FACS를 이용한 쥐 피질 조직에서 주리세포 분리 단세포 시퀀싱

요약

scRNA-seq의 요구를 충족하는 마우스 뇌 피질 주리세포를 얻기 위해, CD13⁺/CD31⁻ 선택을 기반으로 한 비판적으로 최적화된 FACS 프로토콜을 제시합니다. 주요 개선점은 세포 생존력과 RNA 무결성을 크게 향상시켜 신뢰할 수 있는 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다.

초록

주리세포는 신경혈관 단위의 핵심 구성 요소로서, 혈액-뇌 장벽의 무결성을 유지하고 미세혈관 긴장의 조절을 통해 대뇌 혈역학 항상성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 주피세포 기능 장애는 다양한 신경학적 질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 신경혈관 질환에서 세포 핵 세포의 이질성을 조사하고 그 기전을 단일 세포 해상도로 밝히기 위해, 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)에 적합한 마우스 뇌 주엽세포를 분리하기 위한 최적화되고 재현 가능한 프로토콜을 구축했습니다. 이 방법은 확립된 CD13⁺/CD31^- 분류 전략을 기반으로 하지만, scRNA-seq 응용에 맞춘 핵심 개선 사항을 포함하고 있습니다. 간단히 세 마리의 성체 C57BL/6 마우스에서 뇌를 채취했습니다. 뇌 조직은 기계적으로 해리되고 단세포 현탁을 얻기 위해 효소 소화를 받았다. 순차적 원심분리 후, 최종 세포 펠릿은 20% 소 혈청 알부민(BSA) 용액에 재현탁되었으며, 이는 스트레스와 응집을 최소화하여 생존력과 RNA 질을 극대화하기 위해 도입한 핵심 단계였습니다. 이 최적화된 FACS 기반 접근법은 scRNA-seq의 엄격한 요구사항을 충족하는 생존 가능한 마우스 뇌 주리세포를 강력하게 분리할 수 있게 하여, 주위세포의 이질성과 신경혈관 질환에서의 병리적 역할을 해부하는 강력한 도구를 제공합니다.

서론

주리세포는 미세혈관을 따라 위치한 중요한 세포 유형으로, 일반적으로 모세혈관 기저막과 내피 세포를 감싸고 있습니다^. 뇌에서 주리세포는 내피세포, 성상교세포 및 기타 세포 유형과 함께 신경혈관 유닛을 형성하며, 혈액-뇌장벽(BBB)의 구조와 기능에 필수적입니다. 주립세포는 뇌 혈류 조절, 혈관 재형성, 혈관 항상성 유지에 필수적인 역할을 합니다. 이들은 밀접한 물리적 상호작용과 이웃 세포와의 파라크린 신호 전달을 통해 BBB의 무결성을 유지합니다²; 엔도사이토시스와 특정 수송체 단백질의 발현 을 통해 내피 수송을 동적으로 조절합니다; 수축^{성 및 이}완 활동을 통해 뇌 혈역학 안정성에 기여한다. 주막의 기능 장애와 그 덮개 또는 밀도의 변화는 혈관 조절 장애와 신경학적 결손을 초래할 수 있으며, 궁극적으로 다양한 신경학적 질환과 관련된 병리학적 변화를 초래할 수 있습니다^. 그러나 주리세포의 고유한 이질성은 추가 기전 연구에 상당한 도전을 제기합니다.

단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 기술의 발전에 따라, 점점 더 많은 연구가 scRNA-seq를 활용하여 세포의 이질성을 탐구하고 질병의 발병 및 진행에 관한 주요 표적을 규명하고 있습니다. 일반적으로 사용되는 주위 표지자로는 혈소판 유래 성장인자 수용체-베타(PDGFR-β)⁵, 신경세포-교세포 항원 2(NG2), 알파-평활근 액틴(α-SMA)이 있습니다. 그러나 이 마커들은 평활근 세포와 같은 다른 혈관 세포와 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 전구세포와 같은 신경 전구세포를 동시에 표지할 수 있어 특이성이 상대적으로 낮습니다. 더 강력한 대안을 찾기 위해 우리는 CD13(아미노펩티다제 N, APN)을 참고했는데, 이 마커는 이전 연구들 7,8,9,10에서 뇌혈관 주피세포에서 강력하고 일관된 발현으로 널리 알려져 있습니다. 우리 연구에서는 뇌 조직 절편에 면역형광 염색을 실시했으며, 그 결과 주리세포에서 CD13 발현이 확인되어 CD13 신호가 혈관 주위 세포에만 전적으로 존재하고 CD31⁺ 내피 세포에서는 나타나지 않아 주위세포와 내피세포를 구별하는 데 효과적임을 입증했습니다. (그림 1A). 하지만 CD13 발현이 전적으로 주반구에만 국한된 것은 아니라는 점을 유념해야 합니다; 소동맥과 정맥의 평활근 세포에서도 검출 가능한 수치가 관찰됩니다(그림 1B,C).

