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연구 논문

NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 축은 패혈증 모델에서 대식세포 분극과 염증을 조절합니다

278 조회수

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DOI:

10.3791/69802

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2026년 1월 16일

 ,  , 
1Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Hebei University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 임상 샘플, 배양된 대식세포, 그리고 맹장 결찰 및 천자(CLP) 마우스 모델을 통합하여 NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 축이 패혈증에서 대식세포 분극과 염증을 어떻게 조절하는지 조사하며, 다른 lncRNA 매개 면역 경로에 적용할 수 있는 단계별 지침을 제공합니다.

초록

패혈증은 숙주 면역 반응이 조절되지 않는 것이 특징이며, 전 세계적으로 사망률의 주요 원인으로 남아 있습니다. 긴 비암호화 RNA NEAT1은 염증성 질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있으나, 패혈증 중 대식세포 분극에서 구체적인 역할은 완전히 정의되지 않았습니다. 여기서는 임상 샘플, 배양된 대식세포, CLP 마우스 모델에서 NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 축을 체계적으로 검토합니다. 정량적 PCR, 웨스턴 블로팅, 이중 루시퍼라제 리포터 분석법, RNA 풀다운 실험을 통해 NEAT1, miR-181a-5p, HMGB1 간의 경쟁성 내인성 RNA(ceRNA) 상호작용을 확인한다. 면역형광, 트랜스웰 이동, 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼레이스 dUTP 니크 엔드 라벨링(TUNEL) 염색 등 기능적 분석법이 대식세포 분극, 이동, 세포자멸사를 평가하기 위해 적용됩니다. 생체 내에서 CLP 모델은 ELISA 및 조직병리학과 결합되어 NEAT1 녹다운이 사이토카인 프로필과 장기 손상에 미치는 영향을 검증합니다. 패혈증 환자와 지질다당이 자극된 대식세포에서는 NEAT1과 HMGB1이 상향 조절되는 반면, miR-181a-5p는 하향 조절됩니다. NEAT1 침묵은 M2 대식세포 분극을 촉진하고, 염증성 사이토카인을 감소시키며, 대식세포 이동을 방해하고, miR-181a-5p/HMGB1 축을 통해 정혈증 쥐의 조직 손상을 완화합니다. 우리가 아는 한, 이 프로토콜은 임상 조화, 시험관 내 및 생체 내 조화로운 접근법을 사용하여 패혈증에서 lncRNA-microRNA-HMGB1 조절 회로를 특성화한 최초의 통합 프로토콜입니다. NEAT1 관련 ceRNA 네트워크를 잠재적 치료 전략으로 표적화하는 방법론적 틀을 제공합니다.

서론

패혈증은 감염에 대한 숙주 반응 조절 이상으로 인해 생명을 위협하는 장기 기능 장애로 정의됩니다. 임상 치료의 발전에도 불구하고 사망률은 여전히 높으며, 면역 불균형의 분자 기전은 완전히 이해되지 않았습니다 2,3. 면역 조절 인물 중에서는 장기 비암호화 RNA(lncRNA)가 염증 신호 전달과 대식세포 기능의 중요한 조절자로 부상했습니다 4,5. NEAT1은 핵 풍부 전사체로, 파라스펙클의 구조적 구성 요소이며 면역 및 조직 손상 반응과 연관되어 있습니다 6,7. 이전 연구들은 NEAT1이 장 염증, 허혈/재관류 손상, 급성 호흡곤란 증후군과 연관되어 있음을 확인했습니다 8,9,10.

패혈증 맥락에서 누적된 증거는 lncRNA가 대식세포 분극과 염증 신호를 조절하여 질병 진행과 결과에 영향을 미친다는 것을 시사합니다11,12. 예를 들어, lncRNA KCNQ1OT1와 SNHG1은 미세RNA 매개 경로를 통해 패혈증으로 인한 심근 손상을 조절하는 것으로 보고되었습니다13,14. 그러나 NEAT1이 패혈증에서 miR-181a-5p/HMGB1 축을 통해 대식세포 분극을 조절하는지는 체계적으로 정의되지 않았습니다. 이 격차를 해소하기 위해 우리는 환자 혈액 샘플, 지용다당류 자극 RAW264.7 대식세포, 그리고 맹장 결찰 및 천자 마우스 모델을 결합하여 NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 축15,16을 조사하는 프로토콜을 개발했습니다. 정량적 PCR, 웨스턴 블로팅, 이중 루시퍼레이스 리포터 분석, RNA 풀다운, 대식세포 M1/M2 편극, 이동, 세포자멸사의 기능적 읽기 등을 사용하여 이 프로토콜은 NEAT1을 패혈증에서 대식세포 기능 조절자로 정의하고 lncRNA 표적 전략 개발을 지원하는 재현 가능한 실험적 틀을 제공합니다(17,18).

