폐선암 예후를 위한 표적 유전체 프로파일링 및 면역세포 침윤의 통합 분석

요약

이 프로토콜은 차세대 시퀀싱과 다색 면역형광을 통합하여 폐선암을 프로파일링할 수 있게 합니다. 이 연구는 유전체 이질성과 종양 침투 면역 세포 밀도 간의 관계를 분석하는 것을 목표로 합니다. 이러한 다차원적 접근법은 수술 후 예후 평가를 위한 종양 미세환경의 포괄적 평가를 가능하게 합니다.

초록

폐선암(LUAD)의 예후는 전통적으로 종양 결절전이(TNM) 병기 측정을 통해 평가되며, 이는 환자의 면역 상태를 고려하지 않습니다. 이 프로토콜은 유전체 프로파일링과 면역 미세환경 분석을 통합하여 보다 포괄적인 수술 후 예후 평가를 지원합니다. 이 방법은 두 가지 주요 기법을 사용하여 파라핀 내재 종양 조직의 후향적 분석을 포함합니다. 첫째, 차세대 시퀀싱(NGS)은 맞춤형 37개 유전자 패널로 수행되어 동기 유전자의 돌연변이와 중요성이 불확실한 변이들을 식별합니다. 둘째, 다중성 면역형광(mIF)을 이용해 HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1, PanCK 등의 표적을 표적으로 합니다. 이를 통해 다양한 종양 영역에 걸친 특정 면역 세포 하위 집단의 공간적 분포와 밀도를 정량화할 수 있습니다. 이 통합 접근법은 유전체 이질성과 종양 침윤 면역 세포 특성의 동시 평가를 가능하게 합니다. 결과적으로 생성된 데이터는 EGFR 상태와 같은 돌연변이 프로필의 특정 조합과 면역 세포 밀도를 식별합니다. 이러한 통합 조합은 환자 생존에 미치는 집단적 영향을 연구할 수 있게 하며, 향후 폐암 예후 모델 개발에 유망한 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜은 LUAD 종양 미세환경의 복잡한 생물학적 특징을 특성화하는 견고한 방법을 보여줍니다.

서론

LUAD는 폐암 중 가장 흔한 아형이지만, 평균 5년 생존율은 약 15%로 낮습니다^. 현재의 예후 평가는 주로 TNM 스테이징 시스템에 의존하고 있습니다; 하지만 이 방법은 환자의 전반적인 면역 상태를 간과하여 예측 정확도를 제한할 수 있습니다. 증거는 유전체 이질성과 종양 미세환경(TME)이 LUAD 종양 발생과 질병 진행에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다 ^2,3.

최근 몇 년간 전통적인 생거 시퀀싱에서 표적 NGS로의 전환을 통해 EGFR, TP53, KRAS ^4,5와 같은 다중 드라이버 유전자의 고민도 동시 분석이 가능해졌습니다. NGS는 유전적 변형의 고해상도 지도를 제공하지만, 유전체 데이터만으로는 TME 내의 복잡한 세포 상호작용과 공간적 조직을 포착할 수 없습니다.

이러한 복잡성을 해결하기 위해 mIF는 전통적인 면역 프로파일링 방법에 비해 상당한 장점을 제공합니다. 단일 중화 면역조직화학(IHC)은 절편당 하나의 마커로 제한되는 반면, mIF는 조직의 공간적 구조를 보존하면서 여러 단백질 마커를 동시에 검출할 수 있게 합니다. 조직 분해를 유발할 수 있는 순차적 IHC나 공간적 위치 상실과 단일 세포 해상도^상실을 초래하는 유세포분석과 대량 RNA 시퀀싱 ^6,7,8과 달리, mIF와 공간 영역 주석을 결합하면 면역 지형의 현장 다중 매개변수 특성 분석이^{가능합니다.}

이 프로토콜은 표적 NGS, mIF, 공간 영역 평가(전체 조직, 종양 경계, 종양 코어를 포함)를 통합한 통합 워크플로우를 구축합니다. 이러한 다차원적 접근은 유전체 변형과 면역 세포 밀도 간의 상호작용을 조사하는 데 필요하며, 이는 단일 모달리티 접근법이 종종 포착하지 못하는 관계입니다. 이러한 통합적 특성을 평가함으로써 본 프로토콜은 LUAD의 생물학적 특징을 특성화하는 보완적 전략을 제공하며, 수술 후 예후 계층화를 위한 보다 견고한 틀을 제공합니다.

