방법 논문

원시 생식세포 이식 을 통한 닭 생식계 키메라 생성 단계별 절차

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⸱

DOI:

10.3791/69704

⸱

2025년 12월 5일

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

이 논문에서

요약

조류 생식세포 키메라는 원시 생식세포(PGC)를 수용자 배아에 이식하여 생성되며, 형질전환, 유전자 편집, 종 보존 분야에 응용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 PGC 분리, 시험관 내 증식, 미세주입, 기증자 검증 절차를 상세히 다루어, 생식계 키메라 생산과 조류 생명공학 발전을 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

초록

원시 생식세포(PGCs) 이식 을 통한 닭의 생식계 키메라 생성은 조류 형질전환, 유전체 편집, 종 보존을 위한 견고하고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. EGK 단계 X 배아에서 배아세포를 사용하는 전통적인 접근법은 초기 세포 계통 분리로 인해 생식선 전달 효율이 낮아 제한됩니다. 반면, PGC 매개 전략은 이러한 유능 세포의 내재적 생식계 능력을 활용하여 수혜자의 생식선에 신뢰성 있게 통합할 수 있게 합니다. 여기서는 HH 단계 26-28 배아에서 PGC를 분리하고, 시험관 내에서 유지 및 증식하며, HH 단계 14-17 수혜자 배아의 배상에 이식하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 단기 착착은 PKH26과 같은 형광 표지자를 사용하여 모니터링하며, 장기 생식계 기여는 수혜자의 생식샘 PCR 분석을 통해 확인됩니다. 이 방법은 기증자 PGC의 생존 가능성과 기능적 역량을 유지하면서 생식선 키메라의 일관된 생성을 보장합니다. 또한 CRISPR/Cas9 및 트랜스포존 기반 벡터와 같은 유전체 편집 도구와 호환되어 형질전환 및 유전자 편집 조류 모델 생산이 가능합니다. 기초 연구를 넘어, 이 전략은 종간 생식계 전달과 유전 자원 보존을 통해 보전 노력을 지원합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 조류 생식계 조작을 위한 포괄적이고 신뢰할 수 있는 틀을 제공하며, 가금류 생명공학의 기초 및 응용 연구를 위한 다재다능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

원시 생식세포(PGC) 매개 생식계 전달은 조류에서 다음 세대로 유전 정보를 전달하는 가장 효율적인 방법입니다 1,2,3. 생식계 키메라(기증자와 숙주 유래 생식세포를 모두 보유한 개체로 정의됨)는 기증자 유전 물질을 자손에게 전달할 수 있게 하여 형질전환, 기능적 유전체학, 멸종위기종 보존 등에 응용합니다. 배반배엽 세포에 의존하는 접근법과 달리, PGC 매개 전략은 생식세포 전달 효율과 재현성을 높여 정밀한 유전자 조작에 적합합니다.

조류 종에서 PGC는 Eyal-Giladi 및 Kochav(EGK) 단계 X9의 발아배엽 중앙 펠루시다 영역에서 기원하며, 이후 함버거 및 해밀턴(HH) 단계 410에 의해 발아 초승달로 이동합니다. HH 9기와 12기 사이에는 PGC가 배아 혈관을 통해 순환하다가 생식선능선 11, 12, 13에 정착합니다. 이러한 독특한 이동 패턴 덕분에 PGC는 발자기, 순환 혈액, 생식샘 등 여러 단계에서 분리될 수있습니다. 특히, HH 단계 26-28 생식선에서 채취하여 HH 단계 14-17 수용자 배아에 이식한 PGC는 최적의 생식계 능력과 착아 효율을 보이며, 이 프로토콜의 표준화된 적용을 위한 실용적 틀을 제공합니다.

PGC는 생식계 정체성과 전파 능력을 유지하면서 시험관 내에서 유지 및 증식할 수 있어 안정적인 유전자 변형에 활용할 수 있습니다. PGC 매개 생식계 키메라 생산은 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 조류를 생성하고, 미적한 생식계통을 형성하며, 성 결정 경로를 조작하고, 감염병에 대한 저항성을 부여하는 데 사용되었습니다 6,15,16,17,18,19. 더 나아가, PGC 이식은 멸종 위기 조류 유전자자원 7,8,20,21,22,23의 종간 생식계 전달과 보존을 촉진하며, PGC 냉동 보존은 장기적인 유전 자원 보존을 가능하게 합니다24,25.

