나이메헌 혈류 분석 분석: 단일 웰에서 트롬빈과 플라스민 생성의 동시 형광 생성 측정

요약

이 프로토콜은 동시적이고 시간 측정된 트롬빈과 플라스민 생성을 가능하게 하여 응고와 섬유소용해를 통합적으로 평가할 수 있는 나이메헌 혈류 측정법을 설명합니다. 이 검사는 기존 정혈성 검사의 범위를 넘어 연구 및 임상 환경에서 정혈 균형의 특성 규명을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

초록

트롬빈과 플라스민은 각각 응고와 섬유소용해를 조절하는 중심적인 역할을 합니다. 기존의 정혈 분석은 종종 분리된 성분이나 제한된 단계의 지혈에 초점을 맞추며; 예를 들어, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간과 프로트롬빈 시간은 피브린 형성의 시작만을 평가하는 반면, 인자 활성 분석은 개별 응고 인자의 기능을 평가합니다. 이러한 검사들은 가치가 있지만, 시간에 따라 동적으로 전개되는 2차 지혈 및 섬유소 용해의 전체 과정을 포괄적으로 파악하지 못합니다. 나이메헌 지혈 분석법(NHA)은 단일 마이크로플레이트 웰에서 트롬빈과 플라스민 생성을 동시적이고 시간 분해 방식으로 측정함으로써 이 한계를 해결합니다. 서로 다른 여기 및 방출 스펙트럼을 가진 두 가지 합성 플루오로생성 기판을 사용하여 교차 반응성이 없으므로 두 효소를 병행하여 정확한 정량화가 가능합니다. 혈소판 부족 혈장에서 조직 인자, 칼슘 및 조직형 플라스미노겐 활성화제를 사용하여 혈전을 시작하며, 37 °C에서 70분 동안 30초마다 형광이 기록됩니다. 효소 활성 곡선은 교정 표준을 사용하여 생성되며, 이를 통해 지연 시간, 트롬빈 전위, 섬유소 용해 시간, 플라스민 피크 높이와 같은 매개변수를 도출합니다. 이 분석법은 우수한 검사 내 및 검사 간 정밀도로 동시에 발생하는 트롬빈과 플라스민을 포착하며, 헤파린, 활성화 단백질 C, 엡실론-아미노카프로산 등 효과체에 의한 응고 및 섬유소 용해의 조절을 감지합니다. 임상 샘플에서는 응고인자 결핍 환자에서 혈소빈 생성이 유의미하게 감소한 반면, 섬유소용해성 질환 환자에서는 플라스민 생성 프로필이 상승하는 것이 관찰되었습니다. 트롬빈과 플라스민 생성 측정을 결합함으로써, NHA는 기존 분석법을 넘어 정혈 균형에 대한 포괄적인 통찰을 제공합니다. 이러한 통합 접근법은 정혈 표현형 특성화, 출혈 및 혈전성 위험 평가, 표적 치료 중재 모니터링 등 연구 및 임상 응용 분야에서 가능성을 지니고 있습니다. 이 프로토콜은 정혈 균형에 대한 이해와 평가를 향상시키기 위한 NHA 절차를 설명합니다.

서론

지혈은 응고와 섬유소용해의 역동적 균형의 결과입니다. 트롬빈과 플라스민이 이 과정을 구동하는 핵심 효소입니다: 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환하고, 플라스민은 피브린을 분해하여 혈전을 녹입니다. 이 균형이 깨지면 출혈이나 혈전성 사건이 발생할 수 있습니다 ^1,2. 그러나 임상 실무에서 지혈을 평가하는 실험실 검사는 일반적으로 응고나 섬유소용해의 개별 단계에 초점을 맞추어 전체 정혈 균형에 대한 통찰을 제한합니다. 출혈 경향이 의심되는 환자에게는 프로트롬빈 시간(PT)과 활성화 부분 혈전플라스틴 시간(aPTT)과 같은 일상적인 선별 검사가 응고인자 결핍을 선별하기 위해 흔히 사용됩니다. 그러나 이러한 검사들은 초기 섬유소 형성까지의 시간을 측정하며, 혈전 시작 이후의 트롬빈 생성은 포착하지 못합니다. 혈전 시작 시점에서 생리학적으로 가장 중요한 트롬빈 활동^{이 가장 많이} 발생하는 ^1,2,3. 따라서 경미한 응고인자 결핍 3,4,5,6,7,8 환자에서는 정상 결과를 얻을 수 있습니다. 이러한 특정 결핍을 식별하기 위해 응고인자 활성 검사가 사용됩니다. 진단에 유익하지만, 이 분석들은 개별 단백질을 분리하여 평가하며 전체 정혈 균형을 반영하지 않습니다. 그 결과, 경미한 결핍 환자에서는 인자 수치가 출혈 표현형과 상관관계가 떨어지는 경우가 많습니다 ^9,10. 이로 인해 임상 위험 평가와 치료 시기 및 용량 최적화, 혈전성 또는 중증 출혈 사건에 대한 개입 등 환자 관리 최적화가 복잡해집니다. 이러한 한계는 시간에 따른 지혈 과정을 보다 포괄적으로 볼 수 있는 검사법의 필요성을 강조하며, 실험실 결과와 임상 증상 간의 간극을 메우는 데 도움이 될 수 있습니다.