프로토콜

이 후향 연구는 쿤밍 옌안병원 의학윤리위원회(승인 번호 2021-140-01)에서 승인되었습니다. 모든 참가자로부터 사전 동의를 받았습니다.

연구 설계 및 표본 수집
2015년부터 2021년 사이에 외과적 절제를 받은 병리학적 또는 조직학적으로 확진된 LUAD를 가진 63명의 환자 코호트가 등록되었습니다. 제외 기준에는 수술 전 신보조 화학요법, 방사선 치료 또는 면역치료를 받은 것이 포함되었습니다. 또한, 동반 악성 종양, 중증 동반 질환, 조직 질 저하 또는 불완전한 임상 기록을 가진 환자는 분석에서 제외되었습니다. 포름말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 종양 블록을 1mm 절로 처리하여 탈파라핀화하였습니다. 워크플로우(그림 1)에서 볼 수 있듯이, 이 샘플들은 mIF와 표적 NGS를 이용한 통합 분석을 거쳤습니다. 이 결합된 접근법은 유전체 변이와 면역 미세환경 특성을 동시에 평가할 수 있게 하여 종양 생물학을 특성화하는 다차원적 틀을 제공합니다.

후속 작업
환자 대상 약물, 면역치료, 질병 진행 또는 사망 상황은 전화 추적 관찰로 이루어졌으며, 생존 상태, 질병 진행 또는 재발, 수술 후 받은 보조 치료, 새로 진단된 동반 질환에 관한 상세한 정보를 얻었습니다. 추적 관찰 기간은 2023년 7월에 종료되었으며, 최종 관찰 평가 지표는 질병 진행 또는 사망이었습니다. 전체 생존 기간은 수술 시작부터 환자의 사망까지의 시간으로 정의되었습니다. 추적 관찰에서 사망한 환자는 없었다. 최소 추적 관찰 기간은 21개월이었습니다.

NGS 라이브러리 준비 및 시퀀싱
FFPE 조직 절편에서 DNA 추출
병리학적 표본에서 3–10 μm 두께의 FFPE 조직 절편을 얻으세요. 절편을 멸균 미세원심분리관에 넣으세요. 각 튜브에 자일렌을 넣고 실온에서 5–10분간 배양하여 파라핀을 제거합니다. 12,000 x g 에서 원심분리기를 5분간 사용한 후 상액을 조심스럽게 버립니다. 완전한 탈파라핀 효과를 위해 자일렌 처리를 1번 반복하세요. 잔류 자일렌을 제거하기 위해 100% 에탄올로 순차적으로 2번 세척하세요. 펠릿을 실온에서 자연 건조하여 잔류 에탄올이 완전히 증발할 때까지 보관합니다. 적절한 용해 완충제와 단백질분해효소 K(DNA 추출 키트에 제공됨)를 추가하고 56°C에서 1–3시간(필요 시 하룻밤) 조직이 완전히 용해될 때까지 인큐베이션합니다. 90°C에서 1시간 동안 추가 배양하여 포르말린 가교 역전을 수행합니다. 제조사 지침에 따라 상업용 FFPE DNA 추출 키트 (재료표 참조)를 사용하여 유전체 DNA를 추출하세요. FFPE 샘플의 DNA 품질은 종종 단편화되어 있습니다; 따라서 DNA 품질은 표적 NGS를 위한 성공적인 라이브러리 준비를 위해 최소 무결성 기준(예: DIN ≥ 5)을 충족해야 합니다.

