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방법 논문

골육종 세포에서 특정 RNA의 m6A 변형 수준을 검출하기 위한 MeRIP-qPCR 분석법

861 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

2025년 12월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 MeRIP-qPCR을 사용하여 특정 RNA의m6A 변형 수준을 상세히 평가하는 접근법을 제공합니다.

초록

RNA 에피트립체체 변형은 다양한 암의 발생과 발달에 중요한 역할을 하며, 그중N-6-메틸아데노신(m6A)이 가장 널리 퍼지고 기능적으로 다양한 변형입니다. 여기서는 MeRIP-qPCR을 사용하여 골육종 세포에서 특정 전사체의 m6A 변형 수준을 평가하는 간소화되고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석에서 총 RNA를 추출한 후, m6A 변형 면역포획 RNA에 대한 특이적 항-m 6A 항체로 인큐베이션되었습니다. 그 후 RNA를 분해하여 단백질 G 자기 구슬을 이용해 m6개의 A-변형 RNA 조각을 풍부하게 만들었습니다. 강화된 RNA는 단백질나제 K를 통해 방출되고 RNA 결합 구슬에 의해 정제되었습니다. 마지막으로, RNA는 후보 유전자의 m6A 수준을 평가하기 위해 역전사와 정량적 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였습니다. 결과는 이 방법이 메틸화 차이를 효과적으로 구별하며, 골육종 세포에서 m6A 변형의 기능적 기전을 탐구하는 신뢰할 수 있는 도구를 제공함을 입증했습니다. 결론적으로, MeRIP-qPCR은 골육종 세포에서 m6A 변형을 연구하는 간단하고 매우 특이적인 접근법을 제공합니다. 이 프로토콜은 m6A 조절 네트워크를 밝히고 새로운 치료 표적을 규명하는 데 큰 잠재력을 지니고 있습니다.

서론

최신 후속전사체 연구에 따르면, 아데노신 위의N-6 위치의 RNA N-6-메틸아데노신(m6A) 변형이 진핵세포에서 mRNA의 가장 풍부한 내재적 화학적 변형임이 밝혀졌습니다1. m6A는 mRNA 안정성, 스플라이싱, 핵 배출, 번역 효율등 다양한 생물학적 과정에 관여합니다. 중요하게도, 축적된 증거는 m6A 변형의 조절 장애가 주로 청소년과 청년층에 영향을 미치는 매우 공격적인 악성 골종양인 골육종을 포함한 다양한 암의 발생과 발병에 기여한다는 점을 시사합니다.

m6A 변형 연구는 견고하고 신뢰할 수 있는 방법론을 필요로 합니다. m6A 변형 수준을 감지하기 위해m6A 도트 블롯, m6A ELISA, MeRIP-seq 등 여러 접근법이 개발되었습니다. m6A 점적 얼룩 분석법은 간단하고 비용 효율적이지만, 민감도가 제한적이고 정량이 부족합니다. 이는 특정 RNA4의 m6A 변형 수준이 아닌 총 RNA의 m6A 변형 수준을 제공합니다. m6A ELISA는 비교적 편리하고 높은 처리량의 검출을 제공합니다; 그러나 교차 반응성과 낮은 정확도는 여전히 주요 우려이며, 전사체 또는 부위 특이적 변형을 드러내는 능력도 부족합니다. MeRIP-seq는 m6A의 전사체 전역 매핑을 가능하게 합니다; 그러나 대량의 RNA 입력, 상대적으로 낮은 해상도, 항체 의존성 때문에 MeRIP-seq의 정밀도와 재현성이 제한됩니다. 반면, MeRIP-qPCR은 면역침전과 정량적 PCR을 결합하여 특정 RNA7에서 m6A를 표적으로 검출할 때 더 높은 민도와 특이도를 제공합니다. 이 방법은 후보 유전자에서 차이 있는 m6A 농축을 민감하고 표적화하여 검출할 수 있게 하여, m6A 관련 암 연구의 검증 연구에 특히 적합합니다. 이 방법은 m6A 매개 조절 메커니즘을 연구하려는 실험실에 비용 효율적이고 접근성 있는 대안을 제공합니다.

