방법 논문

쥐 요골골절에 대한 새로운 내부 고정 모델 개발: 골절 치유 평가 및 등근 신경절 분리

DOI:

10.3791/69707

⸱

2026년 3월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Nantong Tongzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Institute of Modern Biology, Nanjing University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 쥐 요골골절 모델에서 안정적인 내부 고정을 위해 봉합사와 티타늄 바늘을 혁신적으로 결합하였습니다. 골절 치유는 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)을 통해 평가되었고, 추가 연구를 위해 일차 등근 신경절(DRG) 신경세포를 분리하여 배양하였다.

초록

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쥐 요골 골절 모델은 골절 치유 메커니즘 연구, 약물 선별, 생물학적 재료 평가 등 정형외과 연구에서 매우 중요합니다. 몇 가지 한계에도 불구하고, 과학 연구에서 그 역할은 대체 불가능합니다. 쥐의 반경이 비교적 좁기 때문에, 현재 임상 실무에서 사용되는 강철판과 나사는 쥐 방사선 골절 치료에 적합하지 않습니다. 이 한계를 해결하기 위해 본 연구는 요골 골절에 대한 내부 고정 모델인 봉합 및 티타늄 바늘 고정을 혁신적으로 활용하여 비교적 안정적인 고정을 제공하며, 이러한 골절의 내부 고정을 연구할 수 있는 견고한 동물 모델을 구축합니다. 생체 내 영상 검사는 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 방사골 골절 치유를 감지하기 위해 생체 내 동물 마이크로 CT 시스템을 사용했습니다. 쥐 DRG의 추출 및 적용은 신경과학 연구에서 중요한 단계로, 신경과학, 병리학, 세포생물학 등 분야에서 널리 사용됩니다. 이 프로토콜은 요골 골절이 있는 쥐의 등뿌리 신경절 신경세포 1차 배양에 적합하며, 신경 손상 및 골절 후 수리 기전(신경세포자멸사, 신경전달물질 방출 등)을 연구하는 데 활용될 수 있습니다.

서론

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요골 골절은 가장 흔한 임상 골절 중 하나로, 전 세계적으로 상당한 발생률을 보이고, 사지 장골절의 주요 원인으로 평가됩니다 1,2,3. 인구 연구는 요골 골절에 대해 이중양식 연령 분포를 보여주며, 일반적으로 소아와 노인 인구 모두에서 최고조에 달합니다. 4. 지연된 치료는 종종 전완 회전 기능 장애를 초래하여 일상생활 활동(ADLs)에 심각한 장애를 초래합니다5,6. 요골 골절 관리에는 주로 골절 분류 체계와 치료 기법 선택에 관한 논쟁이 계속되고 있습니다 7,8. 임상적 증거에 따르면 개방 축소 내부 고정(ORIF)은 팔꿈치 또는 손목 관절의 가동 범위(ROM)와 근력 회복을 크게 개선합니다9; 그러나 이 접근법은 수술 후 감염률과 내부 고정 관련 합병증 발생률이 높다는 것과 관련이 있습니다10,11.

DRG는 말초신경계와 중추신경계(CNS) 간 감각 정보 전달을 위한 중요한 해부학적·기능적 다리 역할을 합니다. DRG는 주변 감각 신호(예: 촉각, 온도)를 수집하고 전달하는 주요 역할을 넘어, 통증과 같은 비정상적인 감각을 적극적으로 조절하여 정상 감각 기능과 임상 통증 관리의 핵심 구조가 됩니다 12,13,14. DRG의 손상, 염증, 신경퇴행과 같은 병리학적 변화는 감각 이상(예: 무감각, 저림)이나 만성 통증을 유발할 수 있어, DRG는 신경과학과 통증 의학 연구의 중심점이 되었습니다.

본 연구에서는 약 200g의 8주 된 수컷 SD 쥐를 선정하여 (1) 쥐의 요골 횡골절에 대한 내부 고정 모델과 이후 치유 후 평가, (2) 요골 골절에 대한 내부 고정 모델을 가진 쥐에서 DRG를 분리하여 시험관 내에서 배양하였습니다. 이 프로토콜은 골절 치유 메커니즘, DRG 매개 감각 변화, 골절 후 통증 또는 기능 장애에 대한 잠재적 치료 표적을 탐구하는 연구에서 재현 가능한 실험을 촉진하도록 설계되었습니다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 난징 중의대학 동물윤리위원회(번호 202508A046)의 승인을 받았습니다. 다음 검사에서 사용된 모든 쥐는 특정 병원체 무(SPF) 조건에서 유지되었습니다. 프로토콜을 나타내는 회로도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 쥐의 요골 골절에 대한 내부 고정 모델 구축

참고: 쥐들은 수술 전 조용하고 부드럽고 확산된 조명에 적응하여 소음과 강한 조명으로부터 보호받았습니다. 다루는 동안 쥐의 복부와 가슴은 부드러운 수동 제지로 지지되었으며, 꼬리 잡기는 고통과 고통을 유발하고 저항 시 불편함을 줄이는 것으로 알려져 있습니다.

