기를 가지며, 특히 새끼를 잃은 암컷의 경우10월에 2차 번식기가 시작됩니다. 이에 따라 다음과 같은 작업 그룹이 결정되었습니다: a) 그룹 I (N= 27): 2월 말부터 4월 초(임신 없음, 주요 생식기 시작); b) 그룹 II (N= 26): 9월 중순부터 10월 말까지 (비임신, 수유 후 발정); 그룹 III (N= 35): 12월-1월 (비임신, 호르몬 유발 배란); 그룹 IV (N= 7): 12월-1월 (비임신, 정액 혈장 유도 배란).

본 연구는 L. maximus의 배란을 분석하기 위한 여러 방법론적 접근법을 제시하고 검증합니다: (1) 직접 난자 회복을 통한 자연 배란 평가; (2) 외인성 생식선자극호르몬을 이용한 배란 유도; 그리고 (3) 자가정액혈장을 이용한 배란 유도. 각 기법은 난포 역학, 난자 성숙, 배란을 조절하는 조절 메커니즘에 대한 상호 보완적인 통찰을 제공합니다.

난관과 자궁 뿔의 세척은 난자의 직접 회수와 배란의 정확한 정량화를 가능하게 하여 난포 발달 및 난자 형태와 상관관계를 가능하게 합니다 19,20,21. 실험실 설치류에서 사용된 프로토콜을 변형한 외인성 생식선자극제 호르몬 자극22는 난소 반응성과 난자 방출 시기를 통제하여 평가할 수 있게 합니다. 한편, 토끼와 낙타과 같은 유도 배란자에서 이전에 설명된 자가정액혈장을 생리적 배란 유발 요인으로 사용하는 것(23,24,25)은 배란에 관여하는 내분비 및 부분비 인자를 탐구하는 혁신적인 방법을 제시합니다.

이러한 상호 보완적인 방법론을 통합함으로써, 본 연구는 L. maximus의 배란 기전 연구를 재현 가능한 틀로 제공합니다. 자연 모델과 유도 모델의 조합은 자발적 난포 모집, 배란 효율, 정액 혈장 매개 반응 간의 구분을 가능하게 합니다. 더불어, 이러한 접근법은 자발적 단위생식 난자 활성화와 '결함' 및 '정배' 난자의 공존과 같은 현상을 밝혀내어 난포 선택과 난자 능력 이해에 기여합니다.

종별 특이적 함의를 넘어, 비즈카차 모델은 비교 생식생물학에 더 넓은 의미를 제공합니다. 이 혼합 배란 전략은 유도 배란자와 자연 배란자의 특성을 연결하여, 가축종과 인간을 포함한 다른 포유류의 생식 과정과 귀중한 유사점을 제공합니다 7,14,26,27.

여기에 상세히 설명된 방법론적 프로토콜은 재현성을 보장하고 난포 역학, 배란 조절, 호르몬 조작 등 다양한 실험 환경에 적응할 수 있도록 설계되었습니다.

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프로토콜

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여기에 기술된 실험 프로토콜은 실험동물 사용 및 관리 기관 위원회(CICUAE, Universidad Maimónides, 프로토콜 번호 #6184)에 의해 검토 및 승인되었습니다. 포획, 취급, 안락사는 훈련된 기술 직원에 의해 수행되었으며, 실험실 동물의 관리와 사용을 규율하는 모든 지역, 주, 연방 규정을 준수했습니다. 동물 사육은 미국 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 지침28 과 미국 포유류학회(ASM)의 야생 포유류 연구 지침29를 따랐습니다. 모든 실험은 ARRIVE 2.0 지침을 준수했습니다30. 사용되는 동물 수를 최소화하기 위해 모든 노력이 기울여졌습니다. 남아메리카 평원 비스카차(Lagostomus maximus)는 멸종 위기종으로 간주되지 않습니다31.

