방법 논문

생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

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DOI:

10.3791/69742

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2026년 7월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Blizard Institute, Faculty of Medicine and Dentistry, Queen Mary University of London

이 논문에서

요약

다중화 면역형광은 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지자를 순차적으로 표지하여 조직 구조와 세포 집단의 공간 분석을 지원합니다. 여기서는 노화 관련 마커, 구조적, 면역 마커의 다중성 검출 워크플로우를 제시하는데, 여기에는 수동 및 자동 슬라이드 준비, 반복 영상, 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 단일 세포 분석이 포함됩니다.

초록

다중화 면역형광(IF) 염색은 전통적인 IF 영상에 비해 정교함의 단계적 변화를 의미하며, 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지를 순차적으로 검출할 수 있게 합니다. 이를 통해 더 넓은 세포 유형과 조직 구조의 프로파일링이 가능해지고, 순차적 절절로는 불가능한 방식으로 이들 간의 공간적 관계를 평가할 수 있습니다. 노화의 단일한 보편적 표지는 없으며, 노화 신호는 세포 유형, 노화 유발 시기, 유도 이후 시간에 따라 달라진다는 점이 널리 알려져 있습니다. 따라서 다중성 IF가 제공하는 조합적 접근법은 단일 조직 절편 내에서 편향되지 않은 노화 세포 검출을 가능하게 하는 강력한 도구를 제공합니다.

여기서는 34가지 인간 조직 유형의 코어를 포함한 조직 마이크로어레이가 사용되었습니다. 이 검사들은 구조적, 면역적, 노화 바이오마커를 조합해 10개 분석법으로 염색했으며, 다중화 슬라이드 스캐너로 이미지를 획득했습니다. 이 방법은 조직 내 노화 세포의 풍부도와 공간적 분포를 평가할 수 있게 해줍니다. 순차적 염색, 영상 검사, 염료 불활성화 사이클을 사용하여 다중화 데이터셋을 생성했으며, 이미지는 다중화 형광 슬라이드 스캔 시스템을 사용해 획득했습니다. 수동 슬라이드 준비와 슬라이드 스테인을 이용한 자동 처리 프로토콜, 단일 세포 분할 및 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 공간 분석이 설명되어 있습니다. 전반적으로 이 방법들은 조직 샘플 내 노화 관련 생체표지자의 염색, 영상화 및 공간 분석을 위한 포괄적인 안내와 다중화 영상에 대한 보다 일반적인 지침을 제공합니다.

서론

노화는 노화, 암, 면역 기능과 정상 조직 항상성 1 등 다양한 과정에 기여하는 복잡한 말단 세포 운명입니다. 그러나 노화의 보편적인 바이오마커는 기술된 바 없으며, 식별은 이른바 홀마크2의 범위 평가에 의존합니다. 조직 단약(IF) 영상은 단일 절편 내에서 한두 개의 바이오마커 평가에 한정되어 있어, 동일한 샘플 내 여러 마커 조합 평가가 어렵습니다. 이 문제는 단일 세포 수준4에서 노화 세포 이질성이 나타나고, 생체 내 노화 특징2의 부족으로 인해 더욱 심화되어 새로운 맥락이나 소중한 샘플에서 좁은 검출 패널 선택이 어려워집니다.

다중화 IF 영상은 단일 조직 절 내에서 여러 바이오마커를 순차적으로 검출할 수 있도록 하여 이 한계를 극복하는 것을 목표로 합니다. 이는 형광 표지 올리고뉴클레오타이드 리포터를 사용하거나, 염료 불활성화 공정을 통해 형광 신호를 소결하는 표지된 1차 항체를 사용하는 방식으로 가능합니다. 두 경우 모두 순차적 영상을 사용하여 공간적으로 해상도된 바이오마커 패널을 구축하여, 전통적인 간헐적 단속 기법보다 순차적 조직 염색에 유리합니다. 단일 조직 샘플 내에서 이러한 복잡한 프로필을 생성함으로써 더 많은 노화 표현형, 세포 유형, 조직 구조를 검출할 수 있어 이들의 공간적 관계와 분포를 정교하게 평가할 수 있습니다7.

그러나 다중화 IF 영상 프로파일의 복잡성은 전통적인 IF보다 훨씬 뛰어나지만, 실용적 제약으로 인해 마커 패널은 일반적으로 <100개의 바이오마커로 제한됩니다3. 여기에는 각 라운드마다 에피토프 항원성, 신호 강도 또는 조직 완전성 손실 가능성과, 교차 반응성이 반드시 포함되지 않는 대규모 항체 조합을 최적화하는 어려움이 포함됩니다 8,9. 따라서 각 항체 라운드의 최적 조성을 결정하는 것은 멀티플렉스 패널 설계에서 중요한 고려 사항입니다. 따라서 전체적인 '플렉스'는 공간 전사체학과 같은 기법으로 달성되는 것보다 적습니다. 그러나 다중성 IF는 전사체 수준이 아닌 단백질을 정량화하기 때문에 두 기법은 상호 보완적일 수 있으며 대규모 "다중 오믹스" 파이프라인에서 결합될 수 있습니다10.

여기서는 34가지 조직 유형의 코어를 포함한 인간 조직 마이크로어레이를 영상화했습니다. 이들은 구조적, 면역적, 노화 바이오마커를 조합해 10개의 분석법으로 염색하였다: 판세포케라틴(PANCK), CD31, 알파 평활근 액틴(aSMA), 케라틴 15(K15), 비멘틴, FOXP3, CD8, Ki67, p16, 라민 B1. 슬라이드의 수동 준비와 자동화 슬라이드 스테이너를 통한 자동화 적용에 대한 상세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 대표적인 실험 비교 결과, 후자는 조직의 완전성과 대부분의 마커에 대해 형광 신호11을 개선하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, HALO 디지털 병리학 소프트웨어를 이용한 다중화 조직 마이크로어레이 이미지 분석을 위한 단계별 가이드가 제공되며, 단일 세포 분할 및 바이오마커 발현의 공간 분석을 포함합니다. 대표적인 결과는 바이오마커 패널을 기반으로 한 노화 세포 검출 및 정량화의 기술적 타당성을 보여줍니다(노화 분류의 포괄적인 생물학적 검증과는 다릅니다).