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프로토콜

인간 참여자가 포함된 모든 절차는 허베이대학교 부속병원 윤리심사위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. HDFY-LL-2021-232). 모든 참가자로부터 서면 동의서를 받았으며, 해당되는 경우 법적 대리인으로부터 동의를 받았습니다. 모든 동물 실험은 기관 지침과 국가 규정에 따라 수행되었으며, 동일한 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 승인된 프로토콜은 맹장 결찰 및 천자(CLP) 시술, 아데노바이러스 투여, 마취 요법, 그리고 인도적 평가 지표에 대한 세부 사항을 명시했습니다.

환자 샘플 채취

패혈증 환자들은 2022년 2월부터 2024년 7월까지 허베이대학교 부속병원에서 전향적으로 모집되었습니다. 총 50명의 환자가 포함되었으며, 이 중 26명은 남성, 24명은 여성(평균 52.4± 10.2세)이었습니다. 패혈증은 패혈증-3 기준에 따라 진단되었으며, 의심 또는 확진된 감염과 순차적 장기 부전 평가(SOFA) 점수가 ≥ 2점 상승해야 했습니다. 각 환자에 대해 주요 감염원(폐, 복부, 요로 감염, 혈류 감염 등)과 질병 중증도(패혈증 또는 패혈성 쇼크)를 기록하고, SOFA 점수 분포를 요약하여 질병 부담을 특징지었습니다. 대조군으로는 감염 또는 전신 염증성 질환의 임상 증거가 없는 건강한 39명(남성 20명, 여성 19명, 26-70세 평균 50.7± 11.0세)이 등록되었으며, 그룹 간 연령이나 성별에 유의한 차이가 없었습니다.

패혈증 환자로부터 패혈증 환자로부터 가능한 경우 패혈증 특이적 치료를 시작하기 전에 말초정맥혈을 채취하였습니다. 혈액(보통 5-10mL)을 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 코팅된 튜브에 채취한 후 여러 차례 부드럽게 뒤집어 항응고제를 혼합했습니다. 샘플은 채취 후 약 1시간 이내에 처리되었습니다. 혈장은 1,500 × g 에서 실온에서 10분간 원심분리하여 얻었고, 라벨이 붙은 마이크로튜브에 담아 -80°C에서 저장하여 이후 사이토카인 측정을 수행했습니다. RNA 및 단백질 추출을 위해, 제조사 지침에 따라 밀도-구배 분리 배지를 사용해 일부 샘플에서 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 분리했습니다. 세포들은 PBS로 두 번 세척한 후 계수된 후 -80°C에서 세포 펠릿으로 저장되었습니다.

세포 배양 및 형질전환

RAW264.7 마우스 대식세포는 RPMI-1640 배양지에 10% 열불활성화 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충한 상태에서 37°C의 가습 인큐베이터에 5%CO2를 첨가하여 유지하였다. 세포는 오버플루언스에 도달하기 전에 세포 스크레이퍼로 통과시켜 안정적인 표현형을 유지했습니다.

형질전환을 위해 RAW264.7 세포는 시약 노출 약 24시간 전에 6웰 플레이트에 6웰 플레이트에 10개의5 세포를 시×딩했습니다. 배양 결과가 70-90% 합류에 도달하면, 제조사 지침에 따라 NEAT1 또는 HMGB1 발현 플라스미드, 짧은 헤어핀 구조물, miR-181a-5p 모방 또는 억제제 및 해당 대조군 등 핵산을 지질 기반 형질염 시약과 복합시켰습니다. 일반적으로 권장 용량의 시약과 플라스미드 DNA 2-3 μg 또는 소량 RNA 50-100 pmol을 혼합한 후, 실온에서 10-15분간 복합체를 형성한 후 항생제 무첨가 배지에서 세포에 드롭 첨가했습니다. 4-6시간 후에는 배지를 신선한 완전 배지로 교체하고, 세포를 추가로 24-48시간 배양한 후 하류 분석에 시달렸습니다.