나이메헌 지혈 분석법(NHA)은 혈소판 부족 혈장 ^8,9에서 트롬빈과 플라스민 생성을 동시, 시간 분해 측정하여 이러한 한계를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 서로 다른 여기 및 방출 스펙트럼을 가진 두 가지 합성 플루오로생성 기판을 사용하여 동일한 마이크로플레이트 내에서 두 효소를 교차반응성 없이 정량화합니다. 효소 생성 곡선은 2차 응고와 섬유소용해의 역학을 반영하는 정량적 매개변수(지연 시간, 트롬빈 피크 높이, 피브린 용해 시간, 플라스민 피크 높이 등)를 도출할 수 있게 합니다. NHA는 기존의 트롬빈 생성 검사(Calibrated Automated Thrombogram, CAT), Ceveron s100, ST Genesia와 같은 여러 장점을 제공합니다. 이들은 트롬빈 역학에 대한 귀중한 정보를 제공하지만 섬유소 용해 활성을 평가하지 않습니다 10,11,12,13. 혈전 용해 분석은 섬유소 용해의 일부 측면을 포착하지만 트롬^{빈 생성에} 대한 정보는 부족합니다. 이로 인해 전체 지혈 균형을 결정하는 복잡한 상호작용을 평가하는 데 있어 이들의 유용성이 제한됩니다. 일부 실험실에서 개발된 접근법은 트롬빈과 플라스민 생성 측정을 결합하지만, 이는 일반적으로 별도의 웰 또는 병렬 분석이 필요하여 시간적 정렬과 처리량이 제한됩니다^. 혈전전형성검사(TEG)와 회전혈전탄세포측정법(ROTEM)과 같은 전지구적 검사는 1차 지혈, 2차 응고, 섬유소 용해를 포착하여 보완적인 정보를 제공합니다^16,17. 플로우 챔버 시스템은 유동 조건¹⁸에서 완전 지혈을 평가하기 위한 또 다른 새롭고 실험적인 접근법을 대표합니다. 이러한 글로벌 검사들은 더 넓은 생리학적 맥락을 제공하지만, 일반적으로 경미한 출혈 장애에 대해서는 덜 민감합니다 19,20,21. NHA는 동일한 반응 우물에서 트롬빈과 플라스민 생성을 동시에 측정함으로써, 기존 TGA의 민감도와 전반적 분석의 통합 관점을 결합하여 2차 지혈, 섬유소용해, 이들의 상호작용을 직접 평가할 수 있게 합니다.

트롬빈 생성 분석은 이미 개별 출혈 및 혈전성 위험 프로파일링과 치료 모니터링 같은 번역 응용 분야에서 상당한 가능성을 보여주고 있습니다 ^22,23,24,25. 임상 연구에서 NHA는 혈우병 A, 혈우병 B, 희귀 응고인자 결핍 환자에서 트롬빈 생성 감소와 α2-항플라스민 결핍증과 같은 고섬유소 용해 상태에서 플라스민 생성 증가를 입증^{했습니다.} 출혈과 혈전증 위험 증가와 관련된 저섬유소원혈증 환자에서도 두 경로의 차이가 관찰되었습니다. 이 집단에서는 피브리노겐 수치가 낮을수록 플라스민 생성이 감소했는데, 이는 플라스미노겐 결합 부위의 부재로 인해 발생한 것으로 보이며, 혈전증 병력이 있는 환자들은 트롬빈 생성 증가를 보였다³⁰. 또한, 이 검사는 항응고제, 응고촉진제, 항섬유소용해제(⁸)를 포함한 치료제의 효과를 검출합니다. 이전 연구에서는 재현성을 높이고 연구 및 실험실 간 결과 비교를 가능하게 하기 위한 표준화 및 정규화 접근법을 제안했으며, 이는 임상 구현을 위한 필수적인 단계입니다²⁸. 이 프로토콜은 임상 연구 또는 중개 연구 환경에서 NHA의 전체 절차와 분석 접근법을 개괄합니다.