그림 1: 면역형광 염색 결과, 뇌혈관 주반세포와 평활근 세포에서 CD13 발현이 나타나며, 내피세포에서는 신호가 감지되지 않습니다. (A) 뇌 미세혈관 내 소동맥-모세혈관 전이대의 대표성 면역형광 영상. 병합된 이미지는 CD13⁺ 주리세포(녹색)가 CD31⁺ 내피 세포(빨간색)를 감싸고 있는 모습을 보여줍니다. α-SMA⁺ 평활근 세포(청산층)는 동맥 부위에 국한되어 모세혈관에는 존재하지 않습니다. (B) 소동맥의 단면. 영상은 주변 평활근층에서 CD13⁺ 주리세포(녹색)와 α-SMA⁺ 평활근세포(청록색)가 명확히 공동 위치함을 보여주며, 동맥 평활근 세포에서 CD13 발현을 확인했습니다. (C) 정맥의 단면. 마찬가지로, CD13(녹색)은 정맥벽의 α-SMA 평활근 세포(화살머리)에서 검출됩니다. 스케일 바: 20 μm (A-C). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

scRNA-seq의 요구사항을 충족하는 마우스 피질 혈관 주리세포를 얻기 위해, 우리는 주엽세포 분리를 위해 CD13/CD31/항체 표지를 이용한 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행^{했습니다.} 초기에는 CD45와 CD41 마커를 사용해 뇌 조직 현탁에서 조혈 세포를 배제했다¹². 이후 주피세포는 CD13⁺ 세포를 선택하여 농축되었고, 내피세포는 CD31^- 집단으로 게이팅하여 목표 주피세포 집단을 분리하여 추가로 배제하였^다.

CD13 양성 선택 단계가 동시에 소동맥과 정맥에서 CD13 발현 평활근 세포를 포착한다는 점을 인정합니다. scRNA-seq의 중요한 요구사항을 충족하고 주리 세포 보존을 극대화하기 위해, 우리는 분류 단계에서 주리 생성량을 우선시하기 위해 전략적으로 이 마커 조합을 선택했습니다. 이 접근법은 소수의 평활근 세포 집단을 공동 분리하는 결과를 낳지만, 예비 농축 단계에서 모든 잠재적 주위핵의 회복을 극대화합니다. 이 단계적 게이팅 전략은 초기 세포 손실을 크게 최소화합니다. 또한, 세포 주위의 생존력과 수율을 극대화하기 위해, 해리 후 세포 재현탁 및 여과에 20% BSA 용액을 사용하여 분리된 세포의 생존력과^{순도를 유지}하면서 이물질을 효과적으로 제거하였습니다.

이 방법을 사용하여 뇌혈관 주리세포를 다른 세포 유형과 성공적으로 구별하여, scRNA-seq의 엄격한 요구사항을 충족하는 고순도와 높은 생존 성의 주위 주위 준비를 달성했습니다. 이 기법은 다양한 질병 맥락에서 주리세포의 역할에 대한 심층 연구를 위한 견고한 토대를 제공합니다.

프로토콜

이 연구에서는 3개월 된 성체 C57BL/6J 마우스 3마리(20-25g)를 사용했습니다. 모든 쥐는 12시간의 빛과 어둠 주기 하에 엄격히 온도와 습도를 조절하며 실험 전에 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 했습니다. 실험동물을 대상으로 한 모든 실험 절차는 미세순환연구소 실험실동물 관리 및 윤리위원회, 중국의학과학원 및 베이징연합의과대학의 승인을 받았으며, 관련 동물복지 지침을 엄격히 준수하였습니다.