대식세포 분극 유도

염증성 대식세포 분극을 유도하기 위해 RAW264.7 세포는 완전한 배지에서 최소 4시간 동안 6웰 플레이트에 부착되도록 허용했습니다. 배양지는 100 ng/mL 지다당류(LPS)를 포함한 DMEM으로 교체되었고, 세포는 5%CO2와 함께 37°C에서 6시간 배양되었다. 자극 후 세포는 즉시 RNA 및 단백질 추출, 면역형광 염색, 이동 분석, 또는 세포자멸사 분석을 위해 가공되었으며, 이는 실험 설계에 따라 달랐다.

정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)

표준 절차에 따라 페놀-구아니디늄 기반 단상 시약을 사용해 배양된 세포, PBMC, 또는 마우스 조직에서 총 RNA를 추출하였습니다. 간단히 말해, 샘플은 106 세포당 1mL 시약 또는 50-100mg 조직에 용해되어 상온에서 5분간 배양한 후 클로로포름(시약 1 mL당 0.2 mL)과 강하게 혼합했습니다. 2-3분간 배큐한 후, 용해액을 12,000 × g 에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 상을 분리했습니다. 수용상은 새로운 튜브로 옮겨졌고, RNA는 같은 양의 이소프로판올과 함께 침전되었다. 혼합물은 약 10분간 배양한 후 다시 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리되었습니다. 결과 펠릿은 75% 에탄올로 세척하고, 4°C에서 7,500 × g 에서 5분간 원심분리한 후 잠시 공기 건조된 후 RNase 무첨가물에 녹였다. RNA 농도와 순도는 UV 분광광도계를 사용하여 평가되었으며, 약 1.8-2.0 비율의 A260/A280 샘플을 사용하여 후속 분석에 사용되었습니다. 필요할 경우 아가로스 겔 전기영동으로 무결성을 검증하였습니다.

상보적 DNA(cDNA)는 제조사의 지침에 따라 상업적으로 판매되는 역전사 키트를 사용하여 총 RNA로부터 합성되었습니다. miR-181a-5p의 경우, 권장대로 유전자 특이적 또는 줄기 루프 프라이머를 사용하였습니다. 실시간 정량 PCR은 실시간 PCR 시스템과 적절한 마스터 믹스(예: SYBR 그린 또는 프로브 기반 화학)를 사용하여 총 반응 부피 20 μL, cDNA 주형과 각 프라이머 0.2-0.4 μM을 포함하여 수행되었습니다. 일반적인 사이클링 조건은 95°C에서 3분간 초기 변성, 이어서 95°C에서 10초, 60°C에서 30초간 40회 사이클을 거치는 것이었으며, 적절할 경우 증폭자 특이성을 확인하기 위해 용융 곡선 분석이 이루어졌습니다. NEAT1과 HMGB1 발현 수준은 GAPDH로 정규화되었고, miR-181a-5p 발현은 U6 소규모 핵 RNA로 정규화되었습니다. 상대 발현은 2-ΔΔCt 방법으로 계산되었으며, 대조군과 비교하여 폴드 변화로 표현하였습니다. 프라이머 서열과 증폭자 크기는 별도의 스프레드시트에 수집되어 보충 표 1로 제출되었습니다.

서부 블롯팅

웨스턴 블롯팅에서는 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척한 후, 적절한 방사면역침전 분석법(RIPA) 버퍼에 프로테아제 억제제를 첨가하여 용해했습니다. 용해액은 얼음에서 15-30분간 배양하며 가끔 부드럽게 혼합하고, 4°C에서 12,000 × g 에서 15분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거했습니다. 상원액을 수집하고 단백질 농도를 비신코닉산(BCA) 분석법으로 측정하였다.

동일한 양의 단백질(일반적으로 레인당 40 μg)을 로딩 버퍼와 혼합하고, 95°C에서 5-10분간 끓여 단백질을 변성시키고, 적절한 아크릴아마이드 농도의 도덱실 황산나트륨(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔(예: HMGB1 10-12%)에서 분리했습니다. 단백질은 관심 있는 분자량 범위에 권장되는 조건에서 습식 또는 반건식 전이(trans system)를 사용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막에 전달되었습니다. 막은 5% 무지방 우유 또는 소 혈청 알부민(BSA)을 Tris 완충 식염수와 0.1% Tween-20(TBST)에 1시간 동안 실온에서 차단한 후, 4°C에서 HMGB1(예: 1:500 희석)과 GAPDH(예: 1:1,000 희석)에 대한 1차 항체를 차단 완충 내에서 희석하여 박양하였습니다. TBST에서 세 차례 세척한 후, 막을 적절한 고추냉이 과산화효소 결합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 배양하였다. 추가 세척 후, 강화된 화학발광 기질을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하고 디지털 영상 시스템으로 포착하였습니다. 밴드 강도는 영상 분석 소프트웨어를 사용해 정량화하고, HMGB1 신호는 GAPDH로 정규화되었으며, 그룹 간 상대 발현을 비교하였습니다.