프로토콜

인간 혈장 샘플을 포함한 모든 절차는 기관 지침에 따라 수행되었으며 아른험-나이메헌 의료 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 샘플 채취 전에 모든 기증자로부터 서면 동의서를 받았습니다.

1. 완충제, 시약 및 혈장 샘플의 준비

1. 완충액 준비
   1. 1.2g Tris(p.a.)를 무게로 하고 0.9% NaCl 180mL에 녹입니다.
   2. HCl을 사용해 pH를 7.4로 조절하세요.
   3. 최종 부피를 200 mL에 0.9% NaCl을 넣어 50 mM Tris-150 mM NaCl 버퍼(TBS)를 얻습니다.
   4. TBS를 50mL 튜브 두 개에 나눠 나눠 주세요.
   5. 남은 100mL TBS를 사용해 칼슘 함유 완충제를 준비하세요. 7.34g CaCl₂·2H₂O를 100mL TBS에 용해하여 Tris-NaCl-CaCl₂ 버퍼(TBS-Ca, pH 7.4)를 얻습니다.
   6. TBS-Ca를 두 개의 50mL 튜브에 나누어 분할 배치하세요.
   7. 두 완충 모두 4°C에 보관하고 일주일 이내에 사용하세요.
2. 플루오로생성 기판 준비
   1. 트롬빈 기질 53.2 mg(Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC)을 4 mL의 Tris-NaCl 버퍼에 용해합니다.
      참고: 상자에는 분석 증명서가 담긴 전단지가 들어 있습니다. 첨가할 완충제의 양은 지정된 농도에 따라 다르며, 120 μL 시약에 1 μL 인간 트롬빈이 첨가되면 최종 농도가 76 nmol/L가 되도록 조절해야 합니다.
   2. 에펜도르프 튜브에 100 μL 분비하여 −80 °C에서 보관합니다.
   3. 사용 전에 트롬빈 특이적 플루오로생성 기질을 실온에서 10분간 해동하세요. 실험 중에는 소용돌이로 얼음 상태를 유지하세요.
   4. 플라스민 기질(CBZ-L-Phe-Arg-rhodamine) 한 바이알의 내용을 1,955 μL DMSO에 용해합니다.
      참고: 상자에는 분석 증명서가 담긴 전단지가 들어 있습니다. 첨가할 완충제의 양은 지정된 농도에 따라 다르며, 120 μL 시약에 1 μL 인간 플라스민을 첨가하면 최종 농도가 200 nmol/L가 되도록 조절해야 합니다.
   5. 에펜도르프 튜브에 60 μL를 담아 −80 °C에서 보관합니다.
   6. 사용 전에 실온에서 10분간 플라스민 특이적 형광생성 기판을 해동하세요. 실험 중에는 소용돌이 상태를 유지하고 상온에 보관하세요.
      참고: 이 기판은 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해되어 있으며, 침전을 방지하기 위해 냉각해서는 안 됩니다.
3. 트리거 시약 준비
   1. 증류수 1mL를 추가하여 동화된 세팔린을 재구성합니다. 완전히 녹을 때까지 완전히 소용돌이를 돌리세요.
      참고: 세팔린은 인지질을 제공하기 위해 재구성되며, 이는 여러 응고 반응을 촉매하여 분석에서 생리학적으로 중요한 응고를 가능하게 하는 데 필수적입니다.
   2. 에펜도르프 튜브에 60 μL을 알리코트로 담아 20 우정에 충분하며, −20 °C에서 보관합니다.
   3. 사용 전에 알리코트 한 조각을 해동하고 얼음에 보관하세요. 피펫팅하기 전에 잠깐 보텍스를 사용하세요.
   4. 4mL의 증류수에서 재조합 인간 조직 인자(TF) 바이알 1병의 내용을 재구성합니다.
   5. 에펜도르프 튜브에 60 μL를 담아 −80 °C에서 보관합니다.
   6. TF와 소용돌이를 잠시 녹이세요.
   7. 순차적 희석으로 1:500 희석 TF를 준비합니다:
      1. TF 6 μL을 TBS 버퍼 54 μL에 추가합니다. 소용돌이.
      2. 이 희석액 6 μL을 54 μL TBS에 더합니다. 소용돌이.
      3. 이 두 번째 희석액을 20 μL 추출하여 TBS 80 μL을 추가하여 최종 농도는 0.28 pM에 도달합니다. 소용돌이.
   8. 조직형 플라스미노겐 활성화제(tPA) 1바이알(20 mg)의 내용을 증류수 20 mL에 재구성하여 최종 농도인 580,000 IU/mL(배치별 농도 확인)를 얻습니다.
   9. 에펜도르프 튜브에 50 μL를 담아 −80 °C에서 보관합니다.
   10. 잠시 tPA와 보텍스를 녹여보세요.
   11. 20 μL tPA를 980 μL Tris-NaCl 완충제에 첨가하여 1:50 희석 tPA를 준비하여 최종 농도인 11,600 IU/mL에 도달합니다. 소용돌이.
4. 혈장 샘플 준비
   1. 3.2% 시트레이트가 포함된 3mL 시트레이트 튜브에 정맥혈을 채취하여 최소 2.7mL(90% 채움)를 확보하세요.
   2. 정맥천자 후 첫 번째 관은 사용하지 마세요; 조직 인자에 의한 활성화를 피하기 위해 폐기하세요.
   3. 수집 직후 튜브를 최소 10번 뒤집어 넣으세요.
   4. 실온에서 2시간 이내에 원심분리기를 시작하며, 처음에는 2,500 × g 에서 5분간 원심분리기, 이어서 10,000 g × 10분간 원심분리기를 진행합니다.
   5. 일회용 피펫을 사용해 세포층 바로 위의 혈장을 채취하세요.
   6. 플라즈마를 표지된 크라이오비알에 알리코트한 뒤 액체 질소에 급동하여 −80 °C에서 보관합니다.
      참고: 샘플에 혈전이 없는지 확인하세요. 신선하거나 한 번 해동된 플라즈마만 사용하세요. CTAD 튜브 한 개면 중복 분석에 충분합니다.