여기서는 MeRIP-qPCR을 예시로 사용하여 골육종 세포에서 c-Myc의m6A 변형 수준을 평가하는 상세한 프로토콜(그림 1)을 제공했습니다. MeRIP-qPCR은 항체 기반 메틸화 RNA 조각 농축과 역전사 및 정량적 PCR을 결합하여 특정 RNA에서 m6A의 존재 및 상대적 풍부도를 평가합니다. 이 접근법이 c-Myc의 메틸화 차이를 효과적으로 구별하고, 골육종 세포에서m6A의 기능적 역할을 연구하는 신뢰할 수 있는 기반임을 입증했습니다. 본 연구는 골육종에서m6A 변형 연구를 위한 실용적이고 특이적인 도구로서 MeRIP-qPCR의 잠재력을 강조하며, 새로운 치료 표적 규명을 위한 기반을 마련합니다.

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프로토콜

1. RNA 준비

참고: RNA 추출은 RNA 추출 키트를 사용하여 수행됩니다. 세포와 RNA 시약을 다룰 때는 깨끗한 생물안전 캐비닛 안에서 작업하세요. 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 보호 안경)를 착용하세요. 원심분리기를 4°C까지 미리 냉각한 후 시작하세요.

  1. 감방을 준비해.
    1. 3.5cm 접시에서 배양지를 제거하고 미리 냉각된 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. 적절한 양의 RNA 용해 버퍼를 접시에 직접 넣어 세포를 완전히 용해한 후 부드럽게 피펫으로 균질 처리하세요.
    2. 세포 현탁액을 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮기세요.
    3. 원심분리기는 1000 × g에서 4 °C에서 5분간 사용 했습니다.
      참고: 로터가 균형을 이루고 뚜껑이 단단히 닫혀 있는지 확인하세요.
    4. 원심분리 후 조심스럽게 마이크로 원심분리기 튜브를 분리하세요.
    5. 1 mL 피펫으로 상청액을 완전히 흡인하여 펠릿 바닥을 방해하지 마세요.
      참고: 피펫 팁으로 셀 펠릿을 만지지 마십시오.
  2. 용해세포.
    1. 세포 펠릿에 300 μL 용해 버퍼를 추가합니다.
    2. 튜브를 30번 뒤집어 혼합하여 용액이 투명하고 점성이 있으며 눈에 띄는 덩어리가 없도록 하세요.
    3. 튜브를 실온에서 2분간 부화하세요.
  3. 침전하는 RNA.
    1. 용해액에 100% 에탄올 300μL(용해 완충제와 같은 부피)를 첨가합니다.
    2. 즉시 피펫을 위아래로 부드럽게 움직여 완전히 섞으세요.
  4. RNA 컬럼 결합을 수행하세요.
    1. 제공된 2mL 수집관에 RNA 정제 컬럼을 넣습니다.
    2. 전체 혼합물을 정제 컬럼으로 옮기세요.
      참고: 중앙의 흰색 막을 만지지 마세요.
    3. 캡을 닫고 원심분리기를 12,000 × g 에서 1분간 유지하세요.
    4. 하부 액체를 버리고 수집관을 흡수지에 거꾸로 두드려 잔여액을 제거하세요.
    5. 정제 컬럼을 수집관으로 돌려보내세요.
  5. 불순물을 씻어내세요.
    1. 정제 컬럼에 500 μL 워시 버퍼(뉴클레아제 무첨가 물)를 추가합니다.
      참고: 중앙의 흰색 막을 만지지 마세요.
    2. 12,000g에서 원심분리기를 × 1분간 가열한 후 낮은 액체를 버립니다.
    3. 12,000 × g에서 다시 원심분리기를 1분간 사용해 잔류 액체를 제거합니다.
    4. 정제 컬럼을 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
    5. 뚜껑을 열고 실온에서 2분간 컬럼을 두세요.
  6. RNA를 유출하세요.
    1. 정제 컬럼을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 넣습니다.
    2. 막 중심에 25 μL 용출 버퍼를 직접 첨가합니다.
    3. 실온에서 5분간 배양하세요.
    4. 12,000 × g에서 원심분리기를 1분간 사용해 하부 튜브에서 RNA를 채취합니다.
    5. 유루액트를 멤브레인에 다시 적용한 후 12,000 × g에서 원심분리기를 1분간 사용해 수율을 극대화합니다.
      참고: 항상 컬럼 멤브레인 중앙에 용출 버퍼를 직접 추가하세요. 측면 벽에 첨가하는 것은 RNA가 용해되는 것을 막고 수율을 크게 줄일 수 있으므로 피하세요. 또한, 피펫 팁으로 막을 뚫지 마세요.
  7. RNA 농도를 측정하세요.
    1. 분광광도계 샘플 포트를 1.5 μL 용출 버퍼로 헹구세요.
    2. 블랭크로 1.5 μL 용출 버퍼를 사용하세요. 측정값이 거의 0인지 확인해 주세요.
    3. RNA 샘플 1.5 μL을 채취하고 농도를 측정합니다.
    4. 분광광도계(A260/A280 = 1.8-2.2, A260/A230 = 2.0-2.5)와 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 RNA 샘플의 품질을 평가합니다.