1. 배란의 호르몬 유도

참고: 이 섹션은 포획된 비스카카스의 비임신 암컷에서 배란의 호르몬 유도 과정을 소개합니다. 세 가지 다른 프로토콜 옵션에 대해 논의합니다.

  1. 프로토콜 A:
    1. 0시와 24시마다 200 IU의 말 융모성 생식선자극호소핀(eCG)을 근육 주사로 투여하고, 이어 48시간에 500 IU의 인간 융모성 생식선자극호소핀(hCG)을 투여합니다.
    2. 암컷은 안락사 전까지 휴식을 취하세요.
    3. 암컷은 hCG 투여 후 60-132시간 이내에 안락사하세요(3절 참조).
  2. 프로토콜 B:
    1. 0시와 24시간에 근육주사 200 IU의 eCG를 투여하고, 72시간에 1,000 IU의 hCG를 투여합니다.
    2. 암컷은 안락사 전까지 휴식을 취하세요.
    3. 암컷은 hCG 투여 후 60-132시간 이내에 안락사하세요(3절 참조).
  3. 프로토콜 C:
    1. 0시, 24시간, 48시간에 근육주사로 250 IU의 eCG를 투여하고, 72시에 2mg의 돼지 황체형성호르몬(pLH)을 투여합니다.
    2. 암컷은 안락사 전까지 휴식을 취하세요.
    3. pLH 투여 후 60-132시간 내에 암컷을 안락사시킨다(3절 및 표 1 참조).
      참고: 각 그룹의 동물들은 hCG 투여 후 60시간에서 132시간 사이 서로 다른 시점에 안락사되었습니다. 이 시간적 분포는 이 종의 배란 기간이 길다는 점을 확인하는 데 필수적이었습니다. 특히 성숙 난자만 독점적으로 수집하는 실험에서는 hCG 후 120시간에 안락사가 일관되게 시행되었습니다.

2. 정액 혈장에 의한 배란 유도

참고: 호르몬이 자극받은 여성에서 근육 내 투여로 배란을 유도하는 정액 혈장의 능력을 검사합니다.

  1. 정액 수집 및 준비
    1. Giacchino32가 설명한 대로 생식 활동 남성의 정액을 전기사정으로 채취합니다.
    2. 200 × g에서 정액을 10분간 실온에서 원심분리하여 정자와 세포 잔해를 제거합니다.
    3. 상청액(정액 혈장)에 페니실린과 스트렙토마이신을 보충하여 -20 °C에서 보관하여 사용 후까지 보관하세요.
  2. 정액 혈장에 의한 비임신 여성의 배란 유도
    1. 여성 각각에게 0시와 24시간에 근육주사 200 IU의 eCG를 투여합니다.
    2. 최종 eCG 투여 후 48시간 후에 정액 혈장을 근육 주사로 주입하세요.
    3. 암컷은 안락사 전까지 휴식을 취하세요.
    4. 정액 혈장 주사 후 72시간 이내에 동물을 안락사시키세요(3절 참조).
      참고: 정액 혈장 대신 식염수 주사를 받은 대조군 여성도 포함하세요.

3. 마취, 안락사 및 생식관 채취

참고: 난자 및 조직학적 분석을 위해 온전한 생식관을 확보하기 위해 마취 및 인도적 안락사 방법을 사용하세요.

  1. 제조사의 권고와 정해진 제도적 프로토콜에 따라 13.5 mg/kg 케타민 염화산과 0.6 mg/kg 자일라진 염화산염화산을 단 한 번의 계산된 근육 주사로 안락사를 유도합니다.
  2. 통증에 대한 반응이 없다는 점(발달 반사)으로 깊은 마취를 확인하세요.
  3. 동물을 등을 대고 눕히고 복부를 소독하세요.
  4. 복강을 수술로 열어 모든 복부 장기를 완전히 노출시켜.
  5. 동물의 전반적인 상태를 파악하고 배란성 성흔이 존재하여 자연 또는 호르몬에 의해 유도된 배란인지 일반 검사를 수행하세요.
  6. 혈청학적 검사를 위해 상대정맥을 직접 천공하여 혈액 샘플을 채취하세요.
  7. 동물에게 0.5 mL/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 심내 투여하여 안락사를 시행합니다.
  8. 난소, 난관, 자궁 뿔을 조심스럽게 해부하고 제거하되, 구조를 손상시키지 않도록 주의하세요.
  9. 조직은 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)에 보관하여 처리(≤15분)까지 보관합니다.