DNA 정량화 및 정규화
정확한 농도 측정을 위해 형광측정법을 사용하여 DNA를 정량화합니다. Tris-HCl 버퍼(pH 8.5)를 사용하여 DNA 샘플을 최종 농도인 약 5–10 ng/μL로 정규화합니다. 필요하다면 DNA 농도의 정확성과 안정성을 보장하기 위해 점진적으로 희석 단계를 수행하세요.

라이브러리 준비 및 표적 농축
FFPE 조직¹⁰에서 추출한 DNA에 하이브리드 캡처 기반 표적 NGS를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 준비합니다. 종양 발생과 관련된 선택된 유전자의 외분자 영역을 커버하는 맞춤형 프로브 패널을 사용하여 표적 풍부화를 수행합니다. 필요 시 표준 방법(예: 전기영동 기반 시스템)을 사용하여 라이브러리 품질과 조각 크기 분포를 평가합니다.

라이브러리 풀링 및 시퀀싱
각 라이브러리를 형광측정법(fluorometric assay)으로 정량합니다. 시퀀싱 키트 요구사항에 따라 등몰 농도의 풀 라이브러리. 풀링된 라이브러리를 일루미나 시퀀싱 플랫폼에 로드하고 150 bp 페어 엔드 시퀀싱 패턴으로 시퀀싱을 수행합니다.

데이터 처리 및 변이 탐지
원시 시퀀싱 리드는 어댑터 트리밍, 품질 필터링, 인간 참조 게놈(GRCh37/hg19)과의 정렬 등 표준 생물정보학 파이프라인을 사용하여 처리되었습니다. 품질 관리 지표는 다음과 같았습니다: Q20 > 85%, 평균 시퀀싱 깊이 > 2500배, 온타겟률 > 65%, Fold 80 기본 페널티 ≤ 2. 품질 관리 및 정렬: 원시 FASTQ 데이터는 FastQC와 Trim Galore(또는 Trimmomatic)를 사용하여 어댑터 오염과 저품질 서열을 제거하기 위한 품질 관리를 거쳤습니다. 정화된 리드는 Burrows-Wheeler 정렬기(BWA)를 사용하여 GRCh37(hg19) 인간 참조 게놈에 정렬되었습니다. 정렬 후 처리: Picard와 Genome Analysis Toolkit(GATK)을 사용하여 정렬, 중복 표시, 기본 품질 점수 재보정(BQSR)을 수행하여 거짓 양성 호출을 최소화하였습니다. 변이 호출: 생식계통 단일염기다형성(SNP)과 InDels는 BWA MEM(0.7.16a - r1181)을 사용하여 검출되었습니다. 체성 SNV와 Indel은 Mutect2와 VarScan2를 이용한 합의 접근법을 통해 확인되었습니다. 저빈도 돌연변이는 Freebayes(v 1.3.2) 통계 모델을 사용하여 추가로 평가하였다. 주석 및 필터링: 변종은 ANNOVAR을 사용하여 gnomAD, ClinVar, COSMIC의 데이터를 통합하여 주석을 달았습니다. 생식계 변이는 고빈도 집단 SNP를 걸러내고 변이 대립유전자 빈도(VAF)를 평가하여 체세포 돌연변이와 구별하였다. VAF 임계값: 클론 이벤트(예: ROS1 및 ALK)에는 ≥5%의 VAF 컷오프가 적용되었고, 유전자 돌연변이(예: EGFR)에는 1% 임계값을 적용하여 저주파 변이를 감지할 수 있었는데, 이는 >500배의 높은 평균 시퀀싱 깊이 덕분에 가능했습니다. 생식계 돌연변이는 1000 Genomes Project(1000G) 데이터와 우리 연구실에서 구축된 건강한 한족 개인의 지역 기초 데이터베이스를 사용하여 체세포 돌연변이와 구분하였습니다. 검출된 체세포 변이에 대한 병원성 평가는 AMP/ASCO/CAP 프레임워크¹¹에 따라 수행되었으며, 이는 단계적이고 근거 기반의 접근법을 통해 체세포 변이에 대한 증거 등급을 정교하게 조정합니다. 병원성/병원성 가능성(P/LP) 변이는 유지되며, 등급 평가를 위해 A/B(FDA 승인, 임상시험) 또는 C/D(전임상 및 증례 연구) 증거가 필요한 Tier I/II 기준에 따라 분류됩니다. Tier III(VUS)는 결정적인 근거가 부족한 반면, Tier IV는 인구 빈도(예: gnomAD) 또는 기능적 연구를 통해 양성 변이를 나타냅니다; 이러한 돌연변이는 이후 분석에서 제외됩니다. 검출된 생식계 변이의 병원성 평가는 ACMG/AMP 지침¹²에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서는 병원성(P), 병원성 가능성(LP), 불확실한 유의성(VUS) 변이가 기록되었습니다. 하위 분석에는 품질 관리 기준을 통과하는 고신뢰 변이만 포함되었습니다(QUAL ≥1; 생식세포 돌연변이는 적용 깊이 >10, 체세포 돌연변이는 적용 깊이>500배)