2. 메틸화 RNA 면역침전(MeRIP)

  1. 면역포획 혼합물 제조
    1. 새로운 0.2mL PCR 튜브를 구하세요.
    2. 표 1에 나열된 성분을 추가하세요(한 반응 예시).
  2. 면역포획
    1. 튜브 뚜껑을 단단히 닫으세요. PCR 튜브를 회전 또는 롤링 셰이커에 올려놓으세요.
    2. 실온에서 90분간 부양하세요.
      참고: 용액을 연속적이고 부드럽게 섞어야 합니다.
  3. RNA 절단
    1. 배양 후에는 각 튜브에 핵소화 증강제(NDE) 10 μL과 절단 효소 혼합물(CEM) 2 μL을 첨가합니다.
    2. 피펫팅으로 5번에서 6번 부드럽게 섞으세요.
    3. 실온에서 4분간 배양하세요.
    4. 입력 RNA 제어 조제
      1. 면역침전(IP)과 입력 샘플 간의 일관성을 보장하기 위해 RNA의 일부를 병렬로 처리하여 입력 대조군으로 사용합니다.
      2. 각 샘플에서 총 RNA 1μg(10% 입력)을 별도의 PCR 튜브로 옮깁니다. 면역포획 완충제(ICB) 20 μL, 임사형 방출 에너지 1.5 μL, CEM 1 μL을 추가한 후 실온에서 2분간 배양합니다.
  4. 자기 농축 및 세척
    1. PCR 튜브를 자석 스탠드 위에 올려놓으세요.
    2. 튜브를 2분간 두고, 용액이 투명해지고 구슬이 튜브 벽에 고정될 때까지 두세요.
    3. 구슬을 건드리지 않고 조심스럽게 흡입하고 버리세요.
    4. 튜브를 자석 스탠드 위에 두고 150 μL 워시 버퍼(WB)를 추가하세요.
    5. 튜브를 자석 스탠드에서 분리하고 부드럽게 거꾸로 기울여 비즈를 완전히 다시 고정하세요.
    6. 튜브를 자석 스탠드로 다시 연결하세요. 용액이 완전히 사라질 때까지 1-2분을 기다린 후 상원액을 버리세요.
    7. 세척 과정을 세 번 반복하세요.
    8. 같은 방법으로 150 μL 단백질 소화 버퍼(PDB)로 구슬을 다시 세척합니다.
  5. 농축된 RNA의 방출 및 회수
    1. 단백질 소화 작업용액을 단백질 분해 K와 PDB를 1:9 비율로 혼합하여 준비합니다. (각 반응마다 20 μL을 준비합니다: 단백질효소 K 2 μL + PDB 18 μL 양).
    2. 최종 세척 후에는 튜브를 자석 스탠드에서 분리하세요.
    3. 비드 펠릿에 신선하게 준비한 단백질 소화 작업액 20 μL를 넣고 부드럽게 섞으세요.
    4. PCR 튜브를 열순환기에 넣고 55°C에서 15분간 배양합니다.
    5. PCR 튜브를 다시 자석 스탠드 위에 올려놓으세요. 용액이 완전히 빠질 때까지 기다려야 해요(약 2분).
    6. 전체 상원액(약 20 μL)을 조심스럽게 새로운 0.2 mL PCR 튜브로 옮깁니다.
      참고: RNA는 이제 상청액에 있습니다. 구슬은 버려.
  6. RNA 정제
    1. 각 샘플 튜브, 음의 대조관, 입력 튜브에 20 μL RNA 정제액(RPS)을 추가합니다.
    2. 160 μL 100% 에탄올을 추가하세요.
    3. 보텍스 RNA 결합 비즈로 재현지시킵니다.
    4. 각 튜브에 2μL의 재현탁 RNA 결합 비즈를 추가합니다.
    5. 최소 10번 이상 위아래로 충분히 섞으세요.
    6. RNA가 결합할 수 있도록 실온에서 5분간 배양하세요.
    7. 튜브를 자석 스탠드 위에 올려놓으세요. 용액이 완전히 빠질 때까지 기다려야 해요(약 2분).
    8. 상정액은 구슬을 건드리지 않고 조심스럽게 버리세요.
    9. 튜브를 자석 스탠드 위에 올려놓고 갓 준비한 90% 에탄올 150μL를 추가하세요. 30초간 부화하세요.
    10. 90% 에탄올은 버리세요. 90% 에탄올 세척을 한 번 더 반복하세요(총 두 번 세척).
    11. 튜브를 자석 스탠드에서 분리하세요.
    12. 건조된 구슬에 13 μL 용출 버퍼를 첨가합니다.
    13. RNA를 용출하기 위해 실온에서 5분간 배양하세요.
    14. 튜브를 다시 자석 받침대에 올려놓으세요. 용액이 완전히 빠질 때까지 기다려야 해요(약 2분).
    15. 전체 상원액(약 13 μL)을 새로운 RNase 없는 PCR 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
    16. 즉시 사용하거나 RNA를 -20°C에 보관하세요.