배아 줄기세포(ESC)26,27,28,29, 유도 다능성 줄기세포(iPSCs)30,31,32, 정자 발생 줄기세포(SSCs)33,34 등 다른 줄기세포 유형도 조류 생식세포 변형을 위해 연구되었으나, 이들의 생식세포 전달 효율은 현재 가장 높은 것으로 여겨지는 PGC 기반 시스템에 비해 낮습니다 생식계 적합성 세포의 신뢰할 수 있는 공급원.

생식계통 키메라 연구에서는 기증자 품종 선택이 기증자 유래 생식세포와 숙주 유래 세포를 구분하는 데 매우 중요합니다. 한국 오계닭(KOC)은 검은 피부와 깃털을 형성하는 열성 i/i 대립유전자를 가지고 있는데, 이는 우성 I/I 대립유전자35, 36을 가진 백레그혼 계통과 쉽게 구별됩니다. 이 눈에 띄는 차이는 생식계 전파 분석 시 기증자 유래 자손을 명확히 식별할 수 있게 하며, KOC의 토착 유전적 가치 덕분에 생물다양성 보전을 지원합니다.

전반적으로 PGC 매개 생식세포 키메라 생산은 조류 생명공학에 견고한 기반을 제공합니다(그림 1). 최적의 기증자(HH26-28)와 수혜자(HH14-17) 단계를 지정하고 정의된 배양 및 검증 단계를 통합함으로써, 이 프로토콜은 효율적인 생식계통 전달을 가능하게 하고, 형질전환 및 유전체 편집 조류 생성과 귀중한 조류 유전 자원 보존을 위한 실용적인 틀을 제공합니다.

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프로토콜

닭과 관련된 모든 절차는 대한민국 서울대학교 실험동물자원연구소(IACUC 승인 번호: SNU-250226-4)에서 승인받았습니다. 동물들은 멸균된 물과 사료를 제공받아 통제되고 위생적인 환경에서 관리되었습니다. 또한, 수술 중 발생된 모든 화학 및 생물학적 폐기물(트립신/EDTA 용액, PKH26 표지 세포, 배아 또는 생식샘 조직)은 서울대학교 기관 생명안전 및 유해 폐기물 관리 지침에 따라 처리 및 처리되었습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다. 기증자 배아에서 생식선 샘플링과 세포 배양에 사용되는 PGC 배지와 시약은 반드시 멸균되어야 합니다.

1. 닭 PGC의 분리

  1. Eyal-Giladi 및 Kochav(EGK) 단계 X에서 신선한 수정된 닭알을 37°C에서 5.5일간 배아가 HH 단계 26-28에 도달할 때까지 부양합니다.
    참고: 정상적인 배아 발달을 위해 습도를 60%-65%로 유지하세요.
  2. HH 단계 26-28의 난자에서 배아를 멸균 겸자를 사용해 신중하게 분리하세요.
  3. 배아를 1× PBS로 세척한 후 숯판에 올려놓고 곤충 핀으로 고정하세요. 입체현미경을 사용해 날카로운 겸자를 사용해 쌍을 이룬 배아 생식선을 조심스럽게 해부합니다.
    참고: 조직을 조심스럽게 다루어 손상을 방지하고 생식선을 정확히 분리하세요. HH 26-28단계에서 신장과 가까이 위치해 있어 소량의 신장 조직이 의도치 않게 수집될 수 있습니다; 입체현미경 하의 신중한 해부와 선택적 배양 조건을 통해 PGC만 증식하여 순도를 유지합니다.
  4. 세 개의 배아에서 채취한 쌍을 1.5mL 튜브에 500 μL 0.05% 트립신/EDTA를 넣은 튜브에 옮겨 37°C에서 5분간 배양하여 세포를 해리시킵니다.
  5. 트립신을 비활성화하기 위해 FBS 50 μL을 추가하세요.
  6. 200 × g 에서 실온(약 20-25 °C)에서 5분간 원심분리기. 세포 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 상원액을 제거하세요.
  7. 해리된 생식샘 세포를 1× PBS 1mL에 재현탁합니다.