전반적으로 이 방법론은 생체 내 노화 바이오마커의 다중화 평가 가이드이자 다중화 영상에 대한 보다 일반적인 안내서로 제시됩니다(그림 1).

프로토콜

윤리 선언

이 연구에 포함된 조직 샘플은 Barts Health NHS 아카이브의 진단 요구사항에 불필요한 것이었으며, 모든 관련 기관 및 규제 지침을 준수하여 채취되었고 윤리 프로토콜 10/H0704/65 및 05/QO605/140에 따라 승인되었습니다.

1. 슬라이드 준비, 항원 추출 및 차단

참고: 별도의 언급이 없는 한, 모든 단계는 상온(~20–25 °C) 및 표준 실험실 조건에서 수행됩니다.

  1. 초기 샘플 마운팅
    1. 최적의 조직 보존을 위해 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 조직 샘플을 고품질 현미경 슬라이드(양전하)에 장착하고, 새 봉투에서 준비하여 전하 손실을 최소화합니다.
    2. 섹션 두께는 5 μm를 넘지 않고, 최대 크기는 4 x2 cm 2로 중앙에 장착하여 커버슬립리스 슬라이드 홀더 관측창 내에서 시야가 확보되도록 해야 합니다.
    3. 샘플 준비는 디클로킹 챔버를 통해 수동으로 수행하거나 자동 스테인을 통해 자동화된 방식으로 수행할 수 있습니다.
  2. 은폐 해제실
    1. 조직을 위로 향한 채 60°C에서 하룻밤 동안 최대 24장의 슬라이드를 구워주세요.
    2. 왁스 제거 및 재수화는 자일렌에서 5분간 순차적으로 배양(두 단계 수행)을 사용하며, 슬라이드를 각 시약에 완전히 담근 방식으로 에탄올 농도(100%, 100%, 90%, 70%)를 낮춥니다.
    3. PBS에 5분간 담그면서 슬라이드를 세척하세요(스텝 두 번 수행).
    4. 0.3% Triton X 100을 PBS에 희석한 상태로 10분간 담가서 투과성 슬라이드를 만듭니다.
    5. PBS에 5분간 담그면서 슬라이드를 세척하세요.
    6. 각 구역에 다음 시약을 추가하여 디클로킹 챔버를 준비하세요:
      1. 500mL ddH2O를 주 챔버에 투여합니다.
      2. 금속 레일 바스켓의 중앙 저장소 위치에 250 mL ddH2O를 주입합니다.
      3. 금속 거반 바스켓의 왼쪽 저장소 위치에 250 mL pH 6 항원 언마스킹 솔루션 1(ARS1)을 사용함.
      4. 금속 선반 바스켓의 오른쪽 저장소 위치에 250 mL pH 9 항원 언마스킹 용액 1(ARS2)을 넣어 10배 재고에서 ddH2O에 희석).
    7. 샘플을 ARS1 용액에 담근 후 세 저수지 모두에 증기 스트립을 깔아줍니다.
    8. 뚜껑을 클로킹 챔버에 올려놓고 비틀어 닫힌 상태로 고정시키며, 압력 방출 값이 압력 스템에 평평하게 위치하도록 합니다.
    9. 프로토콜을 선택하고 시작하며, 이 프로토콜은 미리 설정된 온도인 110 °C까지 상승하고 4분간 유지됩니다.
    10. 가열 단계에서 온도 표시판에 70 °C가 표시되면 20분 타이머를 시작하세요. 이 기간 동안 시스템은 온도에 도달해 유지되고 압력을 낮추기 시작합니다.
    11. 핀셋으로 압력 해제 밸브를 조심스럽게 기울이고 뚜껑을 열어 시스템을 완전히 감압하세요. 개울 스트립을 확인해 온도가 맞는지 확인하세요.
    12. ARS1 해액에서 ARS2 용액으로 샘플을 옮깁니다. 챔버 뚜껑을 다시 닫고(잠그거나 재압력하지 마세요) 20분 타이머를 시작하세요.
    13. 슬라이드가 들어 있는 저장소 바스켓을 벤치 상판으로 분리하세요.
    14. 바구니를 실온의 작업대 위에 10분간 두세요.
    15. 샘플을 PBS에 5분간 담그고 세척하세요(이 과정을 4회 반복).
    16. 샘플을 1시간 동안 10% 당나귀 혈청과 0.3% BSA가 포함된 PBS에 담그어 차단합니다.
    17. 샘플을 PBS에 5분간 담그고 세척하세요.
    18. PBS에 희석된 DAPI(1 μg·mL-1)에 15분간 담근 역염색 샘플.