듀얼-루시페라제 리포트 분석법

예측된 miR-181a-5p 결합 부위를 포함하는 NEAT1의 야생형 및 돌연변이 조각과 HMGB1 3′-비번역 영역(3′-UTR)을 루시퍼레이스 리포터 벡터19로 클로네팅하였습니다. 모든 구성체는 삽입 및 돌연변이 부위를 확인하기 위해 Sanger 시퀀싱으로 검증되었다20. RAW264.7 세포는 24웰 플레이트에 시딩되어 하룻밤 동안 접착되도록 했습니다. 그 후 세포는 리포터 플라스미드와 miR-181a-5p 억제제, 모방제 또는 해당 음성 대조군을 지질 기반 형질염색 시약으로 공동 형질전환하여 일반 형질염색 절차에 적용하였습니다.

약 24-48시간 배양 후, 세포는 PBS로 세척하고, 적절한 수동 용해 완충제(예: 웰당 20 μL)에 용해한 뒤, 완전한 용해를 보장하기 위해 부드럽게 교반했습니다. 루시페라제 활성은 제조사의 지침에 따라 이중 루시퍼라제 분석 키트와 루미노미터를 사용해 측정되었습니다. 파이어플라이 루시퍼레이스 활성을 레닐라 루시퍼레이스 활성으로 정규화하여 형질전환 효율을 조절하였고, 각 그룹의 상대적 루시퍼라제 활성을 해당 대조군과 비교하였다.

트랜스웰 이동 분석

대식세포 이동은 세포 침투 분석에 적합한 세포외기질 젤이 미리 코팅된 트랜스웰 챔버를 사용하여 평가하였습니다. 젤은 혈청 무첨가 배지에 1:6 희석되어 얼음 위에 놓았고, 희석된 용액 50 μL를 각 인서트 상단에 첨가했습니다. 플레이트는 젤이 고체될 때까지 약 4시간 동안 37°C에서 인큐베이션되었습니다. 트랜스펙션 또는 처리된 RAW264.7 세포를 채취하여 혈청 무첨가 배지에 1× 106 세포/mL로 재현탁하고, 상부 챔버에 100 μL 세포 현탁액(1×10 5 세포)을 추가하였다. 하부 챔버에는 10% 태아 소 혈청이 화학유인제로 포함된 완전 배지 600 μL가 채워졌습니다.

세포는 37°C에서 5%CO2 로 24시간 배양하였다. 배양 종료 시, 막 상단에 남아 있던 이동하지 않은 세포는 면봉으로 부드럽게 제거했습니다. 하막 표면에 부착된 이동 세포는 상온에서 약 20분간 95% 에탄올로 고정한 후 0.5% 결정 보라색 용액으로 10-15분간 염색했습니다. 과도한 염료는 PBS로 세척하여 제거하고, 멤브레인은 자연 건조되었습니다. 이동한 세포는 광미경으로 검사되었고, 삽입물당 무작위로 선정된 여러 필드의 세포를 눈가맹 방식으로 세어 이동 능력을 정량화하였습니다.

TUNEL 세포자사사 분석법

세포자멸사 검출을 위해 RAW264.7 세포를 유리 커버슬립에 배양하여 지정된 처리 또는 형질전환을 받았습니다. 세포는 4% 파라포름알데히드로 상온에서 30-60분간 고정한 후 PBS로 세척하였습니다. 내인성 과산화효소 활성은 0.3% 과산화수소에서 20분간 배양한 후 PBS 세척으로 차단하였습니다. TUNEL 분석 키트를 사용했고, 표지 혼합물을 세포를 덮기 위해 적용되었습니다. 샘플은 37°C에서 약 60분간 가습 챔버에서 배양되었고, 키트 지침에 따라 반응이 중단되었습니다. 스트렙타비딘-HRP 또는 동등한 검출 시약으로 37°C에서 30분간 인큐베이팅한 후, 3,3′-디아미노벤지딘(DAB)과 같은 염색 기질과 함께 핵을 시각화하다가 갈색 염색된 세포자멸 핵이 드러났다. 슬라이드는 헤마톡실린으로 교환 염색을 하고, 등급 에탄올로 탈수한 후 자일렌으로 투명화한 후 영구 배지로 마운트되었습니다. 세포자멸 세포와 총 핵을 광학 현미경으로 관찰했으며, 세포자멸 지수는 TUNEL 양성 세포의 비율로 계산되었습니다.