3. RT-qPCR

  1. m6A-비축 RNA를 역전사하여 cDNA로 전환합니다
    1. 역전사를 위해 m6A-IP, Input, 또는 IgG 그룹에서 정제된 RNA를 사용한다.
    2. 역전사(RT) 반응을 설정하세요.
      참고: 후속 qPCR 분석에서 신뢰할 수 있는 비교를 위해 모든 그룹에 동일한 RNA 입력을 보장해야 합니다.
  2. qPCR 증폭
    1. SYBR Green 화학을 사용하여 qPCR 반응을 준비합니다. 각 튜브에 SYBR 그린 마스터 믹스 10 μL (2×), 순방향 프라이머 0.5 μL (10 μM), 역프라이머 0.5 μL (10 μM), ddH2O 7 μL , cDNA 2 μL 를 각 튜브에 추가하고, 충분히 혼합한 후 잠시 원심분리한 후 qPCR 기기에 로딩합니다.
      참고: 각 cDNA 샘플마다 3개의 복제 웰(입력, IgG, m6A-IP)을 설정하세요. 프라이머 목록은 표 2 를 참조하세요.
    2. qPCR 프로그램을 실행하세요.
      1. 다음 프로그램을 사용하여 실시간 열 사이클러에서 qPCR 반응을 수행하세요: 초기 변성을 95 °C에서 30초 동안 설정; 95 °C에서 변성(15초), 58 °C에서 어닐링(10초), 72 °C에서 30초간 신장 등 40회 사이클을 수행합니다.
      2. 증폭 후에는 변성을 95°C에서 15초간 설정하고, 60°C에서 1분간 냉각한 후, 0.5°C/s의 램프 속도로 점차 온도를 95°C까지 올리며 연속 형광 획득을 통해 증폭된 생성물의 특이성을 확인합니다.
  3. 데이터 분석
    1. 목표군과 대조군의 Ct 값을 분석하세요.
    2. 농축 계산은 다음 방법 중 하나를 사용하세요:
      1. 방법 1: % 입력법
        %입력 = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100%
        참고: Ct(Input)와 Ct(IP)는 각각 Input 샘플과 IP 샘플의 사이클 임계값을 나타내며, 희석 계수(DF)는 qPCR에 사용되는 입력 비율의 역수입니다(예: 전체 RNA의 10%를 입력으로 사용했다면 DF = 10).
      2. 방법 2: 비교 Ct법(2^-ΔΔCt 방법)
        ΔCt샘플=CtIP−CtIgG
        Ct=ΔCt치료-ΔCt대조군, Fold=2−ΔΔCt.
        참고: 모든 샘플에서 RNA 입력량, 반응 설정, 프라이머 효율을 일관되게 유지하세요.