    19. 샘플을 PBS에 5분간 담그고 세척하세요.
    20. 슬라이드를 커버슬립리스 슬라이드 홀더에 장착하세요.
  3. 자동 슬라이드 스테이너 (예: Bond RXm)
    1. 워시, ER1, ER2 벌크 시약을 아래 서랍에 넣으세요.
    2. 시스템을 켜서 초기화하세요.
    3. 폐기물 용기는 비어 있고, 다른 모든 시약은 최소 수준 이상이어야 합니다.
    4. 전체 슬라이드 수에 대해 시스템이 지정한 부피에 따라 다음 시약을 포트 위치에 채워 시약 암을 준비하세요:
      1. 시약 팔에 PBS가 채워진 빈 통을 삽입합니다.
      2. 0.3% PBS로 희석된 Triton X-100이 들어 있는 시약 주전자를 시약 팔에 삽입합니다.
      3. 차단 완충제가 들어 있는 시약 포트를 삽입합니다 – 10% 당나귀 혈청, 0.3% BSA에 PBS에 삽입.
      4. PBS로 희석된 DAPI(1 μg·mL-1)가 포함된 시약 통을 시약 팔에 삽입합니다.
    5. 준비된 용기 항변과 함께 시약 암 전체를 시스템에 삽입하세요.
    6. 화면에 표시되는 지침을 따라, 밤새 진행할 다음 단계를 포함하는 자동 염색 프로토콜을 구축합니다:
      1. 60°C에서 10시간 동안 구워주세요.
      2. 0.3% Triton X-100을 PBS에 희석하여 배양합니다(10분).
      3. 대량 세척 시약(미리 프로그래밍된 루틴)으로 세척하세요.
      4. 에피토프 리트리버 1(ER1) 벌크 시약(20분, 100 °C)으로 배양하세요.
      5. 대량 세척 시약(미리 프로그래밍된 루틴)으로 세척하세요.
      6. 에피토프 리트리버 2(ER2) 벌크 시약(20분, 100 °C)과 함께 배양하세요.
      7. 미리 프로그래밍된 루틴으로 벌크 워시 시약으로 세 번 세척하세요.
      8. 블로킹 버퍼와 함께 인큐베이팅 - 10% 당나귀 혈청과 0.3% BSA를 PBS에 1시간씩 넣었습니다.
      9. DAPI(1 μg·mL-1 in PBS)는 4회, 각 5분씩 투여했습니다.
      10. 세탁(미리 프로그래밍된 루틴).
    7. 모든 추가 부피가 150 μL로 설정되어 있고, 드롭다운 메뉴를 통해 준비 단계가 왁스 제거로 설정되도록 하세요.
    8. 최대 30장의 슬라이드에 대한 세부 정보를 추가하고 바코드 라벨을 출력하세요.
    9. 슬라이드 트레이를 분리하고 슬라이드를 위를 향하게 삽입하세요. 각 슬라이드에 위쪽을 향한 위에 덮개 타일을 깔아주세요. 바코드 라벨을 슬라이드에서 위에서 아래로 읽을 수 있도록 붙이세요.
    10. 슬라이드 트레이를 다시 오토스테이너에 넣고 앞 트레이 버튼으로 잠그세요.
    11. 현재 슬라이드가 장착된 각 슬라이드 암의 시작 버튼을 누르세요.
      참고: 전체 프로토콜은 실행하는 데 ~15시간이 걸립니다(베이킹 10시간 포함). 재수화 세척을 아끼기 위해 시작 시간을 늦출 수 있습니다.
    12. 사이클이 끝난 후 슬라이드를 커버슬립리스 슬라이드 홀더에 장착하세요.
  4. 장전 커버슬립리스 슬라이드 홀더
    1. 슬라이드를 커버슬립리스 슬라이드 홀더에 넣고, 상단과 오른쪽 가장자리가 금속 스톱에 맞춰지도록 하세요.
    2. 슬라이드를 플라스틱 캠(두 개를 동시에 사용)으로 고정하려면 닫힌 자물쇠 위치로 돌려 고정하세요.
    3. 슬라이드가 완전히 평평하게 자리 잡고 홀더 안에서 흔들리지 않는지 확인하세요.
    4. 커버슬립리스 슬라이드 홀더 인서트 챔버를 슬라이드 위에 올려놓고, 양손으로 사이드 바를 집어 압력을 제한하고 파손을 방지하세요.
    5. 입구 포트를 통해 커버슬립리스 슬라이드 홀더에 50% 글리세롤이 포함된 2mL 마운팅 매체를 적재합니다.
    6. 슬라이드 왼쪽에 바코드 라벨을 어느 방향으로든 붙이세요.
    7. 영상 촬영으로 넘어가세요.