2. 기기 준비 및 소프트웨어 설정

1. 형광판 판독기 준비해
   1. 플레이트 리더기를 켜고 37 °C로 평형을 맞춥니다.
   2. 다음 기본 매개변수를 설정하세요:
      1. 그라이너 96 웰, 평평한 바닥, 검은색.
      2. 일반 설정: 위치 지연: 0.1초; 운동 창 수: 1.
      3. 운동 창: 사이클 수: 140; 측정 시작 시간: 0.0초; 사이클당 우물당 플래시 횟수: 10회; 사이클 시간: 30초.
      4. 옵틱: 상단 옵틱
      5. 필터 설정: 단색 개수: 2. 여기 필터: 트롬빈용 355nm; 플라스민은 485nm입니다. 방출 필터: 트롬빈 460 nm, 플라스민 520 nm. 게인: 600.
   3. 플레이트당 최대 20개의 웰로 레이아웃을 정의하세요.
   4. 농도/부피/흔들림 항목으로 이동해서 다음 설정을 확인하세요. 펌프 1 = 20 μL; 펌프 2 = 0 μL; 속도 = 420 μL/s.
2. 주입 시스템 준비
   1. 주사 바늘을 제거하고 완충제가 있는 용기에 헹구세요.
   2. 세척 용량을 2,500 μL로 설정하고 37 °C Tris/NaCl 버퍼로 펌프를 세척하세요.
   3. 헹구는 용량을 500 μL로 재설정하세요.

