글로벌 N6-메틸라데노신 RNA 변형 수준을 검출하기 위한 도트 블롯 분석

Suxia Guo; Junli Chang; Xiaobo Wang; Fulai Zhao; Peng Zhao; Binghan Yan; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69860

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방법 논문

글로벌 N⁶-메틸라데노신 RNA 변형 수준을 검출하기 위한 도트 블롯 분석

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DOI:

10.3791/69860

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2026년 2월 6일

Suxia Guo^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Xiaobo Wang¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Binghan Yan¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 도트 블롯을 이용해 전반 m⁶A 수치를 반정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 총 RNA를 추출, 변성, 나일론 막에 점상화하고, 항-m⁶A 항체로 탐침하며, 화학발광으로 시각화합니다. ImageJ 그레이스케일 분석으로 정량화된 신호 강도는 상대적인 메틸화 풍부도를 반영하여 연구에 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

초록

N⁶-메틸아데노신(m⁶A)은 진핵생물 메신저 RNA(mRNA)에서 가장 풍부한 내부 변형이며, 전사 후 유전자 발현의 핵심 조절자 역할을 합니다. m⁶A 조사 방법은 전역 정량화, 뉴클레오타이드 특이적 검출, 특정 전사체 분석 등 여러 해상도 수준에서 적용될 수 있습니다. 이 중 닷 블롯 분석은 전역 m⁶A 변형 수준을 반정량적으로 평가하기 위한 간단하고 빠르며 비용 효율적인 접근법을 제공합니다. 이 분석법에서는 먼저 세포를 가공하여 총 RNA를 추출한 후 희석 및 변성시킵니다. RNA 샘플은 나일론 막에 점착된 후 항-m⁶A 항체로 탐침한 후 화학발광으로 시각화되며, 신호 강도는 메틸화의 상대적 풍부도를 나타냅니다. 마지막으로, ImageJ를 이용한 회색 값 측정을 통해 신호 강도의 정량화 및 비교가 수행됩니다. 시퀀싱이나 질량분석법 기반 방법과 비교할 때, dot blot은 최소한의 기기와 기술적 전문성으로 충분하여 일상적인 스크리닝, 예비 기능 연구, 비교 분석에 특히 적합합니다. 이 프로토콜은 기초 연구 및 중개 응용 모두에서 m⁶A 도트 블롯 분석을 구현하기 위한 상세하고 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

서론

N⁶-메틸아데노신(m⁶A)은 진핵생물 메신저 RNA(mRNA)에서 가장 널리 퍼진 내부 변형이며, RNA 안정성, 접합, 분해, 번역, 배출 등 전사 후 조절에 필수적인 역할을 합니다 ^1,2,3. m⁶A 변형의 조절 장애는 종양 시작, 진행, 전이 등 다양한 생리적·병리학적 과정과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다 ^4,5. 골육종에서는 세포주와 조직 모두에서 m⁶A 수치가 상승하는 것이 관찰되어 질병 생물학에서 비정상적인 RNA 메틸화의 역할을 시사합니다 ^6,7. 따라서 골육종 관련 전사체 및 조절 경로의 변화와 함께 전 세계 m⁶A 풍부도의 체계적 평가는 골육종에서 RNA 메틸화의 생물학적 기전과 임상적 함의를 명확히 하는 데 필수적입니다.

m⁶A 변형을 연구하기 위한 여러 분석 방법이 있습....