FFPE 조직에서 샘플 제제
파라핀 절면의 준비
미세토임을 사용해 FFPE 조직 블록을 두께 3μm 크기로 절단합니다. 40–45 °C 수조에 부유하여 조직을 평평하게 만듭니다. 절편을 접착식 현미경 슬라이드에 부착하고 상온에서 건조합니다. 슬라이드를 65°C 건조 오븐에 1시간 동안 넣어 조직 조각이 슬라이드에 단단히 붙도록 하고 과도한 파라핀을 녹이세요.

탈파라핀화 및 재수화
슬라이드를 스테인 선반에 놓고 투명 용액 I에 5분간 담가세요. 슬라이드를 순차적으로 5분씩 전달하여 용액 II와 용액 III를 완전히 녹여 완전히 녹입니다. 잔류 클리어링 시약을 제거하기 위해 슬라이드를 100% 에탄올에 3분간 옮깁니다. 조직 절편은 단계별 에탄올 시리즈를 통해 재수화합니다: 95% 에탄올을 3분, 80% 에탄올을 3분간 투여합니다. 증류수에 2번 세척을 하고, 세탁 사이에 3분을 두세요. 탈파라핀화 과정에서 사용된 자일렌과 에탄올은 휘발성과 독성 때문에 화학 연기 후드에서 취급되었습니다. 유기 용매가 포함된 모든 폐기물 용액은 별도로 수집되어 기관의 유해 폐기물 처리 지침에 따라 폐기되었습니다.

HE 염색 파티션
헤마톡실린과 에오신 염색
탈파라핀화 및 재수화 후 슬라이드를 상온에서 5–10분간 헤마톡실린 용액에 담가. 흐르는 수돗물 아래에서 5분간 세척하세요. 슬라이드를 1% 염산 알코올에 몇 초(3–10초) 분리합니다. 즉시 흐르는 수돗물로 씻어내세요. 슬라이드를 수돗물이나 블루잉 용액에 5분간 담가서 블루 핵을 만듭니다. 슬라이드를 에오신 용액에 실온에서 1–3분간 담그세요. 필요하면 증류수로 잠깐 헹구세요.

탈수와 정화
건조물이 등급 에탄올을 통과합니다: 80% 에탄올이 1분간 머무르며; 95% 에탄올을 1분간, 100% 에탄올을 2회 1분간 사용했습니다. 자일렌 I–II에 투명 슬라이드를 2–5분씩 사용하세요.

장착
중성 발삼을 한 방울 뿌려. 공기 방울을 피하려면 커버슬립을 조심스럽게 깔아야 합니다. 영상 촬영 전에 실온에서 슬라이드를 건조시키세요.

