본 글은 단측 신장 IRI를 이용한 허혈성 CKD 모델을 제시하고, 샘플 채취 하루 전에는 반대쪽 신장 절제술을 시행합니다; 이 프로토콜은 혈청 기반 기능 평가, 높은 생존율, 그리고 28일과 42일간의 CKD 병리 재현 가능성을 가능하게 하여, 기전 및 중재적 연구를 위한 다재다능한 플랫폼을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신 페딕의 수술적 일과성 폐색은 신장 허혈-재관류 손상(IRI)을 유도하는데, 이는 급성 신장 손상(AKI)과 생쥐에서 만성 신장 질환(CKD)으로의 진행을 연구하는 데 널리 사용되는 모델입니다. 그러나 기존 프로토콜은 종종 혈청 기반 기능 평가를 배제하거나 높은 사망률을 초래합니다. 기존의 단측 및 양측 신장 IRI 모델은 재현성을 강조하지만, CKD 진행 연구에 적합한 일관된 손상 중증도와 장기 생존 기간 모두를 달성하는 데 여전히 도전 과제가 남아 있습니다. 여기서는 허혈성 AKI에서 CKD 전환의 견고하고 재현 가능한 모델을 제공하는 등쪽 접근법 프로토콜을 제시합니다. 배측 접근법은 신장에 쉽게 접근할 수 있게 하고 복부 내 조작을 최소화합니다. 저희는 혈액 및 조직 채취 하루 전부터 시행하는 반대쪽 신장 절제술과 단측 신장 IRI를 병행합니다. 이 접근법은 두 가지 주요 장점을 제공합니다: (1) 양측 손상과 관련된 불일치를 피하여 변동성을 최소화하고, (2) 신장 절제술을 일찍 시행해 높은 사망률과 달리 일관된 손상을 유지하면서 거의 100%의 생존율을 달성합니다. 기능적 평가는 혈청 BUN과 크레아티닌으로 수행되며, 간질성 섬유증은 신장 IRI 28일과 42일에 Masson의 삼색 기반 콜라겐 침착과 CKD 마커 유전자에 의해 정량화됩니다. 이 두 측정값은 기능 장애와 조직 병리학 발달에 대한 상호 보완적인 통찰을 제공합니다. 이 프로토콜은 마우스에서 기전적 연구를 위한 신뢰할 수 있고 다재다능한 허혈성 CKD 모델을 확립합니다.
서론
AKI는 입원 환자에서 흔한 합병증이며, 여전히 전 세계적으로 중요한 건강 문제로 남아 있습니다. 역학 연구에 따르면 AKI는 입원 환자의 최대 20%, 중증 환자의 30-60%에서 발생합니다 1,2. 일부 환자는 신장 기능을 회복하지만, 다른 환자들은 완전 회복이 이루어지지 않아 CKD3에 취약합니다. AKI에서 CKD로의 전환은 장기 결과의 주요 결정 요인으로 점점 더 인식되고 있으며, 기전 및 치료 연구의 초점이 되었습니다 4,5,6. 분자 기전을 연구하고 잠재적 치료법을 시험하기 위해서는 재현 가능한 동물 모델이 필수적입니다.
신 페디클(동맥과 정맥)의 외과적 일과성 폐쇄는 신장 IRI를 유도하며, 이는 쥐에서 AKI 연구를 위해 가장 널리 사용되는 모델 중 하나입니다. 이 수술은 급성 세뇨관 상피 손상과 염증 반응을 유발하여 만성 간질성 섬유증으로 진행될 수 있습니다 7,8. 그러나 기존의 신장 IRI 프로토콜은 여러 가지 도전 과제를 제시합니다. 단측 신장 IRI는 최소한의 사망률과 연관되어 있으며 장기 연구에 널리사용됩니다 9; 그러나 신장 기능 평가(예: 혈청 화학, 소변 분석, 사구체 여과율)는 현실적으로 불가능합니다. 양측 신장 IRI 또는 단측 신장 IRI와 동시 또는 조기 반대측 신장 절제술을 결합한 모델은 사망률 증가와 연관되어 만성 연구에서의 사용을 제한합니다. 최근 이 모델들의 견고한 변형이 연구되었지만, 만성 연구 환경에서의 적용은 신중한 고려가 필요합니다. 또한 일부 프로토콜에서는 복부 중앙선 복강 절개술을 사용하는데, 이는 복부 내 장기를 조작하여 신 추를 노출시켜야 합니다. 이로 인해 수술의 침습성과 기술적 복잡성이 증가할 수 있습니다. Skrypnyk 등은 일측 허혈 8일 후에 시행된 반대측 신장 절제술이 손상 후 신장 기능을 혈청학적 평가할 수 있게 하면서도 높은 생존율을 유지할 수 있다고 보고했다11. 이 프로토콜은 최대 42일간 AKI에서 CKD로의 진행을 평가하기 위해 최적화된 체계적인 절차 세트를 제공합니다.