  1. 그림 2에 표시된 수술 기구를 준비하세요. 수술 기구에는 메스 칼날, 메스 손잡이, 수술용 가위, 바늘 홀더, 지혈 겸자, 그리고 이가 달린 조직 겸자가 포함됩니다. 수컷 스프래그-도울리(SD) 쥐는 약 8주 되었고 몸무게는 약 200g이었습니다.
  2. 이소플루란 가스 마취기로 쥐를 마취하세요. 유도분만을 위해서는 4% 이소플루란을 사용하고, 수술 내내 코콘을 사용해 인공호흡 마취(2% 이소플루란)를 유지하세요. 수술실 온도를 약 28°C로 유지하세요.
    참고: 호흡과 심박수 같은 활력 징후, 각막 반사(반응 없음은 효과적인 마취를 의미), 눈 깜빡임 반사(부재), 발가락 수축 반응(자극 후 수축 없음)을 확인하여 마취의 성공 여부를 판단하세요.
  3. 쥐를 옆으로 눕히고 오른쪽 앞다리를 노출한 뒤 머리깎이로 털을 깎으세요. 멸균 시트를 덮고 오른쪽 근위 앞다리에 지혈대를 감아 수술 출혈을 줄이세요.
  4. 알코올과 베타딘 스크럽을 세 번 번갈아 섞어 피부를 준비하세요.
  5. 그림 3에 보이는 대로 오른쪽 전완의 등 요골 쪽에 1.5cm 길이의 세로 절개를 합니다. 근육 공간을 분리하고 오른쪽 앞다리 반경을 완전히 노출하세요.
    참고: 반경은 근육 사이공간을 따라 근육을 무딘 간격으로 분리하여 노출됩니다. 요골의 등쪽 근육만 노출되어 주변 근육을 완전히 벗기지 않습니다.
  6. 수술용 가위를 사용해 반경을 잘라 횡단골절을 만듭니다. 가위는 반지름에 대해 90도 각도로 배치되어 있습니다(그림 4).
  7. 직경 0.8mm, 길이 10mm의 티타늄 바늘을 종축을 따라 반경 균열에 삽입합니다(그림 5). 그림 6에 보이는 대로 반경과 티타늄 바늘을 봉합(4-0 [1.5미터] 흡수성 없는 실크 꼬임)으로 고정합니다.
  8. 봉합선을 세 번 연속으로 묶고, 네 번의 끊긴 봉합으로 티타늄 바늘을 요골에 고정하세요.
    참고: 골절의 근위부와 원위 부위는 각각 두 번 고정되어 있습니다.
  9. 피부를 봉합(4-0 [1.5미터법] 흡수성 없는 실크 꼬임)으로 피부를 감고, 과도한 봉합선을 잘라내며 상처를 봉합합니다. 베타딘 스크럽으로 피부를 소독하세요.
  10. 상처를 멸균 거즈로 덮고 붕대로 고정하세요. 회복할 때까지 쥐를 우리에 가두어 의식을 회복하세요.
  11. 수술 후 통증 관리:
    1. 동물이 통증 징후를 보이거나, 먹지 않거나, 뒷다리로 걷기를 망설인다면 수의사와 상담하고 추가 진통제를 투여하세요.
      참고: 세푸록심 나트륨은 세균 감염 치료에 사용됩니다. 진통제 투여에는 트라마돌 염산염이 사용됩니다.