FFPE 조직 절편의 다중면역형광 염색
동일한 조직 절편에서 여러 면역 및 종양 표지를 검출하기 위해 순차적 다중성 면역형광 염색이 수행되었습니다. 이 접근법은 공간적 맥락을 유지하면서 다양한 세포 집단을 현장 에서 시각화할 수 있게 합니다¹³. 항원 추출: 염색 병에 항원 회수 완충제를 채웁니다. 병을 전자레인지에 넣고 3-5분간 고압으로 가열해 용액이 끓기 시작할 때까지 가열하세요. 탈파라핀화 및 재수화 후 슬라이드를 가열된 채취 완충제로 조심스럽게 옮기고, 조직 절편이 완전히 잠기도록 하세요. 효율적인 항원 차단을 위해 저마이크로파 출력으로 15분간 열슬라이드를 합니다. 가열 후에는 실온에서 30분간 자연스럽게 식히세요. 항원 회취 과정을 멈추기 위해 슬라이드를 얼음물에 5분간 옮기세요.

세척 및 소수성 장벽 준비
잔여 회수 완충제를 제거하기 위해 증류수로 슬라이드를 한 번 헹구세요. 소수성 장벽펜을 사용해 각 조직 부위에 원을 그리세요. 증류수로 다시 잠시 세척하세요. 슬라이드를 두 번 세척하고 TBST 버퍼를 사용하세요. 세탁 후에는 3분간 슬라이드를 수평으로 놓아 완충제를 완전히 제거하세요.

블로킹
블로킹 버퍼를 조직 절편을 완전히 덮으세요(슬라이드당 ~100 μL). 실온에서 가습 챔버에서 15분간 슬라이드를 배양합니다.

1차 항체 배양
흡수성 종이에 슬라이드 가장자리를 살짝 두드려 차단 버퍼를 제거하세요. HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1, PanCK에 대한 1차 항체를 1:100에서 1:400 사이의 최적화된 작업 희석 비율로 적용하였다. 각 조직 절면에 희석된 1차 항체 용액 ~100 μL을 도포합니다. 가습실에서 37°C에서 슬라이드를 인큐베이트하세요: 1시간 동안 37°C, 또는 감도를 높이기 위해 하룻밤에 4°C로 조절하세요.

세척
TBST 버퍼로 3번 세척하고, 각 3분씩 세척하세요. 세척 후에는 슬라이드를 수평으로 놓아 완충 배수를 확보하세요.

2차 항체 인배큐어
2차 항체 용액을 TBST 버퍼에 1:3 비율로 희석하여 준비합니다. 각 슬라이드에 약 100 μL 2차 항체 용액을 도포합니다. 37°C에서 10분간 가습실에서 인큐베이트를 슬라이딩합니다. 세척 슬라이드를 TBST로 3번, 각 세척마다 3분씩 하세요.

형광 신호 증폭
형광 증폭 시약을 증폭 버퍼에 1:100으로 희석하세요. 각 슬라이드에 희석된 시약 100 μL를 도포합니다. 광표백을 방지하기 위해 실온에서 어두운 곳에서 10분간 슬라이드를 인큐베이트하세요. 세척 슬라이드를 TBST로 3번, 각 세척마다 3분씩 하세요.

마커 간 항원 회출
설명한 대로 마이크로파 항원 회수를 수행하세요. 가열 후에는 차가운 물에 5분, 얼음물에 5분씩 차례로 슬라이드합니다.

추가 마커의 순차적 염색
추가 항체 표지자마다 1차 및 2차 항체 인베이킹 단계를 반복합니다. 다음 항체로 진행하기 전에 각 마커를 염색한 후 항원 회취를 반드시 수행해야 합니다.

핵 염색 방지
슬라이드를 TBST 버퍼로 1번 세척하세요. DAPI 핵 스테인을 바르세요. 실온에서 5분간 어두운 환경에서 배양하세요. 슬라이드를 증류수로 3번 세척하세요. 종말 결정: 핵은 형광 현미경 검사에서 명확히 염색되어 있어야 합니다.

