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방법 논문

글로벌 N6-메틸라데노신 RNA 변형 수준을 검출하기 위한 도트 블롯 분석

559 조회수

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DOI:

10.3791/69860

⸱

2026년 2월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 도트 블롯을 이용해 전반 m⁶A 수치를 반정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 총 RNA를 추출, 변성, 나일론 막에 점상화하고, 항-m⁶A 항체로 탐침하며, 화학발광으로 시각화합니다. ImageJ 그레이스케일 분석으로 정량화된 신호 강도는 상대적인 메틸화 풍부도를 반영하여 연구에 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

초록

N6-메틸아데노신(m⁶A)은 진핵생물 메신저 RNA(mRNA)에서 가장 풍부한 내부 변형이며, 전사 후 유전자 발현의 핵심 조절자 역할을 합니다. m⁶A 조사 방법은 전역 정량화, 뉴클레오타이드 특이적 검출, 특정 전사체 분석 등 여러 해상도 수준에서 적용될 수 있습니다. 이 중 닷 블롯 분석은 전역 m⁶A 변형 수준을 반정량적으로 평가하기 위한 간단하고 빠르며 비용 효율적인 접근법을 제공합니다. 이 분석법에서는 먼저 세포를 가공하여 총 RNA를 추출한 후 희석 및 변성시킵니다. RNA 샘플은 나일론 막에 점착된 후 항-m⁶A 항체로 탐침한 후 화학발광으로 시각화되며, 신호 강도는 메틸화의 상대적 풍부도를 나타냅니다. 마지막으로, ImageJ를 이용한 회색 값 측정을 통해 신호 강도의 정량화 및 비교가 수행됩니다. 시퀀싱이나 질량분석법 기반 방법과 비교할 때, dot blot은 최소한의 기기와 기술적 전문성으로 충분하여 일상적인 스크리닝, 예비 기능 연구, 비교 분석에 특히 적합합니다. 이 프로토콜은 기초 연구 및 중개 응용 모두에서 m⁶A 도트 블롯 분석을 구현하기 위한 상세하고 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

서론

N6-메틸아데노신(m⁶A)은 진핵생물 메신저 RNA(mRNA)에서 가장 널리 퍼진 내부 변형이며, RNA 안정성, 접합, 분해, 번역, 배출 등 전사 후 조절에 필수적인 역할을 합니다 1,2,3. m⁶A 변형의 조절 장애는 종양 시작, 진행, 전이 등 다양한 생리적·병리학적 과정과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다 4,5. 골육종에서는 세포주와 조직 모두에서 m⁶A 수치가 상승하는 것이 관찰되어 질병 생물학에서 비정상적인 RNA 메틸화의 역할을 시사합니다 6,7. 따라서 골육종 관련 전사체 및 조절 경로의 변화와 함께 전 세계 m⁶A 풍부도의 체계적 평가는 골육종에서 RNA 메틸화의 생물학적 기전과 임상적 함의를 명확히 하는 데 필수적입니다.

m⁶A 변형을 연구하기 위한 여러 분석 방법이 있습니다 8,9. 액체 크로마토그래피-질량분석법/질량분석법(LC-MS/MS)10과 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기반 분석법 11 모두 전 세계 m/A 수치 측정에 사용됩니다. 전자는 높은 감도를 제공하지만 전문 장비와 전문성이 필요하며, 후자는 상대적으로m 6A 수준을 제공하며 도트 블롯 분석보다 비용이 더 높습니다. MeRIP-qPCR은 특정 전사체의 표적 평가를 가능하게 하지만, 면역침전 효율에 크게 영향을 받습니다12. MeRIP-seq13, m⁶A-seq14, m⁶A-SAC-seq15는 시퀀싱 기반 접근법으로, m⁶A 메틸화 부위를 정밀하게 매핑할 수 있습니다; 하지만 비용이 많이 들고 광범위한 생물정보학 분석이 필요합니다.

m⁶A 점검 분석법은 RNA의 전 세계 m⁶A 변형 수준을 간단하고 빠르며 비용 효율적으로 측정할 수 있는 방법을 제공합니다. 반정량적 면역분석으로서, 특수 장비나 복잡한 생물정보학 분석 없이도 m⁶A 풍부도를 전반적으로 파악할 수 있다는 점이 주요 장점입니다. 이로 인해 m⁶A 점검표 분석법은 일상적인 스크리닝, 예비 기능 검증, 임상 연구에 유용한 도구가 될 뿐만 아니라, 고급 시퀀싱 및 질량분석법 기반 접근법의 실용적인 보완 수단이 됩니다. 현재 프로토콜은 상세한 단계별 워크플로우를 제공하여 재현 가능한 탐지와 광범위한 적용성을 보장합니다.