본 연구는 일측 신장 IRI를 이용한 허혈성 AKI-CKD 모델을 입증하고, 신장 및 혈액 샘플 채취 하루 전 지연 반대편 신장 절제술을 시행합니다. 우리는 이전에 여러 논문12, 13, 14, 15에서 AKI 모델로 유사한 절차를 사용한 바 있습니다. 우리는 이 접근법을 확장하여 AKI-CKD로의 전환을 연구하는 데 성공했으며, 28일과 42일째에 CKD의 명확한 징후가 나타나는 현상입니다(도식용 그림 1). 이 방법은 우수한 생존율을 제공하며, 손상된 신장에서 매우 섬유화된 표현형을 유도하고, 채취된 혈액을 이용해 신장 기능을 평가할 수 있게 합니다. 따라서 이 접근법은 혈청학적 평가가 필요한 연구(단측 신장 IRI만 있는 것과 구별)와 생존율 향상(양측 신장 IRI 대비)에 특히 유용합니다. 신장에 직접 접근하기 위해 배측 측면 접근법이 사용되었습니다. 복측 정중 복강 절개술과 비교할 때, 이 접근법은 복부 내 조작을 최소화하고 신장 및 주변 층문 조직에만 수술적 조작을 제한하여 시술의 일관성을 향상시킵니다.
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프로토콜
이 연구에서 수행된 동물 실험은 피츠버그 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 제도의 지침에 따라 프로토콜 번호 23103811). 필요에 따라 가짜 수술 대조군을 포함할 수 있으며, 일반적으로 혈관 클램프나 반대쪽 신장 절제술 없이 외과적 노출을 받습니다. 사용된 도구와 장비에 대한 자세한 정보는 재료 섹션을 참조하세요. 바늘, 메스 칼날, 클립 등 날카로운 물품은 지정된 날카로운 용기에 폐기해야 합니다. 조직과 시신을 포함한 생물학적 폐기물은 기관의 생물학적 위험 폐기물 프로토콜에 따라 취급 및 처리되어야 합니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 동물 준비 및 외과 장비
- 모든 외과 기구를 사용하기 전에 오토클레이브하세요. 여러 동물에게 수술을 시행할 때는 수술 사이에 기구에서 혈액과 이물질을 제거한 후, 뜨거운 구슬 멸균기로 10-15초간 멸균합니다. 재사용 전에 기기를 식히세요.
- 물 순환 온열 패드를 설치하고 수술 부위 위에 적외선 램프를 설치하세요.
- 마우스를 마취 유도 챔버에 넣고 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 이소플루란(산소에 1.5%-2%, 분당 1-2 L)으로 마취를 유도합니다. 쥐가 의식을 잃은 것으로 보이면, 반사 신경 상실을 확인하기 위해 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 충분히 확인하세요.
- 마우스를 가열된 수술용 패드로 옮기고 코 콘 으로 마취를 유지하세요.
- 수술 후 진통을 위해 Ethiqa XR(서방형 부프레노르핀; 3.25 mg/kg, s.c.)을 투여합니다.
- 마우스를 수술용 패드 위에 엎드린 자세로 놓으세요. 움직임을 최소화하기 위해 필요하다면 사지를 테이프로 고정하세요.
- 절개 부위 주변의 등털을 클리퍼로 밀어주세요.
- 시술 중 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 눈에 바르세요.