2. 마이크로 CT 영상

  1. 이소플루란 가스(유도 용량 4%) 마취기로 쥐를 마취합니다.
  2. 쥐를 스캔 챔버 내에서 엎드린 자세로 눕히고, 목표 스캔 영역을 시야 중앙에 맞추도록 팔다리와 머리 위치를 조정하며, 시술 내내 지속적인 환기와 마취(2% 이소플루란)를 유지하세요.
  3. 고정된 동물 침대를 스캔실에 밀어 넣고 방 문을 닫으세요.
  4. 마이크로 CT 스캔 매개변수를 다음과 같이 설정하세요. 스캔 모드: 표준; 노출 시간: 2분; 시야각: 72 mm; 복셀 크기: 144 μm; 전압: 90 kV; 전류: 88 μA; 필터: 3D-소프트.
    참고: 스캔 데이터는 자동으로 소프트웨어로 전송되며, 3차원 CT 이미지가 생성됩니다.
  5. 목표 조직을 분리하세요.
    1. 원본 마이크로 CT 이미지에서 선택된 뼈 조직 부위를 분석합니다. 전달 함수 선을 슬라이드하여 뼈와 근육을 분리하되, 너무 많은 근육 조직을 포함하지 않도록 하세요. 분할된 뼈 조직 부위에 대해 고해상도 재구성을 수행하여 3D 모델을 생성합니다.
  6. 처리된 이미지를 내보내세요.
    1. 이미지를 처리한 후에는 현재 작업 흐름을 최종 확정하기 위해 종료 버튼을 클릭하세요.
    2. 팝업 창이 뜨니 먼저 정적 이미지를 내보내고 싶은지 확인하려면 정적인 이미지(동적 시퀀스가 아님)를 선택하세요.
    3. 사용 가능한 옵션 중에서 jpeg 를 출력 파일 형식으로 선택하세요.
    4. 분석 또는 문서화에 적합한 고해상도를 유지하기 위해 큰 크기를 선택하세요.
    5. 내보내기 과정을 완료하려면 확인 을 클릭하세요.

3. 방사선 골절 쥐에서 DRG 분리 및 배양

참고: 안락사는 4% 이소플루란 흡입 마취와 함께 시행되며, 이후 빠른 경추 탈구를 통해 동물을 안락사시킵니다. DRG는 방사형 파절 모델 확립 후 20일 후에 추출됩니다.

  1. 척추를 절단하고, C1-C7 척추체를 제거하세요. 경추를 앞쪽과 뒤쪽 정중선을 따라 자르고 좌우로 나누세요. 필요하다면 수술을 용이하게 하기 위해 가시 돌기를 절단하세요.
  2. 척추 간공 안의 척수 조직과 신경 섬유를 부드럽게 청소하세요. PBS가 들어간 주사기로 추간공을 헹구어 혈액을 제거하고 측측 움푹 들어간 부위를 노출시키세요.
    참고: DRG는 외측 움푹 들어간 곳 안에 위치하며, 연한 노란색 결절 형태로 나타나고 양 끝에서 신경 섬유가 연결되어 있습니다.
  3. 치아 조직 겸자를 사용해 DRG를 집어 부드럽게 들어 올린 후, 수술 가위로 양쪽 끝의 신경 섬유를 절단하세요.
  4. 추출한 DRG를 추출 배지가 있는 1.5mL 원심분리관으로 옮깁니다; 얼음 위에 올려놓았다.
    참고: 추출 배지를 준비하려면 α-최소 필수 배지(α-MEM)에 2% 태아 소 혈청(FBS)을 첨가하여 준비하세요. DRG는 추출 배지에서 약 30분간 배양된 후 다음 단계로 진행됩니다.
  5. 천천히 흡입하고 추출 배지를 버리세요. 혼합된 소화 효소 작용액 1mL를 추가하세요. 37°C 물욕에서 60-70분간 소화하세요.
    참고: 혼합 소화 효소 작용액을 준비하기 위해, 100mg의 타입 I 콜라게나제와 100mg의 분산제를 1mL의 인산 완충 식염수(PBS)에 녹입니다. 사용 시에는 5 mg/mL의 작동 용액으로 희석한 후 얼음 위에 보관하세요.
  6. 피펫팅으로 피펫팅하여 피펫팅한 피브로넥틴 작업 용액을 페트리 접시에 코팅한 후, 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 인간 혈장 피브로넥틴 작업 용액(피브로넥틴 작업 용액)은 1 mg/mL 피브로넥틴 정액을 ddH₂O와 희석하여 0.02 mg/mL 작동 용액으로 만듭니다.
  7. 소화 후에는 혼합된 소화 효소 작용액을 흡입하여 버리세요. 완전 배지 1mL를 추가하고 DRG 조직을 여러 번 부드럽게 피펫팅합니다.
    참고: 완전한 배지를 준비할 때, MEM-α 배지 45mL, FBS 4.5mL, 페니실린-스트렙토마이신(PS) 용액 0.5mL를 혼합하고, 0.22 μm 멸균용 미세다공성 막을 통해 여과하여 멸균합니다.
  8. 여과액을 수집하고, 75 × g 에서 원심분리기를 25°C에서 8.5분간 보관합니다.
  9. 원심분리 후에는 상정액을 흡입하여 원심분리관 내에서 버리고, 침전물을 재현탁하기 위해 1mL의 완전 배지를 추가합니다.
  10. 페트리 접시 꺼내. 피브로넥틴 작용 용액은 버리고 PBS로 두 번 세척하세요.
  11. 세포를 코팅된 페트리 접시에 접종하고, 1mL의 완전 배지를 추가한 뒤, 5% CO₂를 넣은 37°C 상온 인큐베이터에서 8-12시간 배양합니다.
  12. 8-12시간 후에는 전체 매체를 대체 매체로 교체하세요. 그 후 2-3일마다 부피의 절반을 대체 배지로 교체하세요.
    참고: 대체 배지를 준비할 때는 MEM-α 배지 44.5 mL, FBS 4.5 mL, 페니실린-스트렙토마이신(PS) 용액 0.5 mL, 디옥시우리딘 0.5 mL를 혼합하여 사용하세요. 0.22 μm 살균용 미세다공성 막을 통해 여과하여 멸균합니다.