1. 시약 준비

1. 30% (wt/volume) 포도당 용액: 15g 포도당을 50 mL의 UltraPure DNase/RNase free dH₂O에 녹입니다. 완전한 용해를 위해 먼저 20mL의 UltraPure DNase/RNase-free dH₂O에 포도당을 첨가하고 완전히 혼합합니다. 그 다음 UltraPure DNase/RNase 프리 dH₂O를 최종 50mL 부피에 첨가합니다. 용액을 여과하여 최대 6개월간 4°C에서 보관하세요.
2. DNase I (10 mg/mL): 50 mg DNase I를 멸균 ddH₂O 5mL에 녹입니다. 재고 용액은 -20°C에서 최대 2개월간 보관할 수 있습니다.
   참고: 효소 활성 손실을 방지하기 위해 반복되는 동결-해동 사이클은 엄격히 피해야 합니다. 동결-해동 효과를 최소화하기 위해 초기 냉동 전에 멸균 마이크로 원심분리관에 150 μL의 용액을 알리코트(aliquot)로 넣고, 실험에 필요한 개별 알리코트를 해동하세요.
3. 인산염 완충 식염수(PBS)에 담긴 2% (vol/vol) 태아 소 혈청(FBS): 10× PBS 5mL와 UltraPure DNase/RNase 자유 dH₂O 45mL를 혼합하여 1× PBS를 준비합니다. FBS 1× PBS 49mL에 첨가하고 충분히 혼합합니다.
   참고: 이 솔루션은 Step 2.1.2 단계에서 새로 준비하세요. 조직 샘플당 15mL를 할당하세요.
4. 콜라겐제 및 디스퍼즈(CD) 효소 스톡 용액: 디스파제 100mg과 콜라겐제 100mg을 각각 1mL의 UltraPure DNase/RNase-free dH_2O에 각각 녹입니다. 용액을 혼합하여 최종 부피 2 mL(효소 농도 100 mg/mL)를 얻습니다.
   참고: 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 500 μL를 분리하여 -20 °C에서 보관하세요. 사용 전에 소용돌이를 사용해 동결-해동 사이클로 인한 활동 손실을 방지하세요. 가루 형태는 심각한 피부/눈 자극과 호흡 곤란을 일으킬 수 있다는 점을 유념해야 합니다. 항상 화학 훈기 후드에서 니트릴 장갑과 N95 마스크를 착용하고 다루세요. 노출 시 즉시 영향을 받은 부위를 충분한 물로 관개하고 의료진을 방문하세요.
5. CD 효소 작동 용액: CD 효소 스톡 용액 1.5mL와 2%(볼륨/볼륨) FBS 43.5mL를 부드럽게 역전하여 PBS에 혼합합니다.
   참고: 조직 해리 직전에 준비하세요(2.3.4단계). 이 용량은 세 마리의 마우스에 최적화되어 있습니다; 필요에 따라 비례적으로 조정하세요.
6. 22% (부/부) 퍼콜 용액: 퍼콜 11 mL, 10× PBS 5 mL, UltraPure DNase/RNase 프리 dH₂O 34 mL를 혼합하여 50 mL 용액을 만듭니다.
   참고: 0.22 μm PES 막을 통해 필터 멸균하세요. 4°C에서 한 달간 보관할 수 있으며, 안정성 손실이 크게 떨어지지 않습니다.
7. 기계적 해리 완충제: 10 mL의 DNase I(10 mg/mL)를 10mL 2% (부/부) FBS 10 mL PBS 내 PBS 첨가(Step 1.3 기준). 피펫으로 혼합하세요.
8. BSA 솔루션: 1%, 20%, 35%(무게/볼륨) BSA 솔루션을 다음과 같이 각각 준비하세요:
   1. 1% (무게/부피) BSA: 0.15 g의 BSA를 15mL의 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(DPBS)에 용해.
   2. 20% (무게/부용량) BSA: 3g의 BSA를 15mL DPBS에 녹입니다.
   3. 35% (무게/부피) BSA: 0.7g BSA를 2mL DPBS에 녹입니다.
      참고: 사용 전에 0.22 μm PES 멤브레인을 통해 모든 용액을 여과하세요.
9. Hanks의 균형 소금 용액(HBSS)/BSA/포도당 버퍼: 167 μL 30% (wt/vol) 포도당(Step 1.1)과 35% (wt/vol) BSA 1.4mL(Step 1.8)를 50mL HBSS에 부드럽게 섞어 부드럽게 섞습니다.
   참고: 2.1.2단계 중 멸균 조건에서 신선하게 이 용액을 준비하세요. 사용 전까지 4°C에서 보관하세요.
10. 조직 채취 완충제: 1.9단계의 HBSS/BSA/포도당 완충제 12 mL에 800 μL DNase I(10 mg/mL)를 보충합니다. 임시 조직 저장과 피펫 세척에 사용됩니다.
    참고: 2.1.2단계 중 멸균 조건에서 신선하게 이 용액을 준비하세요.
11. 1.25% (w/v) 트리브로모에탄올 용액: 2,2,2-트리브로모에탄올 1.25g을 2.5ml 2-메틸-2-부탄올에 녹인 후, 이 혼합물을 멸균 ddH_2O또는 생리용 식염수 97.5ml에 첨가하여 투명한 1.25% 트리브로모에탄올 용액을 얻습니다.
    참고: 사용 전에 반드시 신선하게 준비하세요. 빛을 차단해 실온에 보관하고 즉시 사용하세요.