- 직장 탐침을 삽입하고 테이프로 고정한 후 체온계에 연결해 지속적으로 모니터링하세요.
- 수술 부위를 10% 포비돈-요오딘과 70% 에탄올을 번갈아 사용해 소독한 후, 멸균 드레이프로 덮으세요.
2. 일측 신장 IRI
- 신장 부위를 가로지르는 중간 등 피부 절개(3-4cm)를 하세요.
- 조직 분리 가위를 사용해 피부를 피하층에서 분리하세요.
- 피부를 통해 촉진하여 신장 위치를 확인하세요.
- 신장이 시각되는 부위, 즉 척추 왼쪽에서 약 1cm 외측에 1-1.5cm 길이의 근육 절개를 합니다.
참고: 절개가 너무 길면 신장이 복강 안으로 미끄러져 들어가 이후 조작이 복잡해질 수 있습니다. 최소한의 피부 절개만으로도 신장이 외부에 노출된 상태로 유지될 수 있습니다. - 등쪽 절개를 통해 신장을 부드럽게 바깥쪽으로 노출하세요. 얇은 막이 접근을 막는다면 무딘 채로 해부하세요.
- 비톱니형 겸자로 신장을 안정시키면서, 상하 신낭 페디클 주변의 절벽 지방과 결합 조직을 직접적으로 해리하여 혈관 클램프를 삽입할 수 있는 '관'을 만듭니다.
- 허혈을 유발하기 전에 체온이 충분히 따뜻한지(36.8-37.2 °C) 확인하세요. 신장 동맥과 정맥을 한 묶음으로 가로질러 외상성 없는 혈관 클램프를 부착하세요.
참고: 혈관이 클램프의 입 중앙에 위치하고 일정한 압력으로 압축되도록 하세요. 클램프를 해문의 일정한 위치에 대세요. 클램프를 혈관 축에 수직으로 배치하세요. 이 클램프는 약 10가지 동물 시술에 재사용할 수 있습니다. - 피부를 당겨 신장을 덮어 최대한 체온에 가깝게 유지하세요.
- 허혈 시에는 히트펌프를 38-39°C(필요에 따라 조절)로 설정하고, 적외선 램프를 켜고 끄면 목표 체온을 유지할 수 있습니다(램프 거리를 필요에 따라 조절).
참고: 이 '샌드위치' 난방 시스템은 물 순환 가열 패드와 적외선 램프로 구성되어 36.8-37.2 °C라는 좁은 범위 내에서 체온을 효과적으로 유지합니다. 체온을 매분 기록하여 36.8-37.2 °C로 유지되도록 하세요. - 허혈 기간이 30분 지나면 클램프를 제거하고 신장을 면봉으로 복강에 다시 넣습니다.
참고: 신장 전체가 균일하게 창백해 보이는지 확인한 후 디스크램을 제거하세요. 클램프를 제거한 후 재관류 성공을 확인하세요. 재관류가 30초 이상 지연되는 경우, 이는 재관류가 불완전함을 나타낼 수 있으므로 이후 분석에서 동물을 제외하는 것이 중요합니다. 신장 IRI에 대한 감수성과 CKD의 심각도는 나이, 성별, 배경 긴장에 의해 유의미하게 영향을 받습니다. 최적의 허혈 지속 기간을 결정하기 위한 파일럿 실험을 수행하는 것은 각 연구 설계에 필수적입니다. - 근육층을 5-0 흡수성 봉합사로 봉합한 후 상처 클립(예: 9mm)으로 피부를 봉합하세요.
참고: 수술 후 10일 이내에 상처 클립을 제거하세요. - 이소플루란 마취를 중단하고, 쥐가 깨끗한 우리에서 회복할 수 있도록 하세요. 동물이 마취에서 회복되고 고통이나 저체온증 징후가 없다면, 우리를 동물 관리실로 돌려보내세요. 수술 후 동물의 통증이나 불편함을 모니터링하며, 필요에 따라 추가 용량의 에티카 XR이 투여됩니다. 인도적 종점은 동물의 고통을 최소화하기 위해 기관 IACUC 지침에 따라 설정됩니다.