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프로토콜

참고: 프로토콜은 RNA 준비, 도트 블롯 분석, 정량 세 부분으로 구성되어 있습니다. 재료표는 필요한 재료를 요약하고, 보조 표 1은 시약 조성을, 그림 1 은 실험 워크플로우를 보여줍니다.

1. RNA 준비

  1. 세포 준비
    1. 안정적인 SNHG21 녹다운(shSNHG21), 음성 대조군(shCtrl), 3-디아자아데노신(3-DAA)으로 처리된 세포를 제거한다; [100 μM, 24시간]) 그리고 메클로페나믹산(MA; [100 μM, 24시간]) 37 °C 인큐베이터에서 나온 것입니다.
    2. 세포 합류율이 약 80-90%인지, 현미경으로 세포 상태가 양호한지 확인하세요.
    3. 배양지를 제거한 후 1mL PBS로 세포를 두 번 헹군습니다.
    4. PBS를 제거한 후 6cm 접시당 1mL의 트립신을 추가하세요.
    5. 트립신이 고르게 분포되도록 부드럽게 흔들고 1분간 배양하세요.
    6. 트립신을 제거한 후 10% FBS가 포함된 배지 1mL를 추가하여 소화를 종료합니다.
    7. 세포 현탁액을 여러 번 피펫으로 돌려 세포를 분산시키세요.
    8. 세포 현탁액을 1.5mL RNase 프리 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
      참고: 사용 전에 튜브에 라벨을 붙이세요. 1.1.3부터 1.1.8까지는 멸균 조건에서 수행되어야 합니다.
    9. 1000 × g에서 3분간 원심분리한 후 상환액을 완전히 제거하세요.
  2. RNA 추출
    참고: RNA 추출은 EZ-press RNA 정제 키트를 사용하여 수행됩니다.
    1. RNA 정제 키트에 포함된 600 μL 용해 버퍼를 펠릿에 넣고 완전히 소용돌이를 하여 세포를 완전히 용해한 후 5분간 방치합니다.
      참고: 약 2× 10개의6 세포가 RNA 분리에 사용됩니다.
    2. 100% 에탄올을 같은 부피로 넣고 완전히 소용돌이를 넣으세요.
    3. 혼합물 600 μL을 수집관으로 조립한 스핀 컬럼에 첨가합니다.
      참고: 사용 전에 스핀 컬럼과 수집관을 조립하고, 사용 전에 튜브에 라벨을 붙이세요.
    4. 12,000g에서 원심분리기를 × 1분간 사용한 후 액체를 수집관에 버립니다.
      참고: 컬럼 바닥과 액체 또는 조작자 간의 접촉을 피하세요.
    5. 위의 1.2.3-1.2.4 단계를 남은 혼합물에 대해 반복합니다.
    6. 각 회전 컬럼에 500 μL의 세척 버퍼(RNA 정제 키트에 포함된 것)를 추가하고, 실온에서 1분간 두세요.
    7. 12,000 g 에서 원심분리× 1분간 후 액체를 수집관에 버립니다.
    8. 빈 컬럼을 12,000 × g에서 다시 1 분간 원 심분리하여 잔여액을 제거합니다.
    9. 스핀 컬럼을 새로운 1.5mL RNase 프리 튜브로 옮기고, 뚜껑을 열고 2분간 자연 건조합니다.
      참고: 사용 전에 튜브에 라벨을 붙이세요.
    10. 스핀 컬럼 중앙에 25-50 μL의 용출 버퍼(효소가 없는 물)를 추가합니다.
    11. 실온에서 2분간 부화하세요.
    12. 12,000 × g 에서 원심분리기를 1분간 사용해 RNA를 용출합니다.
    13. 스핀 컬럼을 버리고 RNA를 얼음 위에 올려놓으세요.
      참고: 사용 전까지 RNA는 -80°C에 보관하세요.
  3. RNA 희석
    1. DS-11 분광광도계를 사용하여 143B shSNHG21 세포, 143B shCtrl 세포, 그리고 3-DAA 및 MA로 처리된 세포의 RNA 농도를 측정합니다.
    2. 각 세포주에서 총 RNA 1 μg을 준비합니다.
    3. 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리된 물로 RNA를 400 ng, 200 ng, 100 ng로 연속적으로 희석합니다.
      참고: 필요에 따라 농도 구배를 조정하세요.
  4. RNA 변성
    1. RNA 샘플을 95°C에서 3분간 가열하여 희석했습니다.
    2. 즉시 샘플을 얼음에 옮겨 식히세요.
      참고: 변성 RNA는 최대 1주일간 4°C에서 저장할 수 있습니다.