2. 실험적 절차 (세 마리 쥐 사용 사용)

1. 사전 실험 준비 (시간: 30분)
   1. 오토클레이브는 소모품과 75%(볼륨/볼륨) 에탄올로 소독하는 외과 기구가 필요했습니다.
   2. 작업 용액 준비: 1× PBS (Step 1.3), 2% (볼륨/볼륨) PBS 내 FBS(Step 1.3), HBSS/BSA/포도당 용액(Step 1.9), 조직 채취 완충제(Step 1.10).
   3. ×10cm 크기의 PBS 10mL를 10cm 크기의 세포 클러처 접시에 붓고 얼음 위에 보관하세요.
   4. 앰플 3개를 준비하고, 각각 3mL의 조직 채취제를 추가한 뒤 얼음 위에 보관하세요.
   5. 15mL 원심분리기 튜브 3개를 준비하고, 각각에 2%(부/부피) FBS 10mL를 PBS에 넣어 얼음 보관합니다.
2. 쥐 뇌 채취 (시간: 30분)
   1. 쥐들은 10g 체중당 0.2mL의 복막 내 트리브로모에탄올(1.11단계) 주사로 깊은 마취를 받았습니다. 발달 반사 상실 후에는 경추 탈구로 안락사가 시행되었습니다.
      참고: 주사 후 5-10분 이내에 마취 수술면(페달 철회 반사가 없음으로 평가)에 도달하지 못한 경우, 초기 용량의 3분의 1에 해당하는 트리브로모에탄올 복막 내 추가 투여가 이루어졌습니다.
   2. 머리와 목 부위에 75% 에탄올을 뿌리세요. 후두에서 전두까지 두피 중앙을 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 양측 안도 앞쪽에 횡방향 절개를 한 뒤, 소뇌 하부 가장자리를 따라 측면 절개를 하여 두개골 기저를 분리합니다. 마지막으로, 시상봉합선을 따라 뒤쪽에서 앞쪽으로 종방향으로 칼벌리움을 절개합니다. 두개막을 들어 올려 경막으로 둘러싸인 뇌를 노출하세요. 수술용 가위로 시신경과 연수-척수 연결을 절단하면서 뇌를 부드럽게 올려¹⁵. 온전한 뇌를 10cm 접시에 10mL의 얼음처럼 차가운 1× PBS를 넣습니다.
      참고: 손상을 방지하기 위해 조직을 조심스럽게 다루세요.
   3. 뇌를 알루미늄 호일로 옮겨. 겸자를 사용해 경막을 가장자리에서 들어 올려 정중 설을 따라 절제합니다. 경막을 완전히 제거한 후에는 지주막하 공간을 노출하세요. 지주막하 공간을 HBSS 용액으로 헹군 후 둔한 바늘로 혈관을 박리하고¹⁶번 피아를 조심스럽게 제거하세요. 면도날을 사용해 뇌를 2-3mm 두께의 절편으로 접목 절단합니다. 후각 구와 가장 뒤쪽 부분은 버리세요. 뇌량을 따라 대뇌 피질을 분리하고, 피질 조직을 3mL의 얼음 조직 채취 완충제가 들어 있는 앰풀로 옮^깁니다.
   4. 이 프로토콜에서 주위 세포 분리는 대뇌 피질을 특정적으로 표적으로 합니다. 기타 관심 영역을 위해: PBS에서 2%(부피/부피) FBS를 한 방울 떨어뜨린 2웰 슬라이드에 관상 절편을 배치합니다. 해양 현미경 검사에서 표적 영역을 식별하고, 수동으로 분리한 후 동일한 후속 처리 단계를 진행합니다.
3. 조직 해리 (시간: 3-3.5시간)
   1. 수술 메스를 사용해 약 1 mm × 1 mm 크기의 조각으로 조직을 다지는 앰플 안의 조직을 만듭니다.
      참고: 조직 신선도를 유지하기 위해 5분 이내에 다져야 합니다.