2. 다중화 영상

  1. 영역 선택 및 자가형광 영상
    1. 다중화 영상 획득 소프트웨어(예: Mx 워크플로우 (4.2.0.4))를 열고 프로토콜 퍼블리셔 마법사를 사용해 필요한 라운드/바이오마커와 노출 시간을 포함한 프로토콜을 생성하세요.
      참고: 각 항체가 사용 가능한 채널에 할당되는 방식을 미리 결정하세요. 약한 마커(즉, 노출 시간이 더 긴 마커)는 자가형광이 가장 적은 Cy5 및 Cy7 채널로 제한합니다. 다중화 형광 영상 시스템에서는 한 라운드당 최대 4개의 항체를 사용할 수 있습니다.
    2. 가상 H&E 이미지가 필요하다면, Cy3 채널이 반드시 확보되어야 합니다.
    3. 배치 생성 도구를 통해 바코드 번호를 이용해 슬라이드를 프로토콜에 추가하여 다중 실험 워크플로우를 만듭니다.
    4. 획득 소프트웨어(4.2.0.4)를 통해 슬라이드를 현미경에 불러와, 각 슬라이드의 2배 및 10배 이미징 단계를 통해 관심 영역을 그리는 워크플로우를 따르세요. 영역을 선택할 때는 각 시야에 최소 두 개의 이웃이 있어야 스티치 문제를 방지할 수 있습니다.
    5. 빈 유리 이미지를 최소화하여 스티치 문제를 방지하고 빈 필드를 선택하지 않음으로써 실행 시간을 단축하세요.
    6. 2.1.1단계에서 설정한 노출 시간을 사용하여 20배 자가형광 영상을 수행하고 품질 관리(QC) 마법사를 따르세요. 초점이 맞지 않는 영역이나 아티팩트가 없다는 것을 시각적으로 확인하세요. 이들이 확인되면 QC에 실패하고 재이미징합니다.
      참고: 허용 가능한 QC 엄격성의 단일 측정 지표는 없으며, 성공은 필요한 실험 측정값과 샘플의 소중도에 달려 있습니다. 충분한 염색 강도를 가진 초점 조직은 이상적으로는 시각적으로 선명하고 선명하게 보여야 합니다. 조직 박리/분해 소규모 부위가 자주 관찰되는데, 추가 영상 촬영으로는 개선되지 않고 샘플의 나머지 부분이 잘 촬영되어 있다면 견딜 수 있습니다. 큰 밝은 인공물(예: 먼지)이 관찰되면 슬라이드를 청소하고 재이미징하여 제거하는 것이 최선의 방법입니다.
    7. 각 멀티플렉스 라운드마다 반복되는 과정에서 최종 바이오마커 신호에서 빼는 배경 이미지를 생성합니다.
      참고: 모든 멀티플렉스 라운드는 획득 소프트웨어를 통해 자동으로 정렬됩니다.
  2. 로봇 플레이트 핸들러 사용
    1. 획득 소프트웨어가 닫혀 있는지 확인하세요.
    2. 로봇 통합 소프트웨어를 열고 시작을 클릭하세요.
    3. 스택된 커버슬립리스 슬라이드 홀더를 입력 스택에 넣으세요.
    4. 출력 스택이 비어 있는지 확인하세요.
    5. 로봇 플레이트 핸들러 제어 소프트웨어(예: Harmony 로봇 소프트웨어 (3.2.0))를 열고 마법사를 따라 올바른 플레이트 유형과 번호가 선택되었는지 확인하세요.
    6. 시작을 클릭하면 플레이트 핸들러가 현미경을 로드하며, 슬라이드 바코드 덕분에 올바른 작업 흐름 단계를 자동으로 알게 됩니다.
      참고: 아래 바이오마커 영상 단계에서 로봇 로더를 사용할 경우, 소프트웨어에서 "동적 설정 노출 시간" 옵션을 해제하고 미리 설정된 노출 시간을 사용하는 것이 필수적입니다.
  3. 순차적 바이오마커 염색, 염료 불활성화 및 다중화 영상
    1. 13,000 x g 원심분리기 항체를 실온에서 1분간 검사해 인위물을 제한합니다.
    2. 0.3% BSA를 함유한 PBS에 항체 용액을 준비합니다.
      참고: 최종 항체 농도는 다양하지만, 1:200 희석은 새로운 항체 최적화에 좋은 출발점입니다.
    3. 커버슬립리스 슬라이드 홀더 포트에서 피펫으로 마운팅 매체를 제거하고, 0.01% 트윈이 함유된 2mL PBS를 5분간 세척합니다(이 과정을 3번 반복).
    4. PBS를 제거하고 350 μL 항체 용액을 PBS에 희석한 상태로 피펫팅하여 항체 염색을 수행합니다. 이 부피는 염색실 내에서 샘플을 완전히 덮도록 최적화되었습니다.
    5. 상온에서 1시간 동안 작업대 위에 보관하세요.
    6. 커버슬립리스 슬라이드 홀더 포트에서 피펫으로 추출하여 항체 용액을 제거하고, 0.01% 트윈이 함유된 2mL PBS를 5분간 세척합니다(이 과정을 3회 반복).
    7. PBS를 제거하고 2mL 마운팅 매체를 추가하세요.
    8. 현미경에 커버슬립리스 슬라이드 홀더를 삽입하여 자동 라운드별 이미징 단계를 시작합니다.
    9. 완료되면 화면에 표시된 QC 단계를 진행하며 워크플로우를 진행하세요.
    10. 커버슬립리스 슬라이드 홀더 포트에서 피펫으로 마운팅 매체를 제거하고, 0.01% 트윈이 함유된 2mL PBS를 5분간 세척합니다(이 과정을 3번 반복).
    11. 7 mL ddH2O, 2 mL 0.5M NaHCO3 , 1 mL 30% H2O2를 포함한 염료 불활성화 용액을 신선하게 준비합니다. 사용 직전에 이 용액을 준비하고 슬라이드에 즉시 적용하세요.
      주의: 과산화수소는 적절한 실험실 개인 보호 장비(PPE)를 사용하여 다루어야 합니다.
    12. 작업 용액에H2O2 를 추가한 직후 PBS를 제거하고 각 슬라이드당 2 mL 염료 불활성화제를 추가합니다.
    13. 슬라이드 홀더의 벤치 위에서 15분간 인큐베이팅하세요.
    14. 커버슬립리스 슬라이드 홀더 포트에서 피펫으로 염료 불활성화 용액을 제거하고, 0.01% 트윈 함유 2mL PBS에 5분간 세척합니다.
    15. PBS를 제거하고 2mL 마운팅 매체를 추가하세요.
    16. 현미경에 커버슬립리스 슬라이드 홀더 홀더를 삽입하여 자동 원형 20배 자가형광 이미징을 시작합니다.
    17. 완료되면 화면에 표시된 QC 단계를 진행하며 워크플로우를 진행하세요.
    18. 필요한 만큼 2.3.1부터 2.3.17까지 반복하세요. (이 절차는 제조사에 의해 최대 10발까지 검증되었으나, 조직 완전성이 이 한계의 주요 결정 요인입니다.)