2. 도트 블롯

  1. RNA 스포팅
    1. 양전하를 띤 나일론 막을 원하는 크기로 잘라내세요.
    2. 기준선을 그려 멤브레인에 샘플 이름을 붙이세요.
    3. RNA를 부드러운 소용돌이 또는 피펫팅으로 완전히 혼합하세요.
    4. 각 RNA 샘플을 각각 1-2 μL씩 멤브레인의 지정된 위치에 포착합니다.
      참고: RNase 프리 피펫 팁은 항상 사용하세요. 피펫 팁과 막 사이의 직접 접촉은 피하세요. RNA가 막 위에서 자연스럽게 확산되도록 하세요. 각 샘플마다 새 피펫 팁을 사용하세요. 불규칙한 확산을 방지하기 위해 한 점당 2μL를 초과하지 마십시오.
  2. RNA 가교 연결
    1. 멤브레인을 3분간 자연 건조하세요.
    2. RNA 가교결합은 254nm, 120 mJ/cm² 크기의 UV 가교 서사료로 막을 조사하여 수행합니다.
      참고: 대체 방법으로 막을 37°C에서 30분간 배양하세요.
    3. 10mL 1x TBST 용액으로 막을 흔들기 플랫폼 위에서 5분간 세척하여 결합되지 않은 RNA를 제거합니다.
  3. 막 차단
    1. 5% BSA 용액을 준비하세요.
      참고: 사용 전에 이 용액을 신선하게 준비하세요.
    2. 막을 실온에서 차단액에 2시간 배큐하세요.
  4. 항체 배양
    1. 막을 항-m⁶A 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
      참고: 사용 전에 5% BSA 용액에 1:1000 항체를 희석하세요. 막을 흔들리는 플랫폼 위에 부드럽게 흔들며 부양하세요(50rpm).
    2. 10mL 1x TBST 용액으로 10분간 세척 막을 흔들기 플랫폼 위에서 세 번 세척하세요.
    3. 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합된 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 배양합니다.
      참고: 사용 전에 5% BSA 용액에 1:1000 항체를 희석하세요.
    4. 10mL 1x TBST 용액으로 10분간 세척 막을 흔들기 플랫폼 위에서 세 번 세척하세요.
  5. 화학발광 검출
    1. 화발광 HRP 기판을 막 위에 고르게 떨어뜨리며 바르세요.
      참고: 실온에서 1분간 기질과 함께 부드럽게 흔들며 막을 배양하세요.
    2. 화학발광 영상 시스템을 이용해 신호를 탐지합니다.
    3. 화학발광 영상 시스템의 자동 노출 기능을 초기 사전 스캔으로 사용하세요.
      참고: 가장 밝은 신호가 65% 미만일 때만 자동 시간을 허용합니다; 그렇지 않으면 노출을 절반으로 줄이고 피크 신호가 30-60% 이내로 떨어질 때까지 다시 획득하세요.
  6. 메틸렌 블루(MB) 염색
    1. 멤브레인을 MB 염색 용액에 1분간 배양하세요.
    2. 10mL 1x TBST 용액으로 멤브레인을 흔들기 플랫폼에서 5분간 세척한 후 촬영 조절 기준으로 촬영하세요.
      참고: 화학발광에 사용되는 동일한 막을 염색하세요. 염색 용액에 침전물을 방해하지 마세요. MB는 제거하기 어렵기 때문에 보호복과 마스크를 착용하세요.
    3. 영상 촬영 후 1% SDS가 포함된 용액을 사용해 흔들기 플랫폼 위에서 15분간 MB-블롯된 막을 제거하여 문서화 또는 재탐침을 용이하게 합니다.

