방법 논문

조직 공학 응용을 위한 인간 피부 세포 내 터널링 나노튜브 탐지의 표준화 방법

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DOI:

10.3791/69883

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2026년 1월 13일

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1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

이 논문에서

요약

여기서는 막 및 F-액틴 표지와 z-스택 공초점 영상을 사용하여 인간 표피 각질세포와 진피 섬유아세포 사이의 터널링 나노튜브를 시각화하는 표준화된 프로토콜을 제시하며, 선택적으로 α-튜불린 공동 염색을 통해 조직공학 응용을 위한 재현 가능한 검출과 세포골격 특성 분석을 가능하게 합니다.

초록

터널링 나노튜브(TNT)는 소기관과 신호 전달 화물의 장거리 이동을 가능하게 하는 얇고 액틴 기반의 세포 간 통로입니다. 여러 세포 유형에서 널리 보고되었지만, 인간 피부 세포 내 존재는 명확히 기술되지 않았습니다. 이 글은 인간 표피 각질세포와 피부 섬유아세포 사이의 시험 관 내에서 TNT를 검출하고 특성화하는 표준화된 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 1차 세포의 공동 배양 준비, 연약한 TNT 보존을 위한 부드러운 고정, 밀 배아 응집분체로 막 표지, 팔로이딘으로 F-액틴 염색, 그리고 기질 위에 떠달린 TNT와 부착된 필로족을 구분하기 위해 반전 공초점 현미경을 이용한 체계적인 z-스택 영상 분석을 포함합니다. 선택적으로 α-튜불린에 대한 면역염색을 통해 미세소관 도입 평가가 가능합니다. TNT는 세 가지 특징으로 정의됩니다: 두 개 이상의 세포를 연결하는 얇고 직선인 돌출부, F-액틴의 존재, 그리고 직렬 광학 단면에서 세포 쌍 간의 연속성. 대표적인 결과는 TNT가 피부-피부, 표피-표피, 피부-표피 쌍을 연결하며, 세포골격 조성은 다양하게 나타납니다(F-액틴 단독 또는 F-액틴과 α-튜불린). 중요한 단계로는 부드러운 고정, 신선한 시약 사용, 그리고 오분류를 방지하기 위한 충분한 z-평면 확보가 있으며, 일반적인 인공물로는 TNT 파손과 불완전한 염색이 있습니다. 이러한 최적화된 단계들이 결합되어 피부 세포 시스템에서 TNT 재현 가능성을 높이고, 피부 생물학과 재생에서 TNT 매개 소통의 미래 연구를 위한 방법론적 기반을 제공합니다.

서론

터널링 나노튜브(TNT)는 소기관과 신호 분자의 직접 세포 간 전달을 가능하게 하는 나노 규모의 액틴 기반 채널입니다. 이들은 일반적으로 길이 6-100 μm, 직경 50-500 nm이며, 일부는 최대 700nm 두께에 이릅니다. 빈 막 돌출부와 달리, TNT는 구조적 강성을 제공하고 미토콘드리아 수송을 지원하는 세포골격 필라멘트인 F-액틴을 포함하고 있습니다. 2차원 배양에서 TNT는 세 가지 특징으로 정의됩니다: 두 개 이상의 세포를 연결하는 얇은(20-700 nm) 직선 돌출부; F-액틴 필라멘트의 존재; 화물 이송 능력도 갖추고 있습니다.

Rustom 등에 의해 PC-12 세포에서 처음 발견된 이후, TNT는 심혈관6, 면역7, 호흡8 시스템, 각막 상피9, 종양10, 신경계11,12 등 여러 시스템에서 연구되어 왔습니다. 이들은 면역 신호 전달, 세포자멸사, 물질 수송, 혈관신생과 같은 생리적·병리학적 과정에 기여합니다 13,14,15. TNT는 미토콘드리아, 소포체, 핵산, 이온, 심지어 바이러스 등 다양한 화물의 장거리 이동을 매개할 수 있습니다 5,16,17.