3. 마이크로플레이트 형식의 분석 설정

1. 마이크로플레이트 셰이커 설치
   1. 마이크로플레이트 셰이커를 37°C로 설정하고 사용 전에 온도를 확인하세요.
   2. 진동 강도를 1100 rpm으로 설정하세요.
   3. 이 셰이커를 분석의 모든 혼합 단계에 사용하여 시약의 균질한 분포와 일관된 효소 활성을 보장합니다.
2. 우물에 시약을 추가하세요
   1. 환자 혈장과 정상 모인 혈장(NPP)을 37°C 수욕에서 최대 10분간 해동합니다.
   2. 충분히 섞고 완전히 해동되는지 확인하세요(냉침전물 없음).
   3. 미리 선택된 웰에 환자 혈장 또는 NPP 80 μL을 추가합니다. 각 샘플마다 새 피펫 팁을 사용하세요.
      참고: 모든 분석마다 NPP 샘플을 포함하여 실행 간 변동성을 고려하세요(자세한 내용은 5.6단계 참조).
   4. 세팔린 2μL을 추가하세요.
   5. 조직 인자 2 μL(1:500 희석)을 추가합니다. 접시 셰이커로 잠깐 섞어주세요.
   6. Tris-NaCl 버퍼 10 μL 추가. 접시 셰이커로 잠깐 섞어주세요.
   7. 4 μL 트롬빈 기질을 추가하세요.
   8. 플라스민 기질 2 μL를 추가합니다. 접시 셰이커로 잠깐 섞어주세요.
3. 인큐베이션 전
   1. 마이크로플레이트를 플레이트 리더기에 삽입하세요.
   2. 플레이트를 37°C에서 몇 분간 평형으로 두세요.

4. 시작 시약의 준비 및 주입

1. 펌프 1용 시약 준비하세요
   1. 1.2.5단계부터 672 μL Tris/NaCl 버퍼, 192 μL Tris/NaCl/CaCl₂ 버퍼, 96 μL tPA를 결합합니다. 완전히 소용돌이.
   2. 시약 튜브 캡에 구멍 두 개를 뚫어.
   3. 펌프 튜빙을 튜브 바닥에 구멍 하나로 삽입하세요.
2. 프라이밍하고 분석을 시작하세요
   1. 소프트웨어를 사용해 500 μL 시약으로 펌프를 프라이밍하세요.
   2. 주사 바늘을 지정된 위치에 다시 꽂으세요.
   3. 즉시 형광 측정을 시작하세요.
3. 수동 분석 시작
   참고: 이 수동 시작 절차는 2.2, 4.1, 4.2 단계에서 설명된 자동 주입 워크플로우에 대한 대안을 제공합니다.
   1. 사용 직전에 4.1.1에 설명된 시작 시약을 준비하세요.
   2. 플레이트 리더에서 마이크로플레이트를 제거하고, 보정된 피펫 또는 다중 채널 피펫을 사용해 각 웰에 20μL의 시작 시약을 빠르게 추가하여 더 빠른 취급을 수행합니다.
   3. 즉시 판을 리더로 돌려보내고 지체 없이 형광 측정을 시작하세요.
      참고: 시약 첨가와 측정 시작 사이의 시간을 최소화하세요(행당 <10초).
4. 운동 감지 장치
   1. 30초마다 70분 동안 형광을 기록하세요.
   2. 측정 시 플레이트를 37 °C로 유지하세요.