면역형광

면역형광을 위해 파라핀 내재 조직 절편을 자일렌에 탈왁시킨 후 단계별 에탄올 시리즈를 통해 수화하여 물로 전환했습니다. 항원 회수는 적절한 완충제(예: 시트레이트 버퍼, pH 6.0)와 전자레인지 또는 압력솥을 이용한 열에 의한 에피토프 회상을 항체 권고에 따라 수행되었습니다. 냉각 및 세척 후, 절편을 37°C에서 PBS에 5% 정상 혈청으로 1시간 동안 차단하여 비특이적 결합을 줄였다. 조직은 이후 CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, 유도성 일산화질소 신타아제(iNOS), IL-4, IL-10, Arg-1(일반적으로 1:500 희석 비율)을 포함한 대식세포 분극 및 염증성 사이토카인 표지자에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양했으며, 차단 완충제에 희석되었습니다.

다음 날, 절편을 PBS로 세척하고 적절한 형광포자 결합 2차 항체와 함께 37°C에서 어두운 환경에서 1시간 동안 인큐베이팅했습니다. 핵은 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)으로 5분간 교환되었다. 최종 세척 후, 절편은 페이드 방지 매운팅 매체로 장착되고 적절한 필터 세트를 사용해 형광 현미경으로 검사했습니다. 이미지는 그룹 간 일관된 노출 설정으로 촬영되었으며, 모든 그림 패널과 평례에 20 μm 같은 축척 바와 배율이 표시되었습니다.

CLP 유발 패혈증 마우스 모델

수컷 C57BL/6 마우스(24-32g)는 수술 최소 1주일 전부터 적응시킨 후 Sham, CLP, CLP와 음성 대조군 단기 헤어핀 또는 CLP와 NEAT1 단기 머리핀 그룹(n=6명)에 무작위로 배정되었습니다. 쥐들은 약 1-3분 동안 밀폐된 챔버에서 에테르를 흡입하여 마취했으며, 적절한 호흡 기능을 유지하면서도 올바른 반사를 유도하는 용량과 노출 시간 동안 에테르나 다른 기관 승인 마취제를 잃게 되었습니다. 복털은 깎였고, 피부는 적절한 소독액으로 소독되었다. 약 1-2cm 두께의 중앙선 복강 절개술이 시행되어 장과 인접한 장을 노출시켰습니다.

CLP의 경우, 맹장은 부드럽게 외부에 노출되고 길이의 약 3분의 2 지점에 멸균 봉합사로 결찰되었으며, 회장판막을 막거나 장간막 혈류를 방해하지 않도록 주의하였습니다. 결찰된 맹장은 승인된 프로토콜에 명시된 게이지의 멸균 바늘(예: 21 G)으로 두 번 천공되었고, 소량의 대변 물질을 부드럽게 배출하여 천자 부위의 개성을 보장했습니다. 맹장은 복강으로 다시 돌아갔고, 복벽과 피부는 봉합사로 여러 겹으로 봉합되었습니다. 가짜 수술을 한 쥐들은 결찰이나 천자 없이 동일한 복부 절개술과 맹장에 노출된 치료를 받았다.

NEAT1의 생체 내 넉다운을 달성하기 위해, shNEAT1을 암호화하는 아데노바이러스 벡터와 해당 음성 대조 벡터를 정의된 역가(예: 1 ×10 9 플라크 형성 단위/mL)로 준비했습니다. 고정된 양의 바이러스 현탁액(예: 쥐당 100 μL)이 CLP와 비교한 특정 시점(예: 수술 후 1시간 후)에 꼬리정맥을 통해 투여되었으며, 이는 실험 설계에 명시되어 윤리위원회에서 승인되었습니다. 수술 후 쥐들은 수술 후 표준 치료를 받았으며, 필요시 피하 수액 소생술을 받았으며, 패혈증 및 고통의 임상 징후를 모니터링하였습니다. 예정된 시점에 동물들은 폐쇄된 챔버에서 에테르 과다복용 흡입으로 인도적으로 안락사되었으며, 호흡을 빠르게 정지시키기 위해 약 5-10 mL의 에테르를 사용했고, 이후 사망 확인을 거두고, 사이토카인 분석을 위해 혈액을 채취했으며, 조직병리학, 면역형광 검사, 분자 분석을 위해 장기를 적출했습니다.