피부는 구조적으로 복잡한 기관으로, 표피와 진피가 항상성, 상처 치유, 부속지 재생을 위해 끊임없는 소통에 의존합니다 18,19,20. TNT는 면역계, 신경계, 각막 상피등 여러 조직에서 기술되었지만, 출판된 문헌에서는 인간 피부 세포 내 존재가 보고되지 않았습니다. Sáenz-de-Santa-María 등이 설명한 방법론적 틀을 바탕으로, 우리는 면역형광 염색과 역초점 현미경을 결합하여 표피 각질세포와 피부 섬유아세포 사이의 TNT를 검출하기 위한 표준화되고 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

다른 TNT 검출 접근법과 비교할 때, 이 프로토콜은 민감도와 접근성 사이에서 실용적인 균형을 제공합니다. 라이브 셀 이미징은 TNT의 역학을 포착할 수 있으나, 광독성과 TNT의 수명이 짧다는 점에 제한이 있습니다 1,23. 전자현미경은 초구조적 세부 정보를 제공하지만, 긴 TNT 스팬을 보존하지 못하고 1차 피부 세포의 일상적인 분석에는 실용적이지 않습니다24,25. 리포터 기반 나노튜브 시스템은 실시간 추적을 가능하게 하지만, 유전적 조작이 필요하며, 이는 일반적으로 1차 각질세포와 섬유아세포에서 비효율적입니다24,26. 반면, 본 프로토콜은 표준 면역형광 및 공초점 현미경을 사용하여 독립적으로 준비된 피부 세포 배양에서 TNT 재현 가능성을 높이면서도 연약한 1차 세포와의 호환성을 유지할 수 있습니다.

이 방법은 세포골격 조성과 TNT 유병률이 중요한 고정 샘플 분석에 특히 적합합니다. TNT는 매우 취약하기 때문에 고정 및 취급 단계가 주요 한계로 남아 있으며, 실시간 TNT 역학을 포착할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 1차 인간 피부 세포를 다루는 실험실에서는 이 표준화된 워크플로우가 TNT를 시각화할 수 있는 접근성 있고 일관된 방법을 제공하며, 조직 공학과 재생에서 TNT의 잠재적 기능에 대한 후속 연구를 지원합니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 모든 피부 세포는 이전에 인간 피부 조직에서 분리된 냉동 1차 세포로, 포경수술 후 버려진 포피 샘플로 얻었으며, 완전히 식별 해제되었습니다22. 인간 피부 샘플 채취는 닝보대학교 산하 인민병원 비뇨기과에서 이루어졌으며, 연구 프로토콜은 기관 윤리 위원회(프로토콜 번호 2024104; 승인일: 2024년 10월 30일)에서 승인되었습니다.