3. 디지털 병리 소프트웨어를 통한 자동 HighPlex 분석

  1. 데이터 로드 및 TMA 분할
    1. 다중화된 IF 이미지를 디지털 병리 소프트웨어의 "연구" 탭으로 드래그 앤 드롭하세요.
      1. 가상 H&E 이미지는 별도로 가져와야 합니다.
    2. 조직 마이크로어레이(TMA) 샘플의 경우 "TMA 모듈"을 사용합니다. 이로 인해 코어별로 분류할 수 있어, 전체 슬라이드를 다루는 것보다 데이터 추적이 훨씬 간단해집니다.
    3. TMA 블록을 생성하려면 먼저 차단 행동으로 이동하고 새로운 TMA 맵을 생성하세요.
      1. 이 정보는 수동으로 입력하거나 가져오기 마법사를 통해 엑셀 스프레드시트를 통해 입력할 수 있습니다.
    4. 연구 탭에서 샘플을 우클릭한 후 "Segment TMA"를 선택하여 TMA를 세분화하세요.
    5. 코어 크기를 선택하고 빨간 박스를 이동시켜 지도에 맞춰 정렬하세요. 완료 후 저장을 클릭하세요.
    6. 분석과 데이터 내보내기가 이제 코어 단위로 운영될 수 있습니다.
      참고: 다음 파이프라인은 TMA 모듈 없이 전체 조직 절편에서도 실행할 수 있습니다.
  2. 단일 표적 분할
    1. 분석 탭으로 이동하세요.
    2. "설정 동작" 드롭다운 메뉴에서 로드를 클릭하고 HighPlex 형광 분석 모듈을 선택하세요.
      1. 이 결과에는 v5.2.2가 사용되었습니다.
      2. 염료 선택 시 평가 중인 마커를 수동으로 또는 "자동 채우기" 기능을 통해 채우세요.
      3. 핵 검출에서는 HALO 버전에 적합한 분할 유형을 선택합니다(여기서는 전통적인 비AI 버전을 설명합니다).
      4. 핵 대비 임계값을 설정하여 핵을 감지합니다(보통 0.4 – 0.6 범위).
        1. 핵을 포착하기 위한 최소 핵강도를 설정하세요(보통 0.05 이하로는 안 됩니다).
        2. DAPI 신호의 세기에 따라 최대 이미지 밝기를 약 0.4로 낮출 수 있습니다(16비트 이미지의 동적 범위 때문에 1에서 줄임).
        3. 조직 유형에 따라 분할 공격성, 채움 구멍, 필터 크기 등 추가 매개변수를 조정하세요.
      5. 이 과정을 막과 세포질 검출에 따라 반복합니다.
        1. 전통적인 세포질 검출의 경우, 칼라 반경 2에서 5 사이가 좋은 출발점인 경우가 많습니다.
  3. 바이오마커 양성 임계값 선택
    1. 염료 선택 단계에서 선택된 모든 바이오마커는 원시 강도 값으로 측정됩니다.
    2. 각 마커에 대해 이진법(양성 vs 음성) 또는 다수(높음, 중간, 낮음, 음성) 임계값 분류를 설정하고, 염색 패턴에 따라 핵, 세포질 또는 막 구획의 슬라이더를 사용해 값을 조정합니다.
      1. 이진 임계값을 설정하려면 하단 슬라이더만 조정하여 컷오프 값을 결정하세요.
      2. "분석" 메뉴의 실시간 튜닝 창을 사용해 성능을 평가하고, 분석 마스크를 켜고 끄는 방식으로 원시 염색 수준과 비교하세요.
    3. "표현형" 기능을 사용해 마커 조합을 만드세요.
      1. 논리 게이팅은 모든 마커에 대해 AND/OR 양성/음성을 포함하여 모든 스테인에 무제한 매트릭스를 구성할 수 있게 합니다.
    4. 단일 대상 데이터가 필요하면(공간 분석에 필요) 저장 객체 데이터를 true로 설정하세요.
    5. 프로토콜을 저장하고 연구 탭에서 모든 슬라이드를 하이라이트하여 분석하고, 오른쪽 클릭으로 원하는 프로토콜로 분석하세요.

4. 결과 검토

  1. 디지털 병리 소프트웨어에서의 공간 평가
    1. 디지털 병리학 소프트웨어의 "결과 탭"에서 모든 결과를 확인하세요.
    2. 상단의 요약표는 현재 이미지 전반에 걸쳐 모든 특징의 평균을 나타냅니다.
      1. 별도로 열면 단일 코어에 해당합니다.
    3. 아래 표에는 모든 특징에 대한 단일 대상 데이터가 표시됩니다.
      1. 테이블에서 선택하거나 이미지를 클릭하여 개별 데이터 포인트를 조문할 수 있습니다.
    4. 적절한 열에 표현형, 마커 양성 또는 강도 임계값을 필터링하세요. 이 요소들은 "객체 행동" > "플롯" > "공간 플롯"으로 탐색하여 플롯할 수 있습니다.
    5. 여러 그룹에 대해 이 작업이 수행되면 공간 분석을 수행할 수 있습니다.
    6. "공간 분석" 버튼을 선택하고 필요한 옵션을 선택하는 방법:
      1. 최근접 이웃: 특정 셀 유형의 관측값과 다른 셀 타입의 가장 가까운 관측값까지의 거리를 구합니다.
      2. 근접 분석: 선택한 세포 유형 주변의 밴드로 측정하며, 다른 세포 유형의 수와 거리를 정량화합니다.
      3. 침투 분석: 특정 셀 유형이 발견되는 특정 주석 레이어(주석 도구를 통해 이미지에 표시됨)까지의 거리를 밴드 단위로 측정합니다.
      4. 밀도 히트맵: 이미지 전반에 걸쳐 셀 유형의 분포를 시각화합니다.
    7. 공간 분석은 슬라이드 동작 내 '결과 배치' 버튼과 '결과 행동' 드롭다운 메뉴를 통해 모든 TMA 코어에 걸쳐 수행할 수 있습니다.
  2. 수출 결과 디지털 병리 소프트웨어
    1. 결과는 TMA 탭에서 "슬라이드 액션" > "내보내기"로 이동하면 내보낼 수 있습니다.
    2. 요약 데이터만 또는 전체 단일 표적 분석은 고급 탭을 통해 내보낼 수 있습니다.
    3. 데이터를 .csv 파일로 생성하여 R 같은 소프트웨어에서 분석하여 모든 세포의 바이오마커 강도에 대한 집단 수준 분석을 생성할 수 있습니다. 단일 객체 특징으로는 샘플 ID, 셀별 고유 객체 ID, 각 마커의 원시 강도 값, 표현형 분류 및 공간 좌표가 포함됩니다.

결과

10-plex IF와 페어링 가상 H& E 이미지는 34종의 인간 조직 유형을 포함하는 136개의 조직 마이크로어레이 코어를 서로 다른 방법론으로 준비한 두 개의 슬라이드에 걸쳐 생성되었습니다(그림 2). 이 대표적인 이미지들은 보존된 조직 형태와 조직 마이크로어레이 코어 전반에 걸쳐 여러 바이오마커의 명확한 검출로 성공적인 다중염색을 보여줍니다. 한 슬라이드는 자동 슬라이드 스테이너를, 다른 한 명은 수동 슬라이드 준비 과정을 사용했습니다. 수동적이고 은폐 해제 챔버 기반 방법에서는 조직 박리와 손실 또는 미끄러진 코어 포함 조직 인공물 발생률이 더 높게 관찰되었습니다(그림 3). 이러한 인공물은 샘플 또는 코어당 분석 가능한 조직 영역을 감소시켜 후속 다중화 이미지 분석에 영향을 미칩니다. 이러한 관찰은 프로토콜이 다양한 조직 유형에서 신뢰할 수 있는 다중화 염색 및 영상 촬영을 가능하게 함을 확인시켜 줍니다.