5. 데이터 분석

1. 분석을 위해 데이터를 준비하세요
   1. 플레이트 리더에서 동역적 형광 데이터를 각 웰별로 시간점과 형광 값이 포함된 테이블로 내보내세요.
   2. 엑셀이나 다른 프로그램을 사용해 1차 미분을 계산하여 원시 형광 데이터를 효소 생성 곡선으로 변환하세요.
   3. 각 웰의 효소 생성 곡선을 그려 효소 반응을 시각화하세요.
      참고: 이 곡선들은 시간에 따른 트롬빈 또는 플라스민 생성 속도를 나타내며, 그림에 표시된 그래픽 출력과 일치합니다.
2. 트롬빈 생성 곡선 분석
   1. 트롬빈 생성 곡선에서 다음 매개변수를 식별하라( 그림 1 참조):
      1. 지연 시간: 트롬빈 생성 곡선이 꾸준히 상승하여 트롬빈 피크 높이의 8%에 도달하는 시점입니다.
      2. 트롬빈 피크 높이: y축에서의 최대 신호 값(즉, 최대 트롬빈 생성률).
      3. 트롬빈 피크 시간: 분석 시작부터 트롬빈 피크 높이까지의 시간입니다.
      4. 트롬빈 전위(트롬빈 생성 곡선 아래 면적): 트롬빈 신호가 기준선으로 돌아올 때까지 지연 시간(lag time) 아래 면적.
         참고: 트롬빈 잠재력은 분석 조건에서 샘플의 총 트롬빈 생성 능력을 반영합니다.
3. 플라스민 생성 곡선 분석
   1. 플라스민 생성 곡선에서 다음 매개변수를 확인하라( 그림 2 참조):
      1. 피브린 용해 시간: 플라스민 생성 시작점(즉, 플라스민 생성 곡선이 꾸준히 상승하여 플라스민 피크 높이의 8%에 도달하는 시점)부터 플라스민 피크에 도달하는 시점까지의 시간입니다.
      2. 플라스민 피크 높이: 곡선에서 첫 번째 뚜렷한 최대값은 플라스민 생성의 초기 폭발에 해당하며, 플라스민 생성 곡선의 2차 미분(3분 이동평균을 기준)이 플라스민 생성 시작 후 0에 도달하는 지점에서 결정됩니다.
      3. 플라스민 전위(플라스민 생성 곡선 아래 면적): 플라스민 생성 시작부터 플라스민 피크 시점까지의 곡선 아래 면적.
         참고: 신호 변동은 초기 플라스민 피크 이후에 발생하며, 플라스민 생성 매개변수 분석에는 포함되지 않습니다.
4. 매개변수를 수동으로 추출하거나 맞춤형 소프트웨어를 사용할 수 있습니다
   1. Microsoft Excel, GraphPad Prism 또는 Python이나 R 같은 맞춤형 스크립트를 사용해 운동 파라미터를 추출하세요.
   2. 원시 데이터, 그래프 표시, 계산된 매개변수를 구조화된 형식으로 저장하여 보관 및 향후 참고를 하세요.
      참고: 매크로를 사용할 경우, 자동 출력에 의존하기 전에 모든 매개변수의 정확성을 시각적이고 수동으로 확인하세요. 데이터 변환을 위한 매크로는 요청 시 제공됩니다.
5. 표준화 및 정규화
   1. 정상화 기준에 사용되는 NPP 샘플과 병행하여 건강한 기증자 40개의 개별 샘플을 측정하여 생리학적 기준을 설정합니다. 이 단계는 NPP 배치당 한 번씩 수행하세요.
   2. 건강한 기증자의 평균 트롬빈 및 플라스민 생성 매개변수 값을 계산하고, 동일한 검사에서 얻은 NPP 값과의 비율을 결정합니다.
   3. 주어진 검사에서 각 환자 샘플에 대해 먼저 트롬빈 또는 플라스민 생성 매개변수를 해당 검사에서 측정한 NPP 값으로 정규화합니다.
   4. 이 결과를 동일한 NPP 배치에 대해 이전에 설정한 건강한 기증자 대 NPP 비율로 나누어 봅시다(5.6.2 단계 참조). 이로 인해 평균 건강한 개인에 대해 표준화된 상대 값이 산출되며, NPP를 사용하여 주행 간 변동에 대한 표준화가 이루어집니다.
   5. 매개변수 값을 건강한 개인의 평균 값(100%)에 대한 비율로 표현합니다. 환자 샘플 결과를 적절히 제시하세요.
      참고: 각 개별 환자 샘플의 상대 매개변수 값은 다음 공식에 따라 계산되며, 여기서 run a는 환자 샘플의 측정 run을, run b는 건강한 기증자 샘플을 동일한 NPP 배치와 병행하여 측정한 참조 run을 의미합니다. 데이터 정규화 계산이 담긴 엑셀 파일은 요청 시 제공하실 수 있습니다.
      