통계 분석

통계 분석은 SPSS 버전 23.0 또는 동등한 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 별도 명시가 없는 한 평균 표준편차(SD)± 제시됩니다. 두 그룹 간 비교 시, 데이터가 균일한 정규분포와 동질적 분산을 가진 경우 쌍이 없는 학생 t-검정을 사용했습니다. 세 개 이상의 그룹 간 비교에는 일방향 분산분석(ANOVA)을 적용한 후, 유의미한 전체 효과가 발견되면 다중 비교에 대해 적절한 사후 검정을 시행하였습니다. 양측 p 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 통계 기호(예: p < 0.05, *p < 0.01)의 의미는 그림 전설에서 정의되었으며, 생물학적 복제 수는 해당 텍스트나 전례에 표시되어 있습니다.

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결과

패혈증에서 NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 발현 및 상호작용 검출

패혈증 환자의 혈청에서 NEAT1과 HMGB1 수치는 건강한 대조군보다 유의하게 높았으며, miR-181a-5p는 현저히 감소하였습니다. 유사한 발현 패턴은 PBMCs와 지질다당으로 자극된 RAW264.7 대식세포에서도 관찰되었으며, 이는 패혈증 및 패혈증 유사 염증 상태에서 이 축이 일관되게 변화함을 나타냅니다(그림 1A-C). RAW264.7 세포에서 NEAT1의 노크다운은 NEAT1 발현을 효율적으로 감소시키고 miR-181a-5p 수치를 증가시켜 기능적 연구에 적합한 NEAT1 결핍 모델의 확립을 확인시켰습니다(그림 1D). 이중 루시퍼레이스 리포터 분석법 결과, miR-181a-5p가 NEAT1과 HMGB1 3′-UTR의 예측된 ...

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토론

패혈증은 심각하고 종종 장기적인 면역 조절 장애를 특징으로 하며, 과염증과 면역억제 단계가 공존하며 장기 부전과 부진에 공존하는21,22. 누적된 증거에 따르면 긴 비암호화 RNA(lncRNA)가 염증 신호 전달과 대식세포 분극을 조절함으로써 이러한 과정에 참여하는 것으로 나타났습니다23,24. 예를 들어, lncRNA-MAAMT는 SRSF1/NF-κB 축25를 통해 대식세포 모집과 염증 촉진 활성화를 촉진하는 것으로 보고되었으며, TCONS_00019715 M1 분극26 축과 연관되어 있습니다. 이 맥락에서 본 연구 데이터는 NEAT1이 패혈증 환자와 LPS 자극 대식세포에서...

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

저자들은 허베이대학교 부속병원의 임상 및 실험실 직원들에게 환자 모집, 샘플 처리, 동물 관리를 지원해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 허베이성 보건위원회(보조금 번호 20220640)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아데노바이럴 벡터 (shNEAT1)10692-V5비진 바이오사이언스생체 내외에서 NEAT1 발현을 억제하는 데 사용되는 아데노바이러스.
BCA 단백질 분석 키트23227써모피셔세포 용해체 내 단백질 농도를 정량화하는 데 사용된 키트입니다.
듀얼-루시페라제 리포터 분석 키트E1910프로메가miR-181a-5p 상호작용을 측정하기 위한 이중 루시퍼레이스 리포터 분석에 사용되는 키트.
ELISA 키트 (사이토카인)해당 없음R& D 시스템즈혈청 및 조직 샘플에서 사이토카인 수치를 측정하는 데 사용되는 키트입니다.
태아 소 혈청 (FBS)16000-044깁코세포 성장을 위한 배양지에 사용되는 보충제입니다.
GAPDH 항체2118S세포 신호 전달 기술웨스턴 블롯에서 부하 조절에 사용되는 GAPDH에 대한 1차 항체.
헤마톡실린 및 이오신 염색 키트해당 없음써모피셔병리 분석을 위한 조직 절편의 조직학적 염색에 사용되는 키트입니다.
면역형광 항체 (CD206)14693-1-AP단백질 기술조직 절편에서 M2 대식세포 표지 CD206을 검출하는 데 사용되는 항체.
지지방다당류(LPS)L2630시그마-올드리치LPS는 RAW264.7 세포에서 염증성 대식세포 분극을 유도하는 데 사용되었습니다.
miR-181A-5P 모방해당 없음해당 없음합성 miR-181a-5p 모방품은 miR-181a-5p 수치를 조절하는 데 사용됩니다.
NEAT1 발현 플라스미드해당 없음해당 없음RAW264.7 대식세포에서 NEAT1 과발현에 사용되는 플라스미드.
RAW264.7 대식세포TIB-71ATCC시험관 내 실험에 사용되는 쥐 대식세포주.
RIPA 용해 버퍼89901써모피셔전체 단백질을 추출하기 위해 세포를 용해하는 완충제입니다.
RPMI-1640 미디엄11875-093깁코RAW264.7 대식세포용 배양 배양지.
SYBR 그린 마스터 믹스4385612써모피셔정량적 실시간 PCR 분석에 사용되는 시약입니다.
트랜스웰 이동 분석실3422코닝대식세포 이동을 평가하기 위한 트랜스웰 이동 분석에 사용되는 챔버.
TUNEL 세포자멸증 분석 키트AB66110앱캠TUNEL 염색을 통해 RAW264.7 세포에서 세포자멸사를 검출하는 데 사용되는 키트.
서부 블롯 항체(HMGB1)ab18256앱캠서부 블롯팅에 사용되는 HMGB1에 대한 1차 항체.