성공적인 다중성 영상은 보존된 조직 형태, 염색 라운드 간의 일관된 정렬, 그리고 명확하고 특이적인 바이오마커 신호 검출로 표시됩니다. 반면, 최적이 아닌 결과는 조직 박리, 신호 손실, 또는 분석 가능한 영역을 줄이고 후속 분석을 저해하는 영상 아티팩트로 특징지어집니다.

다음으로, PANCK(상피 조직), CD31(내피 조직), aSMA(기질 조직), 케라틴 15(K15; 기저상피), 비멘틴(중간엽 세포), Ki67(증식 마커), CD8(세포독성 T 세포), FOXP3(TREGs) 등 표지자의 염색 프로파일을 두 슬라이드 준비 기법 모두에서 비교했으며, 수동 방법에서는 시각적으로 신호가 약간 감소하는 현상이 관찰되었습니다 (그림 4A)). 디지털 병리 소프트웨어의 바이오마커 분류 임계값을 활용하여 샘플을 데이터셋 내 약 63만 개의 세포 각각에 대해 양성 및 음성 집단으로 층화했습니다(그림 4B). 마커 신호의 정량적 평가는 디지털 병리 분석 워크플로우에서 파생된 강도 측정을 사용하여 수행되었습니다. 자동 슬라이드 스테인을 사용할 때 수동 과정에 비해 양성 개체군 내 5/8 바이오마커가 소폭 증가하는 집단 밀도 추정치와 중앙값 강도 값은 수동 과정에 비해 약간 증가했습니다(그림 4C).

패널을 마친 후, 위에서 설명한 마커들은 라민 B1(핵막) 및 p16(사이클린 의존성 키나제 억제제)의 추가 바이오마커와 결합되어 단일 샘플 내 10개 마커 전반의 상대적 조직 풍부도와 분포를 시각화할 수 있게 되었습니다(그림 5). 많은 바이오마커를 프로파일링하는 능력은 노화 분야에서 특히 유용한데, 노화 분야에서는 여러 개의 직교 마커를 평가하여 유효한 분류를 보장해야 합니다2. 여기서 우리는 p16 고인구 및 저인구 집단 내에서 라민 B1 강도의 변화를 프로파일링할 수 있었습니다. 중요한 점은, 이 샘플이 다중화된 샘플이었기 때문에, 이 세포들을 동일한 조직 내 다른 세포 유형의 분포와 비교하여 공간적 맥락에 배치할 수 있었다는 것이다(그림 6A). 디지털 병리 소프트웨어 분류 임계값을 통해 이 염색을 정량화하여 p16 양성 세포가 음성 세포보다 라민 B1 수치가 낮음을 보였음을 입증하였으며(그림 6B), 이는 이전에 기술된 노화 관련 마커 패턴과 일치하는 프로필이다12. 또한 라민 B1 음성 세포가 p16 수치가 더 높다는 점도 관찰했습니다(그림 6C). 디지털 병리 소프트웨어의 표현형 기능(단일 세포 분할과 다중 마커의 임계값을 기준으로 세포 분류)을 이용하여, 이 마커들의 조합을 이용해 p16 양성과 라민 B1 음성인 세포 집단을 노년형으로 정의했습니다. 그 후, 조직 유형별로 모든 코어에 걸쳐 이 세포들의 비율과 10개의 마커를 개별적으로 정량화했습니다(그림 6D). 이 결과물은 다중화 데이터셋 내 여러 조직 유형에 걸친 바이오마커 정의 세포 집단의 정량적 비교를 가능하게 합니다. 분석 파이프라인은 단일 세포 수준에서 작동하지만, 현재 데이터셋은 주로 집단 수준 분포를 사용하여 제시됩니다. 이 데이터셋에서 p16 양성 세포의 비교적 낮은 개체수는 p16과 라민 B1 간의 세포별 상관관계 분석에 통계적 한계가 있을 수 있으므로, 이러한 관계는 신중하게 해석되어야 합니다.

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그림 1: 전체 다중화 면역형광 워크플로우를 보여주는 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-2
그림 2: 다중화 영상 개요: (A-B): 가상 H& 1라운드의 DAPI 염색과 Cy3 자가형광에서 생성된 E 이미지로, 자동 슬라이드 스테인너 또는 수동 슬라이드 준비 공정을 사용해 조직의 무결성을 시각화하기 위해 작성되었습니다. (C-D): 모든 바이오마커의 다중성 단속 염색. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 유물 유형의 예시: 주로 슬라이드 준비 과정에서 생성될 수 있는 다양한 유형의 유물의 대표적인 예시입니다. 부분 조직 박리는 초점이 맞지 않는 영역으로 관찰되며, 이후 라운드에서 조직 정렬에 문제를 일으킬 수 있습니다. 코어가 빠지면 실험 능력이 저하되고, 섬세한 조직 유형에서 불균형적으로 자주 발생합니다. 슬립 또는 겹치는 코어는 코어가 TMA에서 떨어져 다른 영역에 달라붙어 숨겨진 코어를 분석하기 어렵게 만들어 샘플 손실을 악화시키는 현상입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: BOND 오토스테이너와 수동 슬라이드 준비 형광 신호 비교: (A): 구조적 표지인 판사이토케라틴(PANCK), CD31, 알파 평활근 액틴(aSMA)에 대한 대표적인 IF 염색. 이 세 이미지의 병합 모습은 첫 번째 열에 나와 있습니다. (B): 디지털 병리 소프트웨어 이진 분류 분석을 통해 다양한 세포 유형에서 양성 마커 검출을 나타냅니다: CD31(빨강), FOXP3(청록색), Ki67(노란색), CD8(흰색), PANCK(초록색). 흰색 박스는 하단 패널의 디지털 줌 영역을 나타냅니다. (C): 조직 준비 방법(자동 슬라이드 스테인어 = 빨강, 수동 = 파랑)과 마커 양성(어두운 경우 = 음성, 밝은 경우 = 양성)으로 그룹화된 세포 집단의 바이오마커 강도 정량화. 각 밀도 플롯 아래 면적은 분석된 세포 집단의 100%를 나타냅니다. AF = 자가형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 5: 전체 다중성 패널: 충수 조직에서 A-B 를 보여주는 대표 이미지: 전체 10중성 단파 패널 C: PANCK (녹색), D: CD31 (빨간색), E:aSMA (노란색), F: K15 (분홍색), G: 비멘틴 (흰색), H: 라민 B1 (청록색), I:p16 (금색), J: Ki67 (밝은 노란색), K: CD8 (밝은 녹색), L: FOXP3 (보라색). 화이트 박스 = 디지털 줌 (병합, CD31, aSMA, K15, Vim, LB1, p16), 점선 박스 = 디지털 줌 (Ki67, CD8, FOXP3). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 6: 노화 마커 검출: (A): 췌장 조직 이미지에서 대표적인 IF로, 라민 B1(청록색)과 p16(금색)의 대조적인 염색 패턴과 PANCK(녹색), CD31(빨간색), Vimentin(흰색)과의 공간적 관계가 보입니다. (B): p16 양성 및 음성 세포 집단에서 라민 B1(LB1) 핵 강도의 정량화. (C): 라민 B1(LB1) 양성 및 음성 세포 집단에서 p16 세포 강도의 정량화. 곡선 아래 밀도 구역 면적은 전체 인구의 100%를 나타냅니다. (D): 각 바이오마커 또는 노화 표현형(p16+/LB1-ve)에 대해 조직 유형 간 평균 코어 퍼센트 양성의 Z-스코어 정규화 히트맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