참고: 에티카 XR은 최대 3일간 진통 효과를 제공합니다. 동물이 초기 투여 후 72시간 이내에 통증이나 불편함을 보이면 추가 투여하세요.
3. 반대쪽 신장 절제술
- 1단계인 동물 준비 단계를 따르세요.
- 2.1단계와 2.2단계에서 설명한 피부 절개를 수행합니다.
- 오른쪽 신장이 보이는 위치, 척추 오른쪽 측면 약 1cm 지점에 1-1.5cm 길이의 근육 절개를 합니다.
- 톱니가 없는 겸자로 신장을 잡은 상태에서 생생하게 박리하여 신궁 페디클을 노출시킵니다.
- 부신을 신장에서 조심스럽게 분리하여 부신은 온전하게 유지하고 혈관 손상을 방지하세요.
- 결찰 클립(클립 크기: 작음)과 4-0 실크 봉합사로 신 페디클을 연결한 후 신장 쪽 혈관을 절단합니다. 그 후 요관을 절단하고 신장을 제거하세요.
- 2.11단계에서 설명한 대로 절개를 닫으세요.
4. 혈액 및 신장 조직 채취
- 이소플루란(산소 내 1.5%-2%, 분당 1-2 L)으로 쥐에게 마취를 유도하고, 발가락 꼬집기로 마취 깊이를 확인하여 반사 상실을 확인합니다.
- 쥐를 누운 자세로 놓고 중간 절개를 한 뒤 횡격막을 제거합니다.
- 심장을 조심스럽게 노출시키고 3mL 주사기에 연결된 23G 바늘을 좌심실에 삽입하세요.
- 천천히 혈액을 채취하세요(600-1,000 μL).
- 용혈을 막기 위해 바늘을 제거하고 혈액을 채취관으로 옮기세요.
- 연구 요구사항에 따라 왼쪽 신장을 절제하고 칼날(손잡이에 부착된 칼날)로 절개합니다.
- 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 마취 하에 심장을 제거하는 안락사를 시행하세요.
- 연구 요구사항(예: 고정, 스냅 냉동)에 따라 절편 조직을 처리합니다.
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결과
수술 중 관찰된 신장 색의 특징적인 변화는 균일한 신장 허혈 유도와 성공적인 재관류를 확인시켜 주었습니다. 성공적인 허혈은 신장 색이 검은색에서 짙은 보라색으로 변하는 것으로 나타났으며, 혈관 클램프를 제거한 후 개선되어 재관류가 확인된다. 신장 허혈이 성공적으로 유도되지 않으면 신장은 미미한 색 변화만 나타나며, 이후 손상도 일관되지 않을 수 있습니다. 본 연구에서 FVB/NJ 수컷 쥐는 30분간 신장 허혈을 겪은 후 신장 손상을 유도하기 위한 재관류를 투여했습니다. 대표적인 결과는 그림 2에 제시되어 있습니다. 혈청은 캔자스 주 수의학 진단 연구소에서 신장 프로필을 위해 분석되었으며, 여기에는 혈중 요소 질소(BUN)와 크레아티닌 분석이 포함됩니다. 매슨의 삼색 염색된 신장 절편은 ImageJ에 의해 간질성 콜라겐 침착을 위해 영상 촬영 및 분석되었습니다. Acta2 와 Col1a1
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토론
이 프로토콜은 지속성 신기능 장애와 진행성 간질성 섬유증이 특징인 신장 IRI에 의한 신장 IRI 유도 모델을 제공하며, 이는CKD의 특징으로 널리 인정받고 있습니다. 단측 요관 폐색(UUO)은 널리 사용되는 CKD 모델로, 폐쇄성 신병증을 유발하고 주로 지속적인 관성 폐색을 통해 섬유화를 유발합니다18,19. 신장 허혈-재관류는 소혈 상피 손상과 내피/미세혈관 기능 장애를 결합하여 유도하는데, 이는 허혈성 AKI와CKD로의 진행 주요 메커니즘입니다. UUO는 지속적인 폐쇄성 모멸을 유발하는 반면, 우리의 허혈성 CKD 모델은 일시적입니다. ...