참고문헌

  1. Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Girardis, M., et al. Understanding, assessing and treating immune, endothelial and haemostasis dysfunctions in bacterial sepsis. Intensive Care Med. 50 (10), 1580-1592 (2024).
  3. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  4. Chen, L. L., Kim, V. N. Small and long non-coding RNAs: past, present, and future. Cell. 187 (23), 6451-6485 (2024).
  5. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  6. Ashrafizadeh, M., et al. Non-coding RNA-based regulation of inflammation. Semin Immunol. 59, 101606(2022).
  7. Zhang, L., Liu, B., Han, J., Wang, T., Han, L. Competing endogenous RNA network analysis for screening inflammation-related long non-coding RNAs for acute ischemic stroke. Mol Med Rep. 22 (4), 3081-3094 (2020).
  8. Pan, S., et al. LncRNA NEAT1 mediates intestinal inflammation by regulating TNFRSF1B. Ann Transl Med. 9 (9), 773(2021).
  9. Wang, L., Qu, P., Yin, W., Sun, J. Lnc-NEAT1 induces cell apoptosis and inflammation but inhibits proliferation in a cellular model of hepatic ischemia/reperfusion injury. J Int Med Res. 49 (3), 300060519887251(2021).
  10. Yamazaki, T., et al. Functional domains of NEAT1 architectural lncRNA induce paraspeckle assembly through phase separation. Mol Cell. 70 (6), 1038-1053.e7 (2018).
  11. Isobe, M., et al. Forced isoform switching of Neat1_1 to Neat1_2 leads to the loss of Neat1_1 and the hyperformation of paraspeckles but does not affect the development and growth of mice. RNA. 26 (3), 251-264 (2020).
  12. Zhang, R. X., et al. Mechanism of action of lncRNA-NEAT1 in immune diseases. Front Genet. 16, 1501115(2025).
  13. Liu, J., et al. LIN28A-dependent lncRNA NEAT1 aggravates sepsis-induced acute respiratory distress syndrome through destabilizing ACE2 mRNA by RNA methylation. J Transl Med. 23 (1), 15(2025).
  14. Zhou, Y., et al. Downregulation of lncRNA NEAT1 alleviates sepsis-induced acute kidney injury. Cent Eur J Immunol. 47 (1), 8-19 (2022).
  15. Hashemian, S. M., et al. Non-coding RNAs and exosomes: their role in the pathogenesis of sepsis. Mol Ther Nucleic Acids. 21, 51-74 (2020).
  16. Liu, B., Ren, H., Chen, J. LncRNA NEAT1 correlates with Th1 and Th17 and could serve as an assistant biomarker in sepsis. Biomark Med. 15 (13), 1177-1186 (2021).
  17. Sun, F., et al. LncRNA KCNQ1OT1 attenuates sepsis-induced myocardial injury via regulating miR-192-5p/XIAP axis. Exp Biol Med. 245 (7), 620-630 (2020).
  18. Luo, S., et al. Long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 1 alleviates sepsis-associated myocardial injury by modulating the miR-181a-5p/XIAP axis in vitro. Ann Clin Lab Sci. 51 (2), 231-240 (2021).
  19. Pan, W., et al. miRNA-204-5p acts as a tumor suppressor in gastric cancer by inhibiting cell migration, invasion, and glycolysis via the RAB22A/PI3K/AKT axis. Sci Rep. 15 (1), 204-205 (2025).
  20. Qi, R., et al. PRMT2-mediated upregulation of miR-323-3p in sensory neurons promotes trigeminal neuropathic pain by targeting Kv2. 1 channels. Cell Rep. 44 (8), 116028(2025).
  21. Cao, M., Wang, G., Xie, J. Immune dysregulation in sepsis: experiences, lessons and perspectives. Cell Death Discov. 9, 465(2023).
  22. Zeng, X., et al. Screening of key genes of sepsis and septic shock using bioinformatics analysis. J Inflamm Res. 14, 829-841 (2021).
  23. Zhao, Q., et al. Long non-coding RNAs regulate the inflammatory responses of macrophages. Cells. 11 (1), 5(2021).
  24. Yarani, R., Mirza, A. H., Kaur, S., Pociot, F. The emerging role of lncRNAs in inflammatory bowel disease. Exp Mol Med. 50 (12), 1-14 (2018).