자동화 플랫폼을 통한 다중화 IF 영상은 단일 조직 절편 내 대규모 바이오마커 패널의 미묘한 프로파일 생성을 용이하게 합니다. HALO와 같은 디지털 병리 소프트웨어와 결합하면, 세포 유형들의 풍부도와 공간적 관계, 그리고 서로 다른 조직 구조를 통한 분포를 모두 조사할 수 있습니다. 이는 노화 세포의 견고한 분류를 위해 특징 조합의 프로파일링에 의존하는 노화 분야에 상당한 가치를 제공할 잠재력을 지니고 있으며, 노화 세포는 상당한 이질성을 가지고 있어 순차적 조직 절편으로는 불가능한 단일 표적 세포 프로파일링이 필요하다. 더불어, 노화 세포 부담은 조직마다 다르고, 노화 과정에서 축적되는 속도도 다를 수 있으며, 신뢰할 수 있는 생체 내 노화 지표가 부족하다는 점이 확인되어 더 큰 유연성이 요구되는 새로운 맥락에서 더 많은 바이오마커 패널을 활용하는 것이 바람직합니다 5,15,16. 중요한 점은, 이전 연구들이 노화 세포의 축적 및 시간적 역학이 조직에 매우 의존적이며, 장기 시스템 간에 풍부도와 시작 시 상당한 차이가 있음을 보여주어 노화가 조직 간에 동시에 일어나지 않는다는 점을 강조했다. 공간 전사체학이나 영상 질량세포측과 같은 대체 공간 프로파일링 기법은 보완적인 분자 정보를 제공할 수 있습니다; 다중성 면역형광은 단백질 발현을 직접 측정하여 온전한 조직 절편 내 세포 표현형의 고해상도 공간 분석을 가능하게 합니다. 멀티플렉스 IF의 순차적 특성은 반복적인 발견 파이프라인에도 적합합니다.

멀티플렉스 IF 이미징은 자동화된 슬라이드 스테이너와 통합하여 고처리량 워크플로우에서 수행할 수 있습니다. 표준화 측면에서 상당한 장점을 제공하는 것 외에도, 자동 슬라이드 준비는 수동적인 투명 해제 챔버 기반 접근법보다 조직 박리와 핵심 손실이 적어 인위적 유물을 줄이는 것으로 보입니다. 그러나 이러한 관찰은 정성적 비교에 기반한 것이며, 가공으로 인한 조직 손상의 차이를 공식적으로 확인하려면 추가적인 정량적 평가가 필요합니다. 이는 피부나 유방과 같은 지방 조직에서 특히 우려되는 문제입니다. 더불어, 커버슬립리스 슬라이드 홀더 시스템은 로봇 플레이트 핸들러와의 통합을 가능하게 하여, 야간 영상 촬영과 같은 워크플로우 개선을 통해 더 높은 처리량과 작업자 시간을 단축할 수 있습니다. 자동화가 처리량과 표준화를 개선할 것으로 기대되지만, 이러한 개선에 대한 정량적 벤치마킹은 본 연구에서 공식적으로 평가되지 않았으며, 측정된 결과라기보다는 실용적인 관찰로 해석되어야 합니다. 조직 마이크로어레이로 준비된 샘플을 사용하면 비교적 적은 수의 슬라이드로 수백 개의 환자 샘플에 대한 포괄적인 분석을 생성할 수 있으며, 이는 임상 조직 샘플 내 노화 세포 조사 연구를 촉진할 수 있습니다 5,11.