2. 닭 PGC의 시험관 내 증식

  1. PGC 배양 배양지를 준비합니다(KO-DMEM에 20% FBS, 2% 닭 혈청, 뉴클레오사이드, 글루타맥스, MEM 비필수 아미노산, 2-머캅토에탄올, 10 mM 피루브산 나트륨, 항생제-항균제, 10 ng/mL bFGF) 배지를 37 °C로 가열합니다.
  2. HH 단계 26-28에서 채집한 세 개의 배아에서 채취한 해리 생식샘 세포(배아당 약 100-150 PGC37,38)를 웰당 1mL의 예열된 배양지를 추가하고, 세포를 12웰 배양 플레이트에 플레이트링합니다.
  3. 세포가 균일하게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔드세요.
  4. PGC를 37°C, 5% CO₂로 유지하고, 형태와 세포 밀도를 매일 모니터링하세요. PGC는 둥글고 굴절되며 일반적으로 떠 있는 반면, 체세포는 부착되어 있습니다(그림 2A).
    참고: 배양 조건은 PGC의 증식을 선택적으로 지원하여 PGC가 증식하는 동안 체세포가 점차 제거될 수 있도록 합니다.
  5. 12웰 플레이트에서 배양된 PGC는 최적의 증식과 생존력을 지원하기 위해 3-4일마다 배양지를 교체하여 유지됩니다(그림 2B).
  6. 선택적으로, PGC 특이적 마커(예: CVH, DAZL, NANOG, POUV)를 사용하여 순도를 확인하고 PCR을 통한 성 결정도 가능합니다(표 1).
    1. 제조사의 지침에 따라 RNA 미니프렙 시스템을 사용하여 PGC 샘플을 RNA 추출을 준비하세요.
    2. 표준 프로토콜39(그림 2C,D)에 따라 PGC 특이 마커(SSEA1 및 DAZL)를 사용한 RT-PCR(예: CVH, DAZL, NANOG, POUV) 또는 면역염색을 수행합니다.
    3. 표준 프로토콜40 (그림 2E)에 따라 PCR 성별 분석을 수행하세요.

3. PKH26 표지를 이용한 배양된 PGC의 생식계 역량 검증

  1. PGC는 로그 성장 단계에 도달하면 수확하며, 일반적으로 12웰 플레이트에서 우물당 약 1-5 × 105 셀 밀도로 수확합니다.
  2. 세포를 200 × g 에서 실온(약 20-25 °C)에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠릿으로 뿌리고, 1× PBS에 재현탁한 후 트리판 블루를 사용해 생존 여부를 평가합니다.
  3. 일반 세포막 표지용으로 PKH26 적색 형광 세포 링커 키트에서 희석제 C를 준비하고 실온(약 20-25°C)에 평형을 맞추세요.
  4. PKH26 염료를 재구성하고 최종 농도는 약 1-2 μM의 희석수 C에 작동 용액을 준비합니다.
  5. PGC 펠릿을 1 mL 희석제 C에 재현탁합니다. 1 mL PKH26 용액(1:1 비율)을 빠르게 첨가하고 부드럽게 혼합한 후 실온(약 20-25 °C)에서 2-5분간 배양합니다.
  6. 세포 현탁액 1:1 비율에 1 mL PKH26 작업 용액을 빠르게 첨가하고, 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 후 상온(약 20-25 °C)에서 2-5분간 배양합니다.
    참고: 권장 잠복 기간을 초과하지 마십시오.
  7. 착색을 멈추려면 PBS에 FBS 부피의 2-4배, 또는 BSA의 1%-5%를 추가하세요.
  8. 원심분리기 200 ×, 실온(약 20-25 °C)에서 5분; PGC 배양지 또는 1× PBS + 0.1% BSA로 세 번 세척합니다.
  9. 세포를 주입 완충제(PGC 배양지 또는 1× PBS + 0.1% BSA) 농도에서 1-5 × 10 105 cells/μL× 재현탁합니다. 생존 가능성을 유지하기 위해 잠시 얼음 보관합니다.
  10. 주입 전에 형광 현미경으로 라벨링을 확인하세요(그림 3A).
  11. 트리판 블루를 사용해 세한 3,000개 이상의 생존 가능한 표지 PGC를 HH 14-17기 배아에 주입하고 6일째까지 배양합니다(그림 3B).
  12. 6일째까지 수용자 생식선의 정착을 확인한다(그림 3C).