   2. 조직 채취 완충제가 달린 사전 세척 피펫 팁. 끝 꼭대기 쪽으로 다진 조각을 천천히 흡입하면서 수직 방향(끝을 아래로 향)을 유지합니다. 조각을 부드럽게 15mL 원심분리관(2.1.5단계에서 준비됨)으로 미리 냉각하여 배출합니다.
      참고: 피펫 벽에 부착되는 것을 방지하기 위해 상부 배럴로 파편을 흡입하지 마세요.
   3. 조각 함유 앰플(Step 2.3.1 기준)을 2%(볼륨/볼륨) FBS로 PBS에 세척한 후 원심분리관으로 옮깁니다. 300 x g , 4 °C에서 5분간 원심분리기.
   4. 원심분리 후 상청액은 버리세요. 각 튜브당 1.5단계의 CD 효소 작업 용액 3mL에 펠릿을 재현탁합니다. 각 현탁액을 세 개의 튜브(총 9튜브, 1mL/튜브)로 균등하게 분할한 후 CD 효소 작용액 4mL(최종 용량: 튜브당 5mL)를 보충합니다.
   5. 튜브를 37°C 하이브리다이제이션 오븐에서 100분간 배양하고, 100 x g¹⁴에서 궤도 진동을 합니다.
   6. 조직 해리 용액 1 mL를 10mL 2% (부/부피) PBS 내 PBS에 첨가하여 조직 해리 용액을 배양 중입니다(Step 1.10 참조).
   7. 300 x g 높이에서 4 °C에서 5분간 원심분리하여 소화를 종료합니다.
      참고: 10-20 μL 알리코트를 사용하여 현미경으로 소화 효율을 평가하세요. 이상적인 종점은 구슬 형태의 혈관 조각으로 나타납니다; 길쭉한 혈관 분절은 소화 부족을 나타내며, 단일 세포가 우세하면 과소화를 나타냅니다.
   8. 각 튜브당 1mL의 조직 해리 용액에 펠릿을 재현탁합니다. 피펫팅 100회¹¹회로 기계적으로 해리됩니다.
      참고: 기포 형성을 최소화하고 세포 생존을 유지하기 위해 피펫 전체 부피 흡인은 피하세요.
   9. 3마리 쥐의 뇌 조직을 나타내는 총 9개의 소화관 중 모든 부유물을 50mL 원심분리관에 모으세요. 각 소화관을 2mL 2% (부피/부피) FBS로 PBS에 담아 세척하고 세척을 혼합하세요. 300 x g , 4 °C에서 5분간 원심분리기.
   10. 원심분리 후에는 뚜렷한 층이 보입니다. 가장 상층(불순물과 작은 세포 잔해가 포함된 부분)은 조심스럽게 버리고, 중간 층(밀도가 낮은 세포 또는 세포 군집으로 구성)와 하단 층(온전한 세포와 부분적으로 소화되지 않은 조직 조각)은 유지하세요. 20% BSA 용액 12.5mL를 넣고 튜브를 부드럽게 뒤집어 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 다시 1000 × g , 4 °C에서 20분간 원심분리기.
   11. 바닥 펠릿(순도가 높은 온전한 세포로 농축됨)을 수집하고, 주로 수초 잔해, 지질, 소수의 세포를 포함한 상원액을 새로운 50mL 원심분리관으로 옮깁니다. 부드러운 역전으로 재현탁한 후 1,000 x g , 4 °C에서 20분간 원심분리기를 반복합니다.
   12. 두 단계의 원심분리(단계 2.3.10, Step 2.3.11)에서 얻은 각 펠릿을 2 mL의 2% FBS PBS 단위(최종 합산 용량: 4 mL)에 재현탁합니다.
       참고: 재현탁 시 튜브 벽을 만지지 않도록 이물질 오염을 최소화하세요.