4. 난자 회복

참고: 난관과 자궁 뿔에서 난자를 부드럽게 세척하여 조직 손상을 최소화하면서 방출된 생식세포를 완전히 수집할 수 있도록 하세요.

  1. 세척 장치를 0.9% NaCl에 4 mg/mL BSA, 100 μg/mL 페니실린 G, 100 IU/mL 스트렙토마이신이 보충된 1 mL 주사기에 연결하여 세척 장치를 준비합니다.
  2. 각 난관의 안도에 부드럽게 바늘을 삽입하고 천천히 세척액을 주입하세요.
  3. 원위 난관과 자궁 뿔에서 배출된 분수를 멸균 페트리 접시에 모으세요.
  4. 회수된 액체가 투명하고 난자나 세포 이물질이 없는 것처럼 보일 때까지 반복 세척을 하세요.
  5. 난모세포를 광유 아래 4 mg/mL BSA와 항생제가 포함된 100 μL M2 배지에 이송합니다.
  6. 입체현미경으로 비말을 검사하여 성공적인 회수 여부를 확인; 적운 세포가 없는 자유 난자세포가 액체 내에 분산되어 있는 것을 관찰할 것으로 예상됩니다.
  7. 배출물이 투명해 보이고 입체현미경에서 추가 난자가 관찰되지 않을 때까지 계속 세척합니다(보통 난관당 3-5번 세척).
    참고: 회수된 난자는 저배율 시에도 구형이고 반투명하게 보여야 합니다.
  8. 6절에서 설명한 형태학적 완전성에 따라 난자를 분류합니다.

5. 난자 형태학적 평가

참고: 회수된 난자의 질은 세포질 외관, 투명 지대의 균일성, 핵 성숙 단계를 기준으로 평가합니다.

  1. 난자가 구형, 균일한 투명대, 균질한 반투명 세포질, 그리고 눈에 띄는 생식소포 또는 첫 극체를 보여야 정상으로 식별할 수 있습니다.
  2. 세포질이 어둡거나 과립적이거나 단편적이거나 실질대가 불규칙할 경우 난자세포를 비정상으로 식별합니다.
  3. 핵 성숙 단계를 생식소포(GV), 생식소포붕괴(GVBD), 또는 중기 II기(MII)로 기록합니다.

6. 난자 핵 성숙 및 감수분열 방추 무결성 평가

참고: α-튜불린의 면역형광 염색과 염색질 역염색을 통해 핵 성숙과 방추 형태를 평가합니다.

  1. 난자를 2% 파라포름알데히드(PFA)에 20분간 고정하세요.
  2. PBS에 0.2% Triton X-100을 40분간 투과시킵니다.
  3. 고정 후 2% PFA에 20분간 세척하고, PBS에 세 번(각각 30분씩) 세척합니다.
  4. 2% 염소 혈청, 2% BSA, 2% 분유, 0.1M 글리신, 0.01% Triton X-100을 PBS에 넣어 ≥ 1시간 동안 블록 보관하세요.
  5. 난모세포를 4°C에서 하룻밤 동안 마우스 항α-튜불린 항체(1:200)와 함께 배양합니다.
  6. PBS에 30분간 세척한 후 어두운 곳에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 결합된 염소 항생쥐 IgG(1/1000)와 함께 인큐베이팅합니다.
  7. 10 μg/mL Hoechst 33324로 10분간 교환 염색을 하고, 2% BSA가 포함된 PBS로 세척합니다.
  8. 난자를 안티페이드 배지에 마운트하고 공초점 현미경을 사용해 영상화합니다.
  9. EZ-C1 소프트웨어(EZ-C1 버전 3.90)를 사용하여 이미지를 캡처하고 처리할 수 있습니다; 이미지 처리 소프트웨어에서 필요에 따라 대비와 밝기를 조정할 수 있습니다.
    참고: 성공적인 염색은 감수분열 방추(FITC)의 명확한 녹색 형광 패턴과 Hoechst 33324로 인한 청색 핵 염색으로 표시됩니다.