자동 슬라이드 스테인을 사용한 마커 세기가 수동 슬라이드 준비 과정보다 약간 증가하는 것이 관찰되었으나, 실제로는 낮은 신호를 더 긴 노출 시간이나 분석 임계값 조정으로 보통 극복할 수 있어 이 이점은 미미합니다. 항체 최적화, 다중화 패널 설계, 영상 매개변수 선택 등 여러 핵심 단계가 분석의 성공에 중요한 영향을 미칩니다. 항체 적합성, 신호 강도, 반복 염색 사이클에 대한 저항성을 신중히 검증하는 것이 재현 가능하고 고품질의 다중화 데이터를 보장하는 데 필수적입니다. 훨씬 더 중요한 것은 바이오마커의 라운드 최적화와 채널 선택입니다. 이들은 개별 및 병용 검사 샘플에서 평가하여 항체 간 교차 반응성이 없음을 확인하고, 염료 불활성화 및 에피토프 검출이 원하는 라운드에서 가능함을 입증합니다. 일반적으로 자가형광이 낮은 Cy5 및 Cy7 채널에는 약하거나 덜 풍부한 마커를 사용하는 것이 권장됩니다. 최종 패널은 관심 있는 조직 유형에 따라 검사되는데, 일부 널리 사용되는 최적화 조직(예: 편도선)은 실험 환경보다 낮은 농도와 노출 시간이 필요하며, 자가형광 등 특성도 다를 수 있습니다. 그러나 이러한 양성 대조 조직은 실험 조직에서 세포 유형 존재가 불확실할 때 유용할 수 있는데, 이는 표적 세포가 없을 때 신호 부족을 쉽게 구분할 수 없기 때문입니다. 표적 조직 유형 내에서 이러한 패널 최적화에 대한 신중한 노력은 성공적인 분석에 있어 가장 중요한 실험 단계로, 최종 실험 실행에서 생체마커 손실을 최소화합니다. 대부분의 문제는 항체 교차 반응, 낮은 항체 농도로 인한 신호 부족, 또는 FITC/Cy3 채널의 신호 대 잡음 비율이 낮기 때문에 발생합니다. 또한, 반복적인 염료 불활성화 단계에 따른 항원 보존은 항체 및 조직 모두에 의존하므로, 실험 샘플에 적합한 패널/라운드 조성을 선택하기 위해 포괄적인 최적화 단계가 필요합니다. 다중성 면역형광 작업 흐름의 주요 한계는 고품질 항체에 대한 의존성과, 반복적인 염색 및 염료 불활성화 주기 동안 에피토프의 안정성입니다.

전반적으로, 자동화 플랫폼과 결합된 다중화 영상은 생 체 내 조직 샘플의 IF 평가에 있어 정교도의 획기적 변화를 의미하며, 단일 세포 수준에서 복잡한 바이오마커 패널의 포괄적 공간 분석을 용이하게 합니다. 이 워크플로우의 향후 응용 분야로는 다양한 조직 유형에서 노화 관련 바이오마커의 대규모 프로파일링과 신흥 공간 오믹스 접근법과의 통합이 포함되어 복잡한 조직 환경 내 세포 이질성을 더욱 해소하는 것입니다.

공개 사항

CLB는 Senisca, StarkAge, AKLRD의 컨설턴트로 활동해왔습니다. CLB의 연구소는 ValiRx로부터 자금을 지원받았습니다.

저자의 기여:

RW LG와 CLB가 초기 개념을 개발했습니다. RW, FM, MGC, LG, CLB가 개념을 최종 확정하고 실험을 개발하고 설계했습니다. RW, FM, MGC, LG가 모든 실험을 수행했습니다. RW와 CLB는 모든 저자가 제출 전에 원고 수정에 참여하는 초기 원고 초안을 작성했습니다. 모든 저자가 최종 원고를 읽고 승인했습니다.

감사의 글

CLB는 BBSRC(각각 BB/T008709/1 및 BB/W510427/1)로부터 FM과 MGC에 대한 자금 지원을 인정하며, 웰컴 트러스트로부터 Cell DIVE(223803/Z/21/Z)로부터 구입한 것에 대해서도 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
30% Hydrogen Peroxide (H2O2)MerckH1009
Antigen unmasking solution 1 (H3300) (ARS1)Vector Labs.H-3300Prepare with 12.5 ml Antigen Unmasking Solution + 237.5 ml ddH2O
Antigen unmasking solution 2 (ARS2)SigmaT6066 / E5134Prepare 10x stock (12.9 g Trizma base, 3.7 g EDTA, 5 mL Tween 20, 995 mL ddH20). 
Bovine Serum Albumin (BSA)MerckA2153
Bulk Dewaxing SolutionLeicaAR9222
Bulk Epitope Retrieval 1 (ER1)LeicaAR9961
Bulk  Epitope Retrieval (ER2)LeicaAR9640
Bulk Wash SolutionLeicaAR9590
DAPIMerckD3571
Doubled distilled water (ddH20)N/AN/A
DMSOMerck472301
Donkey SerumMerckD9663
EDTAMerckE5134
GlycerolMerckG5516
NaHCO3MerckS5761
Phosphate Buffered Saline (PBS)MerckBP399
Propyl GallateMerckP3130
Sodium BicarbonateMerckS5761
Triton X 100MerckH5141
Trizma BaseMerckT6066
Tween20MerckP1379
기타 소모품 또는 장비
Decloaking chamberBioCareDC2012
Steam stripsBioCare613QC
Bond RXm Auto Slide StainerLeicaHIS2330자동 슬라이드 스태이너로 언급됨 
Cell DIVELeica29429159다중 형광 이미징 시스템으로 언급됨 
Click Well slide holdersLeica29463259웰 커버슬립리스 슬라이드 홀더로 언급됨 
항체 목록
CD31 (Pecam-1)Cell Signalling61255Clone: 89C2
Fluorophore: AF555
Dilution: 1 in 50
CD8aBioLegend372906Clone: C8/144B
Fluorophore: Alexa 647
Dilution: 1 in 100
CDKN2A/p16Santa Cruzsc-56330 AF647Clone: jc8
Fluorophore: Alexa 647
Dilution: 1 in 200
FOXP3BioLegend320114Clone: 206D
Fluorophore: Alexa 647
Dilution: 1 in 50
Keratin 15Abcamab194065Clone: EPR1614Y
Fluorophore: AF_488
Dilution: 1 in 200
Ki67Abcamab215226Clone: EPR3610
Fluorophore: AF555
Dilution: 1 in 50
Lamin B1Abcamab194106Clone: EPR8985(B)
Fluorophore: AF_488
Dilution: 1 in 100
PanCK_AE1/AE3Thermofisher53-9003-82Clone: AE1/AE3
Fluorophore: AF_488
Dilution: 1 in 100
SMAR&D systemsIC1420SClone: 1A4
Fluorophore: Alexa 750
Dilution: 1 in 100
VimentinCell Signalling69227Clone: D21H3
Fluorophore: Alexa 750
Dilution: 1 in 100

참고문헌

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