최종 마커 전용 염색
증폭 완충제에 1:200 희석한 비오틴 용액을 적용하고, 실온에서 10분간 배양합니다. 슬라이드를 TBST 버퍼로 3번 세척하세요. 설명한 대로 항원 추출을 수행하세요. 슬라이드를 TBST 버퍼로 3번 세척하세요. 내인성 비오틴 차단 시약을 적용하고 37°C에서 30분간 배큐합니다. 염색 염료를 1:100 TBST에 뿌리고 실온에서 어두운 환경에서 30분간 배양하세요. 슬라이드를 TBST로 1번 세척하고 3분간 배수하세요.

장착
조직 부분에 안티페이드 마운팅 매개체 한 방울을 떨어뜨립니다. 슬라이드 위에 커버슬립을 조심스럽게 덮어주세요. 영상 촬영 전에 슬라이드를 건조시키세요.

H&E 및 mIF 단면의 이미지 획득
H&E 염색 및 mIF FFPE 조직 절편의 전체 슬라이드 이미지(WSI)를 슬라이드 스캐너를 사용하여 획득하였습니다. H&E 절편에는 밝은 필드 주사가 사용되었고, mIF 절편에는 형광 주사가 사용되었습니다. 목표: 개요 스캔을 위한 20배 배율; 고해상도 지역 영상을 위한 40배 배율. 여기 및 방출 설정: 제조사 사양에 따라 각 형광체별로 최적화됨. 노출 시간 및 이득: 영상 소프트웨어가 자동으로 조정하여 포화 없이 적절한 신호 세기를 보장합니다.

mIF 품질 관리 및 이미지 평가 가능성
mIF 결과의 신뢰성을 보장하기 위해, HALO 디지털 병리 시스템을 이용한 조직 분류 및 세포 정량화 전에 엄격한 QC 프로토콜이 시행되었습니다. 인공물 제거 및 평가 영역 정의: 전체 슬라이드 이미지(WSI)를 세심하게 검토하여 조직 주름, 염색 인공물, 비특이적 배경 신호가 포함된 영역을 수동으로 배제하였습니다. 이 단계는 오탐 신호를 방지하고 공간 분석의 정확성을 보장하기 위해 필수적이었습니다. 이 스크리닝 후 모든 샘플의 조직 면적의 평균 80%(범위: 50%–95%)가 평가 가능한 mIF 영역으로 지정되었습니다. 병리학적 검증 및 분할: 종양 및 기질 구획을 정확히 구분하기 위해 mIF 절편을 H&E 염색한 인접한 일련 절편과 교차 참조하였으며, 주석은 두 명의 경험 많은 병리학자가 독립적으로 검토했으며, 불일치는 합의로 해결되었습니다. 종양 조직 면적이 30% 미만인 샘플은 분석적 엄격성을 유지하기 위해 연구에서 제외하였습니다. 정량화 후 검증: 자동 세포 표현형 및 정량화 후, 병리학자들은 면역 세포 하위 집단의 공간적 분포와 발현 패턴을 재평가하였다. 이 검토는 디지털 정량 데이터가 근본적인 조직형태학적 특성과 일치함을 보장하여 결과의 신뢰성과 정확성을 보장했습니다.

디지털 병리 분석 및 영역 주석
파노라마 스캔 이미지는 디지털 병리학 이미지 분석 플랫폼으로 가져와 처리되었습니다. HALO AI 핵 Seg-플러그인을 사용해 세포를 분할하고 식별했습니다. H&E 염색을 기준으로 하여 다음 관심 영역(ROI)을 수동으로 주석 달았습니다: 전체 종양 영역(WSIT); 종양 경계(TB); 종양 코어(TC). 양성 신호 검출은 형광 강도 임계값과 각 마커의 예상 세포 내 위치 측정을 기반으로 결정되었습니다. 이 구획 특이적 접근법은 배경 간섭을 최소화하고 면역 세포 식별의 정확도를 높이기 위해 적용되었습니다. 면역 세포 밀도는 선택된 종양 부위당 마커 양성 세포의 수로 정량화되었습니다. 조직 형태를 기반으로 대응하는 H&E 파생 주석과 mIF 이미지를 정렬합니다. 환자들은 각 마커의 면역 세포 밀도 중앙값에 따라 고밀도 그룹과 저밀도 그룹으로 계층화되었습니다.