4. 기증자 PGC를 수혜자 배아 혈관으로 이식하는

  1. 수혜 알을 HH 단계 14-17(37°C, 습도 60-70%, 매시간 45° 각도로 흔들기)까지 부화하세요.
  2. 붕규산 유리관(외경 1.0mm, 내경 0.5-0.75mm)을 사용하여 유리 모세관 마이크로피펫을 준비합니다. 마이크로피펫 풀러를 사용해 모세관을 당기고 팁을 약 10-20 μm 내경으로 연마합니다.
  3. 난자의 뾰족한 끝에 약 0.5cm × 0.5cm 정도의 작은 창을 만들어 미세 주입 접근을 허용하면서 배아에 미치는 교란을 최소화하세요.
    참고: 창문을 열기 전에 달걀 껍질 표면을 70% 에탄올로 멸균하여 오염을 방지하세요.
  4. 입체현미경 아래에서 3,000 PGC 이상의 PGC를 1× PBS 또는 HBSS에 들어 있는 현탁액 2μL를 등쪽 대동맥에 주입합니다.
    참고: 배아나 혈관을 손상시키지 않도록 입체현미경 아래에서 주사를 시행하며, 손상을 방지하기 위해 현미경 주사 바늘을 조심스럽게 조작하세요.
  5. 계란 창문을 파라핀 필름으로 밀봉하세요; 알을 끝이 아래로 향하게 놓고 37.5°C, 60-70% 습도에서 부화할 때까지 부화시키며, 매시간 45°C로 흔듭니다.
    참고: 배아의 생존 가능성과 성공적인 발달을 위해 적절한 온도와 습도를 유지하세요.

5. 생식계 키메라의 검증

  1. 부화 후 G0 병아리의 고환이나 난소를 채취하세요.
  2. 수집된 생식샘 조직에서 유전체 DNA를 추출하여 생식세포 키메라 형성을 확인한다. 수집된 생식샘 조직에서 다음과 같이 유전체 DNA 추출을 수행합니다:
    1. 고환 또는 난소 조직을 채취하고, 1.5 μL 단백질효소 K가 포함된 300 μl 용해 완충제(2 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% SDS)에 균질화하고, 60 °C 에서 h에서 배양하여 완전한 용해를 보장합니다.
    2. 단백질 침전용액 100 μL(7 M 아세트테이트 암모늄)을 첨가하고 충분히 혼합한 후 12,000 × g 온도에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다.
    3. 상원액(수상)을 새 튜브로 옮기고, 침전된 DNA에 500 μL 이소프로판올을 첨가한 뒤, 4 °C에서 12,000 × g 에서 10분간 원심분리합니다.
    4. 상청액을 버리고 70% 에탄올 1mL를 추가한 후 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다.
    5. 에탄올을 제거하고 DNA 펠릿을 실온에서 10분간 자연 건조하세요.
    6. RNase가 없는 50 μL 물로 DNA를 용출하고, 분광광도계(A260/A 280 ≈ 1.8)를 사용해 DNA 농도와 순도를 측정합니다.
    7. DNA를 PCR 반응당 10-5 ng로 조절하세요.
  3. 다음 조건 하에 설계된 종별 프라이머(표 1)를 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다: 94 °C에서 3분 동안 3분, 68 °C에서 30초, 72 °C에서 30초간 35회 사이클, 그리고 72 °C에서 5분간 연장 후 30분간 진행합니다(그림 4A).
  4. 성적으로 성숙한 G0 수컷으로부터 정액을 채취하고, 동일한 프로토콜로 정자 DNA를 추출하며, 종별 프라이머를 이용해 PCR을 수행합니다(그림 4B).