7. 통계 분석

참고: 실험군 간 배란 반응과 난자 질을 비교하기 위해 정량적 데이터를 분석합니다.

  1. 데이터를 표준± 표준으로 표현하세요.
  2. 두 그룹 비교에는 학생 t-검정을 사용하세요.
  3. 일원 ANOVA를 적용한 후 Bonferroni의 사후 검정을 적용하여 다중 비교를 수행합니다.
  4. p < 0.05를 통계적으로 유의하다고 생각하세요.

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결과

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자연 배란

2월 말부터 4월 중순, 즉 1차 번식기와 일치하는 동안 포획된 27마리 암컷(그룹 I) 중 12마리가 배란 중이었으나, 2차 번식기(9월/10월)(그룹 II)에는 포획된 암컷 26마리 중 10마리가 배란을 보였습니다. 두 포획 기간 모두 약 40%의 배란 성공률이 관찰되었습니다. 난관 구부 부위의 부종은 전혀 관찰되지 않았으며, 배란 암술 실무 여부와 관계없이 암컷의 난자도 채취되었다(그림 1A, B). 난모세포는 적운 세포에 둘러싸이지 않은 상태에서 채취되었습니다(그림 1C, 표 2).

전체 평균 여성당 난자 수는 154개(± 87개)였으며, 범위는 29에서 326에 이르렀다. 이는 I군(198± 92[평균 + 표준편],...

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토론

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여기서 제시된 평원 비스카차 배란 연구 프로토콜은 자연 배란과 실험적으로 유도된 배란 사건을 모두 평가할 수 있는 재현 가능한 틀을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 평원 비즈카차에서 방출되는 매우 많은 난자를 직접 정량화하고 특성화할 수 있다는 점으로, 이는 다른 포유류 모델에서 볼 수 없는 특징입니다. 호르몬 프로필이나 조직학적 절편에 기반한 간접 방법과 달리, 난관 및 자궁 세척은 온전한 난자에 즉각적으로 접근할 수 있어 정량적 및 정성적 분석을 모두 가능하게 합니다. 이 접근법은 또한 수정 가능성과 형태학적 질 평가에 중요한 적운-난자 복합체(COCs)의 무결성을 보존합니다.

또 다른 장점은 방법론적 유연성입니다. 자연 배란과 호르몬 유도 또는 정액 혈장 유도 배란을 결합함으로써, 동일 종 내에서 서로 다른 배란 유발 요인을 비교 분석할 수 있게 합니다. 이러한 다재다능함은 연구자들이 배란 과정에 대한 내분...

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공개 사항

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저자들은 보고된 연구의 공정성을 해칠 수 있는 이해 상충이 없다고 주장합니다.