통계 분석
분석에는 SPSS 17.0 소프트웨어가 사용되었습니다. 정규분포 데이터는 표준편차± 평균 단위로, 비정규분포 정량 데이터는 중앙값(25%-75% 분위수 범위)으로 표현되었습니다. 각 유전자 돌연변이 유형, 면역 세포 밀도 및 임상 특성 간의 상관관계는 파이썬 라이프라인 모델을 이용한 Cox 비례 위험 회귀 모델로 분석되었습니다. 표본 크기와 데이터가 정규분포에 부합하는지 여부에 따라, 연속 변수 간 비교에는 학생 검정 또는 Mann-Whitney U 검정이 사용되었습니다. 순위 변수 비교에는 윌콕슨 부호 랭크 검정이 사용되었습니다. 표본 크기와 이론적 빈도에 따라 순서가 없는 범주 변수 분석에는 카이제곱 검정 또는 피셔의 정확 검정이 선택되었습니다. 상관관계 분석에는 스피어먼 검정 또는 피어슨 검정이 사용되었습니다. 환자의 전체 생존율은 Kaplan-Meier 방법으로 산출되었고, 검사에는 로그 랭크 검정이 사용되었습니다. 생존 곡선은 RStudio 소프트웨어를 기반으로 한 R 언어를 사용해 그렸습니다. P값 <0.10은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

실용적 적용 및 한계
이 통합 워크플로우의 신뢰성 있는 구현을 위해 FFPE 조직 블록은 이상적인 종양 세포 비율 ≥30%와 광범위한 괴사 또는 주요 조직 유물이 없는 엄격한 품질 기준을 충족해야 합니다. mIF의 기술적 성공은 조직 보존에 크게 의존하며; 과잉 고정, 과도한 손상, 높은 배경 자가형광과 같은 요인은 항체 침투력 부족과 불최적화 신호 강도를 초래할 수 있습니다. 더 나아가, 이 연구의 몇 가지 내재적 한계도 고려해야 합니다. 첫째, 분석은 63명의 환자로 구성된 사후 단일 센터 코호트를 기반으로 하여, 통계적 역량과 다른 집단에 대한 광범위한 일반화 가능성을 제한할 수 있습니다. 둘째, 평가 범위는 고정된 37유전자 NGS 패널과 특정 면역 표지자 세트(HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1, PanCK)로 제한됩니다; 보충표 1). 출처에서 언급했듯이, 이러한 결합 접근법은 예후 계층화에 더 견고한 틀을 제공하지만, 이러한 연관성을 더욱 검증하고 확인된 바이오마커의 예측 유용성을 정교화하기 위해서는 더 큰 전향적 다기관 연구가 필요합니다.

결과

폐선암 환자의 임상적 특징
2015년부터 2021년까지 저희병원에서 LUAD 진단을 받고 수술 치료를 받았으며 포함 기준을 충족한 총 63명의 환자가 이 연구에 수집되었습니다. 포함된 환자의 임상 특성은 표 1에 나와 있습니다. 등록된 환자 중 중위 연령은 60세(47-73세)였으며, 남성 환자 중 30/63명(46.2%)과 여성 환자 33/63명(53.8%)이 포함되어 있었습니다. 흡연 병력이 있는 환자 63명(35.4%)이 있었습니다. 등록된 모든 환자의 병리학적 유형은 LUAD였습니다. 미국 합동 암 위원회¹⁴의 TNM 병기 기준 8판에 따르면, IB 기 27/63(41.5%), IIA 기 3/63 사례(4.6%), II B 기 10/63(15.4%), IIIA 기 15/63(23.1%), IIIB 기 2/63(3.1%), 4기 8/63(1...