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결과

시험관 내 증식 및 닭 PGC의 특성 분석
PGC 함유 전체 생식샘 세포는 HH 단계 26-28의 배아에서 분리되어 정의된 PGC 배양 조건에서 배양되었습니다. 시간이 지나면서 생식선 기질 세포는 배양 표면에 부착하거나 분해되었고, PGC는 부유 상태로 남아 활발히 증식하기 시작했습니다(그림 2A). 약 2주간의 배양 후 PGC 개체군은 1× 105 개 세포 이상으로 확장되었으며, 이러한 정의된 조건 하에서 PGC의 강력한 증식과 선택적 농축을 보였습니다(그림 2B).

배양된 세포의 생식세포 정체성을 확인하기 위해 생식세포 특이적 마커를 이용한 RT-PCR 분석과 면역세포화학이 수행되었습니다. RT-PCR 결과는 배양된 PGC에서 DAZL, CVH, NANOG,

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토론

배양된 원시 생식세포(PGC)를 수혜자 배아에 이식하는 것은 닭에서 생식계 키메라를 생산하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 PGC의 내재적 생식계 잠재력을 활용하며, 모자이크와 발달 변동성에 취약한 전통적인 배아배엽 기반 시스템에 비해 실험적 일관성을 향상시킵니다. 이 방법의 중요한 장점은 정의된 배양 조건 하에서 PGC의 선별적 시험관 내 확장이 가능하며, 이는 생식계 정체성을 유지한다는 점입니다. 배양 기간 동안 PGC는 특징적인 형태를 유지하고, 높은 증식률을 보이며, CVH와 DAZL과 같은 생식세포 특이적 표지를 발현하여 미분화 상태를 확인한다.

배아 발달 단계의 정밀한 조절은 성공적인 이식에 필수적입니다. HH 14-17단계 창은 배측 대동맥이 완전히 접근 가능하고 생식샘 능선이 집락화에 수용적이기 때문에 최적입니다. 이 창문 밖에 배아를 주입하면 기증 세포가 생식샘 지위에...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 한국 정부(MSIT)가 지원하는 국가연구재단(NRF) 보조금(RS-2024-00418297)과 한국농촌개발청의 농업과학기술 개발 협동연구프로그램(RS-2025-02213489)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1x PBS 하이클론SH30256
2-머캅토에탄올깁코21985023
항생제 항균류 용액 (100X)깁코15240062
항-DAZL 항체앱캠AB215718
치킨 세럼 스테릴록랜드D102-00-0500
소 췌장에서 추출한 디옥시리보뉴클레아제 I시그마 올드리치9003-98-9
드럼몬드 마이크로캡 일회용 마이크로피펫  드럼몬드 사이언티픽 컴퍼니1-000-0500
EmbryoMax 뉴클레오사이드 (100배)머크ES-008-D
FBS (태아 소 수르름 특성화, 미국산 500ml)하이클론SH30919
글루타맥스 보충제깁코35050061
녹아웃 DMEM깁코10829018
MEM 비필수 아미노산 용액깁코11140050
파라필름 M 실험실 필름암코어PM996 
일반 세포막 표지용 PKH26 적색 형광 세포 링크 키트시그마 올드리치PKH26GL-1KT
정제 항생쥐/인간 CD15 (SSEA-1) 항체바이오레전드125602
재조합 인간 FGF 염기/FGF2/bFGF (146 aa) 단백질  R& D 시스템그리고 nbsp; 233-FB
릴리아프렙 RNA 미니프렙 시스템프로메가Z6011
피루베이트 나트륨 (100 mM)깁코11360070
트리판 블루 용액시그마T8154-100ML
트립신-EDTA (0.5%), 페놀 레드 없음깁코 및 무역;15400054

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