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결과

여기서는 MeRIP-qPCR 분석의 대표적인 결과인 hFOB1.19 및 143B 세포에서 c-Myc의 m6A 변형 수준을 제공합니다. 그림 2에서 보듯, 항-m6A 항체에 의한 c-Myc 농축은 배경 수치만 보인 IgG 대조군에 비해 유의미하게 높았으며, 이는 항-m6A 항체가 효과적이고 특이적임을 시사합니다. 또한 c-Myc의m6A 변형 수준이 hFOB1.19 세포보다 143B에서 유의하게 높았음을 관찰했습니다(P < 0.001). 이 발견은 c-Myc가 골육종 세포에서 더 많은 m6A 변형을 겪으며, 이는 종양 발생 및 발달에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 따라서 m6변형은 c-Myc의 안정성 또는 번역 효율을 조절하여 골육종 세포에서 악성 표현형 유지에 기여할 수 있습...

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토론

MeRIP-qPCR은 RNA m6A 변형을 연구하는 데 유용한 도구로 부상했으며, 광범위한 응용 분야가 있습니다. 특히 고처리량 시퀀싱 결과를 검증하고, 기전 연구 중 표적 유전자의 특정 영역 내에서 변형 부위를 정확히 위치시키는 데 유용합니다. 더불어, 이 방법은 비교적 저렴한 비용과 조작 간편성 덕분에 대부분의 분자생물학 실험실에서 쉽게 구현할 수 있어, 에피트랜스크립트 연구에 효율적이고 실용적인 접근법입니다8.

성공을 보장하기 위해 이 방법은 여러 중요한 단계에 의존합니다. 첫째, RNA의 완전성과 품질이 매우 중요합니다. 분해된 RNA는 신뢰할 수 없는 결과를 초래할 수 있기 때문입니다. 둘째, 비특이적 결합으로 인한 바이어스를 제거하기 위해 입력 대조군과 IgG 대조군 모두의 포함이 중요하다. 셋째, 항체 선택이 핵심입니다; 높은 친화도와 고특이도를...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 국립자연과학재단(82174408, 82374477, 82474535, 82205145)의 지원금을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100% 에탄올상하이 타이탄 과학 주식회사, 미국1158566
143BATCC, 미국ATCC CRL-8303TM
2× SYBR 그린 qPCR 믹스베이징 치헝싱 바이오테크놀로지 유한회사, 중국FS-Q1002
데노빅스 DS-11 데노빅스DS-11 분광광도계
DMEM 매체와이센트 코퍼레이션, 중국319-005-CL
DMEM/F-12 중형깁코, 미국11320033
에피퀵 컷& RUN m6A RNA 풍부화 (MeRIP) 키트에피젠텍, 미국P-9018-24
태아 소 혈청와이센트 코퍼레이션, 중국086-150
hFOB1.19중국 과학원 셀뱅크GNHu14
m6A RNA 메틸화 분석 키트애브캠, 영국AB185912
마이크로RNA 역전사 키트EZBioscience-EZB, 미국A0010CGQ
실시간 시스템바이오-래드, 미국CFX96
토털 RNA 추출 키트EZBioscience-EZB, 미국B0004DP
트라이플LE 발현효소깁코, 미국12604021

참고문헌

  1. Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
  2. Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
  3. Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
  4. Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
  6. McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
  7. Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  8. Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
  9. Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
  10. Law, J., Günther, S., Watanabe, S. Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells. Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).
  11. Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
  12. Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
  13. Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

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