6. 보정 곡선 생성

1. 트롬빈 보정 곡선을 준비하세요
   1. 제조사 데이터시트에 지시된 대로 동화된 인간 α-트롬빈을 재구성합니다.
      참고: 예를 들어, 데이터시트에서 100 μL 물에서 재구성하여 3.34 mg/mL를 얻으라고 명시하면, 이는 100 μL에서 0.334 mg에 해당합니다.
   2. 재구성된 트롬빈을 Tris/NaCl 버퍼에 1:10 희석합니다.
      참고: 분자량 36,700 g/mol을 기준으로 약 9.1 nmol/mL (0.0091 nmol/μL)의 재고 농도를 얻습니다.
   3. Tris/NaCl 버퍼에서 희석 시리즈를 준비하여 최종 트롬빈 농도를 0에서 152 nmol/L 범위로 얻습니다.
   4. 피펫을 피펫으로 스롬빈을 이미 버퍼가 포함된 웰에 삽입하여 웰당 총 부피 100 μL에 도달합니다.
   5. 1.2.2단계의 300 μL Tris/NaCl 버퍼와 200 μL 트롬빈 기질을 혼합하여 펌프 1용 기판 용액을 준비합니다.
   6. 혼합물 400 μL과 Tris/NaCl 버퍼 360 μL을 결합하여 이 용액을 더욱 희석합니다.
   7. 각 교정 웰에 이 기판 혼합액 20 μL을 추가하여 총 분석량을 120 μL로 만듭니다.
   8. 플레이트를 부드럽게 섞어 플레이트 리더기에 넣으세요. 2절에서 설명한 형광 설정을 사용하여 25사이클 동안 동성 분석법을 실행합니다.
   9. 원시 형광 데이터를 내보내고 GraphPad Prism 또는 동등한 소프트웨어를 사용하여 각 트롬빈 농도별 초기 기울기(사이클당 형광 증가율)를 결정합니다.
   10. 초기 기울기와 트롬빈 농도를 그래프로 표시하여 표준 곡선을 생성합니다.
       참고: 모든 버퍼는 37 °C로 예열되어 있어야 하며, 효소는 얼음 위에 보관하세요. 항상 신선한 희석물을 준비하고 충분히 섞으세요. 결과된 표준 곡선은 5절에서 설명한 매크로를 사용하여 미확인 샘플의 상대적 트롬빈 활도를 계산하는 데 사용됩니다.
2. 플라스민 보정 곡선 준비
   1. 제조사 지침에 따라 증류수(예: 0.543 mL)에서 동성 건조 플라스민을 재구성합니다.
      참고: 플라스민의 분자량은 75,400 g/mol입니다. 결과적으로 생성된 스톡 농도는 약 24.3 nmol/mL(0.024 nmol/μL)이며, 0.543 mL에 1 mg이 있다고 가정합니다.
   2. Tris/NaCl 버퍼에서 희석 시리즈를 준비하여 최종 플라스민 농도를 66에서 532 nmol/L 범위로 얻습니다.
   3. Tris/NaCl 완충기가 포함된 웰에 플라스민을 피펫 주입하여 최종 부피인 100 μL로 각 웰에 도달합니다.
   4. 1.2.5 단계에 따라 Tris/NaCl 버퍼 680 μL와 플라스민/로다민 기질 80 μL(필요 시 1:1 희석)를 혼합하여 펌프 1용 기판 용액을 준비합니다.
   5. 각 보정 웰에 이 기판 용액 20 μL을 추가하여 총 부피를 120 μL로 만듭니다.
   6. 플레이트를 부드럽게 섞어 플레이트 리더기에 넣으세요. 2절에서 설명한 동일한 형광 설정으로 25사이클 동안 동역학 분석을 실행하세요.
   7. 원시 형광 데이터를 내보내고, GraphPad Prism 또는 동등한 소프트웨어를 사용해 운동 커브의 선형 위상에 선형 회귀를 적용하여 각 플라스민 농도별 형광 증가의 초기 기울기를 결정합니다.
   8. 초기 기울기와 플라스민 농도를 그래프로 표시하여 표준 곡선을 생성합니다.
      참고: 배치별로 플라스민 활성의 변동이 있기 때문에, 각 새로운 로트마다 보정을 반복해야 합니다. 예상치 못하게 높은 활성이 관찰되면, 보정 시리즈 준비 전에 재고를 1:2 희석하는 것이 권장됩니다.
3. 정량화를 위해 보정 곡선을 사용하세요
   1. 섹션 6에서 생성된 보정 곡선을 사용하여 형광 기울기 값을 상대 효소 활성으로 변환하세요.
   2. 미지의 샘플을 보간할 때는 보정 곡선의 선형 부분만 사용하세요.

결과

나이메헌 혈류 분석법(NHA)으로 얻은 대표적인 트롬빈 및 플라스민 생성 곡선은 그림 3에 나와 있습니다. 각 곡선의 신호 세기는 동시에 측정된 정상 풀 플라즈마(NPP) 샘플에 대한 비율로 표현됩니다. NPP가 포함된 샘플은 내부 통제 차원에서 포함되어 분석의 유효성을 검증하고 실행 간 비교 가능성을 보장합니다.

그림 3A, B 는 세 명의 건강한 대조군과 정상 풀링 혈장(NPP)의 결과를 보여주며, 예상 최대 높이와 시기를 가진 재현 가능한 트롬빈 및 플라스민 곡선을 보여줍니다. 이 지표들은 정상적인 정혈 기능의 기준 프로파일로 작용하며, 성공적인 분석의 성능을 나타냅니다.