  25. Gan, T., et al. LncRNA MAAMT facilitates macrophage recruitment and pro-inflammatory activation and exacerbates autoimmune myocarditis through the SRSF1/NF-κB axis. Int J Biol Macromol. 278 (Pt 1), 134193(2024).
  26. Munteanu, M. C., et al. Long non-coding RNA FENDRR regulates IFNγ-induced M1 phenotype in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 13672(2020).
  27. Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
  28. Zhang, R., Feng, J. The diagnostic value of plasma high mobility group box 1 for sepsis following severe trauma. J Surg Res. 314, 79-84 (2025).
  29. Li, X., Jing, G., Guo, Z., Guo, Z. High-mobility group box 1 in acute kidney injury. Front Pharmacol. 16, 1618971(2025).
  30. Fan, H., et al. Inhibiting HMGB1-RAGE axis prevents pro-inflammatory macrophages/microglia polarization and affords neuroprotection after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 17 (1), 295(2020).
  31. Hollis, R., Tenet, M., Aziz, M., Wang, P. Anti-DAMP therapies for acute inflammation. Front Immunol. 16, 1579954(2025).
  32. Roh, J. S., Sohn, D. H. Damage-associated molecular patterns in inflammatory diseases. Immune Netw. 18 (4), e27(2018).
  33. Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
  34. Cheng, Y., et al. Identification of circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA competitive endogenous RNA network as novel prognostic markers for acute myeloid leukemia. Genes. 11 (8), 868(2020).
  35. Shahpari, M., et al. The functional roles of competitive endogenous RNA (ceRNA) networks in apoptosis in human cancers: the circRNA/miRNA/mRNA regulatory axis and cell signaling pathways. Heliyon. 10 (21), e37089(2024).
  36. Huang, L., Wu, C., Xu, D., Cui, Y., Tang, J. Screening of important factors in the early sepsis stage based on the evaluation of ssGSEA algorithm and ceRNA regulatory network. Evol Bioinform Online. 17, 11769343211058463(2021).
  37. Liu, Z., et al. Uncovering the ceRNA network related to the prognosis of stomach adenocarcinoma among 898 patient samples. Biochem Genet. 62 (6), 4770-4790 (2024).
  38. Zhu, J., et al. lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA ceRNA network in lumbar intervertebral disc degeneration. Mol Med Rep. 20 (4), 3160-3174 (2019).
  39. Chang, Z., et al. The construction and analysis of ceRNA network and patterns of immune infiltration in colon adenocarcinoma metastasis. Front Cell Dev Biol. 8, 688(2020).
  40. Hume, D. A., Irvine, K. M., Pridans, C. The mononuclear phagocyte system: the relationship between monocytes and macrophages. Trends Immunol. 40 (2), 98-112 (2019).
  41. Smigiel, K. S., Parks, W. C. Macrophages, wound healing, and fibrosis: recent insights. Curr Rheumatol Rep. 20 (4), 17(2018).
  42. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  43. Arts, R. J. W., Netea, M. G. Adaptive characteristics of innate immune responses in macrophages. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
  44. Sweet, M. J., Ramnath, D., Singhal, A., Kapetanovic, R. Inducible antibacterial responses in macrophages. Nat Rev Immunol. 25 (2), 92-107 (2025).
  45. Rasheed, A., Rayner, K. J. Macrophage responses to environmental stimuli during homeostasis and disease. Endocr Rev. 42 (4), 407-435 (2021).
  46. Lee, H. C., et al. LPS-induced systemic inflammation is suppressed by the PDZ motif peptide of ZO-1 via regulation of macrophage M1/M2 polarization. eLife. 13, RP95285(2024).
  47. Qiu, P., Liu, Y., Zhang, J. Review: the role and mechanisms of macrophage autophagy in sepsis. Inflammation. 42 (1), 6-19 (2019).
  48. Patoli, D., et al. Inhibition of mitophagy drives macrophage activation and antibacterial defense during sepsis. J Clin Invest. 130 (11), 5858-5874 (2020).

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