   13. 이전 단계에서 재현탁된 두 개의 현탁물을 15mL 원심분리관에 결합합니다. 300 × g, 4 °C에서 5분간 원심분리기. 상청액(BSA, 세포 잔해, 그리고 잔여 미량의 미량 미엘린 지질이 포함된 폐액 완충제)을 버립니다. 펠릿(최종적으로 정제 및 세척된 고순도 온전한 표적 세포)을 2% FBS가 포함된 PBS 용액 2mL에 재현탁합니다.
       참고: 이 단계는 셀을 깨끗하고 적합한 현탁 완충제로 옮기는 것입니다.
   14. 각각 4mL 22% 퍼콜 용액을 담은 15mL 원심분리관 4개를 준비합니다. 세포 수율을 극대화하기 위해 0.5 mL 알리코트를 퍼콜 구배(총 4개)에 부드럽게 쌓아줍니다. 560 x g 원심분리기, 4°C에서 10분간 가열합니다.
       참고: 원심분리기를 '브레이크 없음'으로 설정하여 소용돌이로 인한 밀도 구배 교란을 피하고, 미엘린 잔해가 상청액 내에서 안정적으로 유지되도록 하세요.
   15. 상정액을 조심스럽게 흡인하세요. 튜브당 1mL의 HBSS/BSA/포도당 완충제에 펠릿을 재현탁합니다. 새로운 15mL 튜브에 현탁액을 풀어넣습니다. 퍼콜 튜브를 2mL HBSS/BSA/포도당 버퍼로 헹구고 워시를 섞어 주세요. 300 x g , 4 °C에서 5분간 원심분리기를 사용한다.
4. 유세포검사 분류 준비 및 획득 (시간: 50분)
   1. 상정액을 조심스럽게 흡취하세요. 세포 펠릿을 HBSS/BSA/포도당 완충액 1mL에 재현탁합니다.
   2. 세포 부탁액에 5μL Fc 수용체(FcR) 차단 시약을 첨가하고 4°C에서 5분간 배양합니다.
   3. 다음과 같은 형광 결합 항체를 세포 현탁액에 추가하면(3마리 생쥐에서 유래한 조직에 충분): 5 μL CD45-PE; CD41-PE 5 μL; CD31-APC 20 μL; CD13-FITC 15 μL 투여.
   4. 세포를 어둠 속에서 얼음 위에 20분간 배화하세요.
      참고: 빛으로부터 보호하세요. 저어주는 것을 피하세요.
   5. 세포를 세척하기 위해 HBSS/BSA/포도당 완충제를 6mL 추가하세요. 300 x g , 4 °C에서 5분간 원심분리기.
   6. 상정액을 흡인하세요. 세포 펠릿을 HBSS/BSA/포도당 완충액 1mL에 재현탁합니다. 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD) 용액 200 μL을 추가하여 죽은 세포를 배제하고 얼음 위에 10분간 배양합니다. 그 후 HBSS/BSA/포도당 완충제를 사용해 부피를 2mL로 조절하세요.
      참고: 빛으로부터 보호하세요.
   7. 분류용 수집관(15mL 원뿔형 튜브)에 1% BSA 용액을 첨가하고, 내부 표면을 부드럽게 휘둘러 세척하세요. 각 튜브에 정확히 1% BSA 용액 1mL를 흡입하여 분리된 세포를 받도록 합니다. 임시로 얼음 위에 보관하세요.
   8. 분류 직전에 40 μm 체를 통해 염색 세포 현탁액을 필터로 처리합니다.
   9. FSC-A와 측면 산란(SSC-A) 파라미터를 기반으로 초기 게이트를 설정하여 낮은 FSC-A/SSC-A 신호를 보이는 세포 잔해를 배제합니다.