감사의 글

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이 작업은 아르헨티나 마이모니데스 대학교의 교내 재정 지원과 아르헨티나 FONCYT-AMPCYT 기관(PICT-2018-04619, NPL에 수여됨)의 지원을 받았습니다. 저자들은 특히 아르헨티나 부에노스아이레스 주 농업청이 동물 포획을 허가해 준 것에 대해 감사드립니다; 동물 포획과 취급에 귀중한 도움을 준 에스타시온 데 크리아 데 동물 실베스트레스(ECAS, 아르헨티나 부에노스아이레스 주) 직원들에게도 감사를 표합니다; 그리고 마취 및 수술 절차 중 도움을 준 CCV-마이모니데스 대학교의 세르지오 페라리스 수의사와 페르난도 랑게 수의사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
어도비 포토샵어도비 시스템즈, 미국해당 없음이미지 처리
소 혈청 알부민 (BSA)시그마-올드리치, 미국A9647플러싱 매체와 블로킹 버퍼에 사용됩니다
원심분리기 (정액 처리용)에펜도르프, 독일5417R정액 플라즈마 준비
공초점 현미경 (C1 이클립스 E800)니콘 주식회사, 일본해당 없음난자 영상
전기 사정기실험실에서 설계되었으며; 카비오모프 설치류에 사용하기 위해 집포류에서 개조된해당 없음정액 수집
유탄닐 (펜토바르비탈나트륨, 디페닐히단토인나트륨)브라우어 S.A., 아르헨티나해당 없음안락사
FITC 결합 염소 항생쥐 IgG (AP124F)케미콘, 미국AP124F2차 항체
헤마톡실린-이오신 염색 키트시그마-올드리치, 미국다양한조직학
호에슈트 33324서모 피셔 사이언티픽, 미국H3570핵 염색
케타민 염화화물홀리데이 스콧 S.A., 아르헨티나해당 없음마취
층류 후드미국 열모과학해당 없음무균 취급
광학 현미경올림푸스, 일본BX51조직학
루트로핀-V (pLH)바이오니치 동물 건강 관리, 캐나다해당 없음호르몬 유도
M2 중형시그마-올드리치, 미국M7167난자 회복
광유시그마-올드리치, 미국M8410난자 배양
노보몬 5000 (eCG)신텍스 S.A., 아르헨티나해당 없음호르몬 유도
오부신 (hCG)신텍스 S.A., 아르헨티나해당 없음호르몬 유도
파라포름알데히드 (PFA, 2% 및 4%)시그마-올드리치, 미국158127고정
페니실린 G시그마-올드리치, 미국P3032매체용 항생제
입체 현미경라이카 마이크로시스템즈, 독일M80난자 식별
스트렙토마이신깁코, 서모피셔 사이언티픽, 미국11860038매체용 항생제
무딘 끝 바늘이 달린 주사기 (1 mL)BD 바이오사이언스, 미국305219난관/자궁의 홍조
트리톤 X-100시그마-올드리치, 미국T8787투과화
벡타쉴드 장착 매체벡터 연구소, 미국H-1000형광 장착
자일라진 염화화물아르헨티나 리치먼드 연구소해당 없음마취
자일렌시그마-올드리치, 미국534056파라핀 단면 탈왁
&알파-튜불린 단클론 항체 (마우스 항-&알파;-튜불린, SC-5286 B7)산타크루즈 바이오테크놀로지, 미국SC-5286 B7감수분열 방추 면역염색을 위한

참고문헌

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  3. Caram, D. A., Inserra, P. I. F., Vitullo, A. D., Leopardo, N. P. Autophagy favors survival of corpora lutea during the long-lasting pregnancy of the South American plains vizcacha, Lagostomus maximus (Rodentia Caviomorpha). Sci Rep. 14 (1), 11220(2024).
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  8. Jensen, F., Willis, M. A., Leopardo, N. P., Espinosa, M. B., Vitullo, A. D. The ovary of the gestating South American plains vizcacha (Lagostomus maximus): suppressed apoptosis and corpora lutea persistence. Biol Reprod. 79, 240-246 (2008).
  9. Leopardo, N. P., Jensen, F., Willis, M. A., Espinosa, M. B., Vitullo, A. D. The developing ovary of the South American plains vizcacha, Lagostomus maximus (Mammalia, Rodentia): massive proliferation with no sign of apoptosis-mediated germ cell attrition. Reproduction. 141, 633-641 (2011).
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