그림 3C,D

토론

나이메헌 지혈 분석법(NHA)은 혈소판이 부족한 혈장에서 트롬빈과 플라스민 생성을 동시에 시간 측정할 수 있는 이중 효소 형광 생성 검사입니다. 두 과정을 단일 웰에 포착함으로써 이 방법은 2차 지혈과 섬유소용해의 고해상도 동학 분석을 용이하게 합니다. 이 이중 측정은 기존 검사에 비해 뚜렷한 방법론적 이점을 제공하며, 응고인자 결핍, 고섬유소용해 상태, 기타 정혈성 균형 장애 연구에 성공적으로 적용되었습니다.

NHA의 신뢰성과 재현성에는 여러 기술적 측면이 매우 중요합니다. 여기에는 정확한 피펫팅, 일관된 시약 준비, 기판과 활성제 첨가 후 즉시 형광 측정 시작이 포함됩니다. 분석과정 내내 37°C의 온도 조절은 효소 활성을 유지하고 유효한 동역학적 판독을 보장하는 데 필수적입니다. 이러한 사전 분석 변수들의 표준화와 일관된 시약 취급은 기술적 변동성을 최소화하는 데 매우 중요하며, 이는 이전에 다른 글로벌 분석법

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<스트롱>재료
염화칼슘(CaCl2.2H2O)	머크	1.02382
세팔린 (C.K. Prest 5 APTT 시약 키트)	스타고	00847	-20 & c.bsp에서 6개월간 안정적;
증류수			개장 날짜를 기록하세요. 첫 개봉 후 하루 이내에 사용하세요.
디메틸설폭사이드 (DMSO)	머크	1.02950.0500
인간 알파 트롬빈	효소 연구소	HT 1002a	상자에는 분석 증명서가 담긴 전단지가 들어 있습니다. 첨가할 완충 부피는 지정된 농도에 따라 다르며, 1 & 마이크로; 120 및 마이크로에 추가된 인간 트롬빈의 L; L 시약은 최종 농도가 76 nmol/L입니다.
인간 플라스민	효소 연구소	HPlas	상자에는 분석 증명서가 담긴 전단지가 들어 있습니다. 첨가할 완충 부피는 지정된 농도에 따라 다르며, 1 & 마이크로; 120 및 마이크로에 첨가된 인간 플라스민 L; L 시약은 최종 농도가 200 nmol/L입니다.
정상 풀린 혈장	내부 준비	해당되지 않음	얼음 위에 보관하면 해동 후 3시간 동안 안정적입니다.
환자 혈장	해당되지 않음	해당되지 않음
플라스민 기질(CBZ-L-페닐알라닐-L-아르기닌 아미드)-로다민-모르폴리노 요소	시미레		-80 & C.b.nbsp에서 6개월간 안정적;
재조합 인간 조직 인자(TF): 이노빈	데이드 베링	B4212	-80 & C.b.nbsp에서 6개월간 안정적;
재조합 조직형 플라스미노겐 활성화제(tPA): 알테플라제/액틸라이스	보링거 잉겔하임		-80 & C. 로 12개월간 안정적;
트리스(하이드록실메틸)아미노메탄 (H2NC(CH2OH)3<>)	머크	1.08382.2500
Tris-NaCl 버퍼, pH 7,4 (TBS)	내부 준비	해당되지 않음
트리스-NaCl-CaCl2 버퍼, pH 7.4 (TBS-Ca)	내부 준비	해당되지 않음
트롬빈 기질 Bz-베타-Ala-Gly-Arg-7-아미노-4-메틸쿠마린	시미레		-80 & C.b.nbsp에서 6개월간 안정적;
<스트롱>장비
Fluostar Optima 형광계/마이크로플레이트 리더기, 온도 조절 및 시약 주입기	BMG 랩텍
96웰 마이크로타이터 플레이트, 폴리스티렌, 평바닥, 검은색, 중간 결합면(마이크로론에 해당)	그레이너 바이오-원	655076
분석 균형(상부 부하 균형)
파란색 피펫 팁 (100-1000 및 마이크로용; L)
시트레이트 혈액 채취관 3mL (3.2% 시트레이트)	BD 배큐테이너
아이스 버킷
제빙기
인큐베이터 / 마이크로플레이트 셰이커
자기 교반자
마이크로 원심분리기 튜브 선반
마이크로 원심분리기 튜브, 닫힘 가능
pH 계
피펫 팁 0.1-10 및 마이크로; L, 비멸균
피펫 (2, 10, 20, 100, 1000 및 마이크로; L)
드라이버 (프로브로 사용)
튜브 믹서
물욕
노란색 피펫 팁 (20-200 및 마이크로용; L)