   10. 조혈 계통 세포의 고갈은 CD45와 CD41에 대한 이중 음성 게이팅을 통해 이루어져 백혈구, 면역 세포, 혈소판에서 오염을 효과적으로 제거하였습니다.
   11. 혈관 벽 세포에서 CD13 양성 선택을 통해 추정 주리세포를 포착합니다.
   12. 7-AAD 형광 탐침 을 통해 막의 무결성을 평가합니다; 7-AAD⁻ 게이팅으로 세포자멸사 세포를 배제합니다.
       참고: CD31-음성 선택을 통해 고순도 CD31/CD13⁺ 주리세포를 수집하세요. 분류된 주리세포를 1% BSA가 포함된 튜브에 직접 모아 얼음 위에 올려놓습니다. 즉시 단일 셀 현탁액을 준비해 계수하세요. 그 후 중간 배양 단계 없이 샘플을 직접 시퀀싱할 수 있습니다.
5. scRNA 시퀀싱 및 분석 (Tming: 3-4일)
   1. 10x Genomics "GEM-X Universal 3' 유전자 발현 v4 4-플렉스 시약 키트 사용자 가이드"(CG000731)^17,18 프로토콜에 따라 분류된 주리세포의 단일 세포 현탁액을 준비하였습니다. 적재를 위해 준비된 세포 현탁액은 생존 가능성이 > 90%였으며, 권장 농도인 300-2000 세포/μL 범위 내에서 희석되었습니다.
   2. 단일 세포 현탁액을 바코드화된 젤 비즈 및 효소와 결합한 후, 마이크로 유체 액상 캡슐화 를 통해 젤 비즈 인 에멀젼(GEMs)으로 분할^합니다. 현장 세포 용 해, 역전사, 바코드-cDNA 연합 작업을 수행합니다.
   3. GEM을 깨뜨려 제품을 회수하세요. 다음 프로토콜을 사용하여 PCR로 cDNA를 증폭합니다: 9 °C에서 4초 동안 초기 변성; 그 다음에는 사이클링(<500 표적 셀에 대해 13 사이클, 501-6000 표적 셀에 대해 12 사이클)이 진행되며, 9 °C에서 변성하여 2초, 9 °C에서 어닐링하여 3초, 7 °C에서 6초당 6초간 확장하는 과정이 포함됩니다; 그리고 72°C에서 1분간 마지막 연장 후 4°C에서 멈춘 상태입니다. 증폭된 산물의 조각 크기(200-300 bp)와 수율을 검증합니다.
      참고: 증폭 제품은 최대 72시간간 4°C에서 보관하거나 -2°C에서 일주일간 보관할 수 있으며, 다음 단계에서 직접 가공할 수도 있습니다.
   4. 인증된 cDNA의 경우: 단편 처리, 엔드 복구, P7 어댑터 연결, 인덱스 프라이머로 증폭. 시퀀싱 라이브러리를 구성하기 위해 크기 선택 단편을 사용한다.
   5. QC 검증 후 Illumina NovaSeq 플랫폼의 서열 라이브러리.
   6. 세포 바코드, 고유 분자 식별자(UMI), RNA 서열을 추출하기 위해 디멀티플렉스 시퀀싱 데이터를 추출합니다. 정렬 리드는 참조 게놈에 맞춰집니다.
   7. UMI 수를 정량화하고, 유효한 세포 수를 추정하며, 유전자 바코드 발현 행렬²⁰을 생성합니다.
   8. R의 DoubletFinder 패키지(v2.0.6)를 사용하여 더블릿을 제거하세요. 인위적인 최근이웃 식별을 기반으로 예측하여 데이터 품질을 보장합니다.
   9. Seurat(v5.0)를 사용하여 주성분 분석(PCA)과 균일 다양체 근사 및 투영(UMAP) 차원 축소를 수행합니다. 세포 클러스터를 식별하고 세포 주위 특이적 마커 유전자를 시각화하여 세포 정체성을 검증합니다.