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감사의 글
이 작업은 NIDDK K01-DK133635의 지원을 받았습니다; UPMC VMI P3HVB 훈장; 사무엘 및 엠마 윈터스 재단상; UPMC CHP RAC 창업 보조금; UPMC CHP 재단 아동 신탁 보조금 지원자상; 조지 M. 오브라이언 신장 자원 연합 기회 풀 프로그램(OKRA OPP) (TC로 전환), NIDDK R01-DK121758; DK134346; R25-DK119180 (SSL으로), NIDDK R01-DK125015; R01-DK137410(JH에게), 그리고 캐롤린과 마크 스나이더, 그리고 스나이더 패밀리(JH와 SSL에게). 조직학 및 스캔 영상 지원을 제공해 준 UPMC CHP 조직학 핵심 연구소와 혈청 화학 지원을 제공해 준 캔자스 주립대학교 수의학 진단 연구소에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마취 가스 필터 | A.M. 빅포드 | F-에어 | |
| 마취 유도실 가열 | AIMS Lab 제품 | WCS8 | |
| 혈액 채취관 | BD 마이크로테이너 | 365967 | |
| 에탄올 | 디콘 랩스 | 2701 | |
| 에티카 XR (서방형 부프레노르핀) | 피델리스 동물 건강 | NDC 86084-100-30 | |
| 눈 연고 | 아콘 | NDC 17478-062-35 | |
| 거즈 패드, 멸균 및 nbsp; | 다이나렉스 | 3353 | |
| 작은 동물용 이발기 | 왈 | CLP-9868 | |
| 히트 램프, 적외선 | 물리적 악기 | HL-1 | |
| 따뜻한 물 순환을 위한 히트펌프 | 브레인트리 사이언티픽 | HTP-1500 | |
| 소동물용 열/마취 시스템, Versaflex | 브레인트리 사이언티픽 | EZ-7150 | |
| 열 유지 수술용 커튼 | 브레인트리 사이언티브 | SPDR-MPS | |
| 뜨거운 구슬 살균기 | 사이먼 켈러 | 스테리 250 | |
| 이소플루란 용액 | 코베트루스 | 29405 | |
| 결합 클립 적용자 | 웩 | 533140 | |
| 결찰 클립 | 웩 | 533837 | |
| 직장 온도를 위한 미세프로브 및 nbsp; | 물리적 성향 | RET-3 | |
| 마이크로프로브 온도계 | 물리적 성향 | 배트-12 | |
| 현미경, 광학 | 라이카 | DM2500 | |
| 현미경, 슬라이더 스캐너 | 라이카 | 아페리오 CS2 슬라이드 스캐너 | |
| 마우스 (FVB/뉴저지) | 잭슨 연구소 | 001800 | |
| 바늘 (23G) | BD | 305145 | |
| 포비돈 요오드 면봉 검사 및 nbsp; | 다이나렉스 | 1201 | |
| 메스 칼날 | 파인 사이언스 툴즈 | 10020-00 | |
| 메스 손잡이 | 파인 사이언스 툴즈 | 10060-13 | |
| 수술용 겸자, 톱니가 없는 형태 | 로보즈 외과 기기 | RS-5228 | |
| 수술용 겸자, 톱니 모양 | 파인 사이언스 툴즈 | 11051-10 | |
| 수술용 겸자, 이빨 달린 것 | 파인 사이언스 툴즈 | 11019-12 | |
| 수술용 장갑 | CTI | SPGF750 | |
| 외과용 조직 분리 가위 | 파인 사이언스 툴즈 | 14072-10 | |
| 봉합선, 폴리글리콜산(PGA)/흡수성 (5-0) | 다이나렉스 | 9131 | |
| 봉합, 실크 (4-0) | 오아시스 | MV-683-V | |
| 주사기 (3ml) | BD | 309628 | |
| 수건 드레이프, 멸균 및 nbsp; | 다이나렉스 | 4410 | |
| 겸자를 부착하는 혈관 클램프 | 파인 사이언스 툴즈 | 15057-14 | |
| 혈관 클램프, 외상성 없음; | 파인 사이언스 툴 | 18055-03 | |
| 상처 클립 부착기 | 파인 사이언스 툴즈 | 12020-09 | |
| 상처 클립 | 파인 사이언스 툴즈 | 12022-09 |
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