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결과

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마이크로 CT 영상은 그림 7 의 요골 골절 쥐 모델과 그림 8의 쥐 요골골 골절 내부 고정 모델의 성공적인 확립을 확인했습니다. 마이크로 CT 영상은 내부 고정 골절 모델 구축일과 모델 구축 후 20일 간의 비교를 하였다. 균열 모델군의 SD 쥐에 대한 모델링 20일 후 미세 CT 분석 결과, 예후가 양호하였다. 영상에서는 모델링된 부위에 흐릿한 골절선이 보였으며, 이는 골절 부위의 뼈 조직이 대부분 치유되었음을 시사합니다. 골절 끝 사이에서 굳은살이 형성되어 점차 융합되어 골절선을 더욱 가렸는데, 이는 뼈 결합의 중후기 단계와 일치합니다. 특히 골절 부위 주변에는 뚜렷한 굳은살 형성도 나타났는데, 치유 과정에서 새로 형성된 뼈 조직으로서 골절 끝을 안정시키고 궁극적인 유합의 기초를 마련하는 역할을 합니다(그림 8

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토론

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요골골절은 임상 실무에서 가장 흔한 장골절 중 하나입니다. 치유 과정은 골 조직 수리와 신경 조절 간의 복잡한 상호작용을 포함하며(예: 신경펩타이드와 등뿌리 신경절에서 분비되는 신경영양 인자에 의한 골세포/쇄골세포 조절 등)15,16,17,18. 쥐는 명확한 유전적 배경과 짧은 생식 주기 덕분에 골절 치유 메커니즘을 연구하는 고전적인 모델입니다. 그러나 반경골 직경이 약 1.0-1.5mm에 불과하다는 해부학적 특징 때문에 임상 표준 내부 고정 장치(예: 1.5mm 나사 및 판)를 맞추기 어려워 신경-골 치유 연구에 적용이 심각하게 제한됩니다. 단순 골수 내 핀 고정은 회전 불안정...

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공개 사항

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모든 저자들은 잠재적인 이해 충돌이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 장쑤 전통 중의학회 과학 연구 프로젝트(XYLD2024038)와 난통 보건 및 웰니스 위원회 과학 연구 프로젝트(QNZ2023115)의 지원으로 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5-플루오로-2' 디옥시우리딘시그마F0503
세푸록심 나트륨  산둥 런제 제약유한회사, 중국궈야오 준지 H20205058
DAPI 염색 솔루션바이오타임C1005
분산상하이 위안예 바이오테크놀로지 유한회사.S25046
태아 소 혈청(FBS)열학16000-044
정혈성 겸자와 NBSP;상하이 의료기기(그룹) 유한회사 및 nbsp;J31070
인간 혈장 피브로넥틴(인간 피브로넥틴)  시그마F0895
이소플루란후륜구동R510-22-10 
살아있는 동물 마이크로 CT 이미징 시스템미국의 퍼킨엘머퀀텀 GX 
MEM-ALPHA 배양 배양지 BIC3060
바늘 홀더 상하이 의료기기(그룹) 유한회사 및 nbsp;200622
운영 시저스 상하이 의료기기(그룹) 유한회사 및 nbsp;J21130
페니실린솔라비오140051251
페니실린-스트렙토마이신 용액 노바셀N-PSS125
포비돈-요오드메이룬비오MB1313800g
메스 칼날상하이 의료기기(그룹) 유한회사RYY070
메스 손잡이상하이 의료기기(그룹) 유한회사 및 nbsp;J11010
봉합사와 nbsp;존슨 & 존슨 메디컬(중국) Ltd., nbsp;SA84G
봉합 바늘상하이 샤오위 메디컬 이텃블스;&델타; 3/8 & 미드닷; 3번과 6
티타늄 바늘톈진 위통 의료기기 2-0X250 
치아 조직 겸자와 nbsp;상하이 의료기기(그룹) 유한회사 및 nbsp;J41055
트라마돌 염산염장쑤 주쉬 제약유한회사, 중국CYHB2201997
튜불린 베타-III시그마CBL412X
제1형 콜라게나제 열학17100-017
자이스 악시오 베르트 A1 역형 형광 현미경자이스악시오 베르트 A1

참고문헌

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