결과

뇌 주변 세포의 정밀한 분리를 위해 뇌 조직에서 해리된 세포는 PE Texas Red-conjugated anti-mouse CD41/CD45, FITC-conjugated anti-mouse CD13, APC conjugated anti-mouse CD31로 염색하여 표면 마커와 생존 가능성 검출을 통합한 다단계 분류 전략을 확립하였습니다(그림 2). 순방향 산란(FSC-A)과 측면 산란(SSC-A) 매개변수를 기반으로 한 초기 게이팅은 세포 잔해를 효과적으로 배제했습니다(그림 2, 왼쪽 상단 사분면). 이후 CD45⁺/CD41⁺ 이중 양성 세포 고갈을 통해 조혈 세포와 혈소판 오염물질이 제거되었습니다(그림 2, 오른쪽 상단). CD13⁺ 혈관벽 세포 풍부화 과정에서, 7-AAD 형광 탐침이 음성 게이팅을 통...

토론

본 연구는 CD13⁺/CD31⁻ 다색 표지를 기반으로 한 체계적으로 최적화되고 검증된 FACS 전략을 설명하는데, 이는 마우스 뇌 혈관 주반구의 매우 효율적인 분리를 위한 것입니다²⁴. 유동 세포 측정 및 후속 scRNA-seq 분석은 이 방법이 주리세포와 내피 세포를 정확히 구별하며, 생존성, 응집률, 생세포 농도, 핵화 세포 비율 등 scRNA-seq의 모든 중요한 품질 관리 지표를 지속적으로 충족하는 세포를 산출함을 확인했습니다. 이 확립된 방법론은 단세포 전사체학을 이용한 다양한 뇌 질환에서 주반구 기능에 대한 향후 심층 연구를 위한 견고한 기술적 기반을 제공합니다.

본 연구의 핵심 기술적 진보는 기존의 CD13⁺/CD31⁻ 분류 전략에 중요한 최적화를 적용한 데 있으며, 특히 scRNA-seq에 대한 적합성을 강화했습니다. 첫째, 세포 분류의 긴 시간을 고려하여, 해리...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
태아 소 혈청 (FBS)	Gibicol	A5669701	소량 분리하고 -20°C에서 보관; 해동 후 최대 1주일 동안 4°C에서 보관 가능
인산염 완충식염수(10×PBS, pH 7.4)	Life Technologies	70011-044	세포 세척 전 사용하기 전에 희석
D-(+)-글루코스	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	세포 에너지 버퍼 준비용
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933-25g	세포 보호 및 부착 방지
Dulbecco's 인산염 완충식염수 (DPBS,1×)	Gibco	14190-144
Hanks' 균형 염 용액 (HBSS,1×)	Life Technologies	14175-095	세포 세척 및 재현탁에 사용
UltraPure DNase/RNase-Free 증류수	Life Technologies	10977-015	핵산분해효소-프리 반응 시스템 준비용
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001-100mg	조직 소화 및 세포 분리용; 소량 분리하고 -20°C에서 보관
DNaseI(RNase-Free)	TIANGEN	RT411-1500U	DNA 응집 방지; 소량 분리하고 -20°C에서 보관
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-100ML	세포 분리용; 4°C에서 보관
FITC Rat Anti-Mouse CD13	BD Biosciences	558744	형광 접합체; 최대 1개월 동안 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262	몇 달 동안 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관
PE Rat Anti-Mouse CD41	BD Biosciences	558040	몇 달 동안 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관
PE Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	553081	몇 달 동안 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관
FITC Rat IgG1, κ 이소형 컨트롤	BD Biosciences	552916	형광 컨트롤; 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관
APC Rat IgG2a, κ 이소형 컨트롤	BD Biosciences	553932	몇 달 동안 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관
PE Rat IgG2b, κ 이소형 컨트롤	BD Biosciences	553989	몇 달 동안 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관
RNase AWAY 오염 제거제	Ambion	10328011	RNase 오염 제거용
정제된 Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	비특이적 항체 결합 방지
7-아미노액티노마이신 D (7-AAD)	BD Pharmingen	559925	사멸 세포 배제용
2,2,2-트리브로모에탄올	Sigma-Aldrich	T48402-25g	1.25% (w/v) 트리브로모에탄올 용액 준비용
2-메틸-2-부탄올	Psaitong	M20008-500mL	1.25% (w/v) 트리브로모에탄올 용액 준비용
C57BL/6 마우스	장쑤 화창 신누오 제약 기술 유한공사	SYXK (Su) 2020-0041
50 mL 원심분리 튜브	Corning	430291
15 mL 원심분리 튜브	Corning	430791
세포 배양 접시 100mm×20mm	Corning	430167
Cell Ranger		3.1.0/4.0.0	단일 세포 시퀀싱 데이터 분석 소프트웨어
Loupe Cell Browser		4.1	세포 브라우저
STAR		2.5.1b	RNA 정렬
irlbpy		-	주성분 분석
tsne		0.15	Barnes-Hut t-SNE (t-분포 확률적 이웃 임베딩) 분석
k-means		0.17	K-평균 클러스터링
그래프 기반 클러스터링		0.17	그래프 기반 클러스터링
FastQC		v0.11.2	데이터 품질 관리 (QC)