토론

LUAD의 통합 유전체 및 공간 해상도 면역학적 프로파일링
본 연구는 목표 NGS와 mIF를 결합한 통합 워크플로우를 통해 LUAD의 다차원 환경을 특성화합니다. 우리의 유전체 연구 결과는 특히 돌연변이 빈도의 민족적 변이에 관한 이전 문헌과 일치합니다. 관찰된 EGFR 돌연변이율(약 40%-60%)은 아시아 집단에서 보고된 빈도와 일치하며, 이는 서구 코호트(15-20%)보다 유의미하게 높습니다(15,16,17,18,19,20). 더 나아가, PMS2...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알파 TSA 멀티플렉스 IHC 키트	알파스바이오 테크놀로지 주식회사	AXT36025011	다중면역형광 염색
안티페이드 마운팅 매체	리젠 테크놀로지 주식회사	IH0252, 로트 0525A17	다중면역형광 염색
CD163	베이징 중산 골든 브리지 바이오테크놀로지 유한회사	ZM0428	RRID:AB_3714707; 다중면역형광 염색
CD206	애브캠 주식회사	카탈로그#5307-1	RRID:AB_10896526; 다중면역형광 염색
CD68	베이징 중산 골든 브리지 바이오테크놀로지 유한회사	ZM0060	RRID:AB_2904190; 다중면역형광 염색
맞춤형 암 유전자 패널	트위스트 주식회사		NGS 도서관 준비 및 nbsp;
탈파라핀화 버프	키아겐 주식회사	19093	DNA 추출 HE 염색; FFPE 조직 절편에서 다중화 면역형광 염색
다이나비드 M-270 스트렙타비딘	서모 주식회사	65602	NGS 도서관 준비 및 nbsp;
형광도계	서모피셔 사이언티픽 주식회사	큐비트 4.0	NGS 도서관 준비 및 nbsp;
HALO 디지털 병리 영상 분석 플랫폼	인디카 랩스, Inc., 앨버커키	버전 3.6.4134	HE 염색 및 다중성 면역형광 염색 분석
헤마톡실린-에오신 염색 키트	우한 연구과학기술유한회사.	E-IR-R117	HE 착색
HiPure FFPE DNA 키트	광저우 마겐 바이오테크놀로지 유한회사.	D6323	FFPE 조직 절편에서 DNA 추출
HLA-DR	화비오 주식회사	ET1610-66	RRID:AB_3069950; 다중면역형광 염색
일루미늄 DNA 시퀀서	일루미나, 그리고 nbsp; 주식회사	550DX	시퀀싱
중성 발삼	베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 주식회사	G8590	HE 착색
Panck와 nbsp;	베이징 중산 골든 브리지 바이오테크놀로지 유한회사	ZM0069	RRID:AB_2941997; 다중면역형광 염색
PD-L1	연구 및 개발 시스템	카탈로그 # AF1019	RRID:AB_354540; 다중면역형광 염색
TBST 버퍼	abclonla 테크놀로지 주식회사	RM00013	HE 염색 및 다중성 면역형광 염색
UN-차단기와 nbsp;	호므겐 주식회사		NGS 도서관 준비 및 nbsp;
VAHTS DNA 클린 비즈	바자임 주식회사	N411	NGS 도서관 준비 및 nbsp;
VAHTS 단일리얼 DNA 라이브러리 일루미나용 준비 키트	바자임 주식회사	ND610	NGS 도서관 준비 및 nbsp;
전체 슬라이드 영상 시스템	자이스 주식회사	자이스 AXIOSCAN 7 버전3.3	HE 염색 및 다중성 면역형광 염색 분석
xGen 하이브리드화 및 세척 키트	IDT 주식회사	1080577	NGS 도서관 준비 및 nbsp;