3. 정량화

  1. 그레이스케일 가치 측정
    1. 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 가져오세요.
    2. 이미지를 8비트 형식으로 변환하려면 Image > Type > 8비트 포맷으로 변환합니다.
    3. 배경을 ' 과정 > 배경 빼기.
      참고: 반경: 50.0 픽셀, 배경 밝음 확인.
    4. Rectangle 도구를 사용해 분석 영역을 선택하세요.
    5. Analyze > Gels > 첫 번째 레인 선택으로 레인을 순차적으로 정의하세요.
    6. 플 롯 레인> Analyze > 겔을 사용해 강도 프로파일을 생성하고 피크를 측정하세요.
    7. 각각 m⁶A와 MB의 회색조 값을 측정합니다.
  2. 데이터를 분석을 위해 표에 복사하세요.
  3. 신호 세기를 비교하여 전 세계적인 m⁶A 변형 수준을 평가합니다.

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결과

dot blot 분석의 성능을 엄격히 검증하고 SNHG21이 전 세계 m6 A 수준을 조절하는 역할을 조사하기 위해, 143B 세포는 m6 A 메틸화를 억제하거나 증강하는 약리학적 교란을 받고, 양방향으로 m6 A 풍부도를 모니터링하였다.

글로벌 m6 A 풍부도의 도트 블롯 정량화
먼저 이 분석법이 m6 A 수위 감소를 감지할 수 있는지m6 A 메틸화를 억제하여 평가했습니다(그림 2). 그림 2A에 나타난 것처럼, 메틸트랜스퍼라제 억제제 3-DAA(100 μM, 24시간) 처리는 전역 m6 A 신호를 현저히 감소시켰습니다. SNHG21 단독 녹다운 시에도 기저선 m...

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토론

본 연구에서는 골육종 143B 세포에서 SNHG21의 노크다운이 m⁶A 신호 강도를 감소시켰으며, 유전자 변형이 RNA 메틸화에 미치는 영향을 평가하는 데 이 분석법의 가치를 입증하였습니다. 또한 이 분석법은 다음을 포함한 여러 응용 도구로 활용됩니다: 1) 기능적 연구 및 기전적 검증: 이 분석법은 세포 분화, 스트레스 반응, 종양 진행과 같은 특정 생물학적 과정과 전반적인 m⁶A 수치가 연관되어 있는지 신속한 예비 스크리닝에 사용할 수 있습니다16. 또한 m⁶A 조절자("작가, 지우기, 독자")의 기능적 역할을 평가하며, 이들의 조작이 전체 메틸화 풍부도에 측정 가능한 변화를 초래하는지 평가한다17,18. 2) 특정 RNA 집단 분석: 이 분석법은 mRNA, lncRNA, rRNA 등 정의된 RNA 하위 집합 내에서 m...

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공개 사항

저자들은 이해 충돌이 없다고 보고합니다.

감사의 글

이 연구는 국립자연과학재단(82174408, 82374477, 82474535)의 지원금으로 지원받았습니다. 그림 1은 BioRender.com 로 제작되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-디아자아데노신 (3-DAA)MCE하이-W013332A1mg
항-m6A 단일클론 항체단백질 기술68055-1-Ig50 & mu; L
소 혈청 알부민 (BSA, 분획 V)바이오프록스4240GR100 100g
케미닥 MP 이미징 시스템바이오 래드12003154
DMEM 고혈당거나무319-005-CL500 mL
DS-11 분광광도계데노빅스DS-11
EZ-press RNA 정제 키트EZB B0004DP100 프렙
FBS - 우수한 품질거나무086-150500 mL
HRP 결합 염소 항쥐 IgG (H+L)비요타임A02161 mL
Immobilon Western 화학발광 HRP 기질 밀리포어WBKLS05002 & times; 250 mL
메클로페남산(MA)MCEHY-1172751mg
메틸렌 블루 염색 용액솔라비오G13000.1%, 100 mL
나일론 전이 막랩셀렉트TM-NY-XS-457.4 & 배; 8.5 cm, 0.45 & mu; 10 PCS/가방
PBS 버퍼 (즉시 사용 가능한 건조 분말)바이오샤프BL601ApH: 7.2-7.4, 2리터/봉지
도데실 황산나트륨 (SDS)시그마L5750-500G500g
TBS 버퍼 프리믹스 파우더상곤그리고 nbsp; A510025-00011EA (243.9 g 화약)
트라이플LE 발현효소깁코12604-0211×, 500 mL
트윈-20상곤A600560-0500500 mL
UV 가교체UVPCL-1000

참고문헌

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