1. 인간 1차 피부 표피 각화세포 및 피부 섬유아세포 내 TNT 식별

  1. 용액 준비
    1. 고정액 1(200 μL)을 4% PFA(100 μL), 2.5% 글루타알데히드(4 μL), 1 M HEPES(40 μL), 1x PBS(56 μL)를 첨가하여 준비합니다. 신선하게 준비하고 37°C까지 미리 데워 사용 전에 사용하세요.
    2. 고정액 2(200 μL)를 8% PFA(100 μL), 1 M HEPES (0.4 μL), 1x PBS(99.6 μL)를 첨가하여 준비합니다. 신선하게 준비하고 37°C까지 미리 데워 사용 전에 사용하세요.
    3. 고정액 3(200 μL)을 8% PFA(100 μL), 2.5% 글루타알데히드(4 μL), 1x PBS(96 μL)를 첨가하여 준비합니다. 신선하게 준비하고 37°C까지 미리 데워 사용 전에 사용하세요.
  2. 세포 배양
    1. 적절한 배지를 사용해 60mm 접시에서 인간 표피 각질세포와 피부 섬유아세포를 해동 및 배양합니다. 소생 시 각화성 배양에 최종 농도 5 μM의 Y-27632를 보충합니다. 세포가 ~80% 융합률에 도달할 때까지 가습 인큐베이터에서 배양물을 37°C에서 유지하세요.
    2. 배지를 제거하고 1mL 1x PBS로 세포를 잠시 세척하세요(세척 시 생리적 pH와 삼투압 유지에 사용됩니다). PBS를 흡입하세요.
    3. 0.05% 트립신-EDTA 1mL를 첨가하고 고르게 분포한 후 37°C에서 1.5-2.5분간 배양합니다.
    4. 피펫팅으로 세포를 부드럽게 재현탁하세요. 배지 2mL를 추가하고 15mL 튜브로 옮긴 후 200 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다.
    5. 상정액을 버리고 펠릿을 1-2mL 배지에 다시 부탁합니다. 자동 계수기를 사용해 셀을 세세요.
    6. 최종 부피 400 μL에 8웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 12,000개의 진피 섬유아세포 또는 20,000개의 각질세포를 시딩합니다. 씨앗을 뿌린 후에는 방을 교차 흔들어 세포가 고르게 분포되도록 하세요. 37°C에서 ~24시간 배큐하세요.
    7. 약 24시간 정도 잠복 후 현미경으로 세포 합류를 관찰합니다. ~80%에 도달하면 다음 고정 단계로 진행하세요.
  3. 고정
    1. 배양액이 ~80% 합류에 도달하면, 고정액 1을 부드럽게 챔버 웰에 직접 몇 방울 떨어뜨려 세포를 미리 고정합니다. 실온에서 4분간 배화하세요. 고정제가 세포를 방해하지 않고 고르게 퍼지도록 하세요.
      주의: TNT 손상을 방지하기 위해 조심스럽게 다루세요. 고정액에는 PFA와 글루타알데히드 같은 독성 성분이 포함되어 있으니 항상 보호용 장갑, 보호복, 마스크를 착용하고 훈기 후드에서 다루세요. 사용 후에는 반드시 손을 깨끗이 씻으세요. PFA와 글루타알데히드 고정 폐기물을 별도로 라벨이 붙은 용기에 수집하여 유해 화학물질 폐기물을 처리하세요.
    2. 전접사제를 흡입한 후 140 μL 신선 고정액 1로 교체하여 전체 우물을 덮어줍니다. 37°C에서 15분간 배양하세요.
    3. 고정액 1을 제거하고 140 μL 고정액 2를 추가합니다. 37°C에서 15분간 배양하세요. 용액이 세포를 완전히 덮어 균일한 고정을 유지하도록 하세요.
    4. 고정제를 제거한 후 100 mM NH₄Cl 140 μL를 첨가하여 잔류 알데히드를 소결합니다. 상온에서 10-30분 정도 배양하세요.
    5. 샘플을 1x PBS로 3회 상온에서 30초간 헹구며, 피펫팅으로 챔버 벽을 따라 부드럽게 세척하여 세포가 씻겨 나가거나 TNT가 손상되지 않도록 하세요.
  4. 막 및 세포골격 염색
    1. 1:300(v/v) WGA(밀 배아 응집분)-알렉사 플루오 결합체인 140 μL 세포를 1x PBS에서 실온에서 20분 동안 어둡게 인큐베이팅합니다.
      참고: 이후 단계들은 어두운 환경에서 수행되어야 합니다.
    2. PBS 1개(각각 30초)를 3번 세척하세요. 1:250(v/v) 희석한 팔로이딘 결합액 140 μL과 함께 1% BSA에 실온에서 어두운 곳에서 30분간 인큐베이팅합니다.
    3. PBS 1개(각각 30초)를 3번 세척하세요. 140 μL DAPI 용액과 함께 실온에서 어두운 환경에서 5분간 배양합니다.
    4. PBS 1×로 3번 세척하세요. 마운팅 매체 2-3방울을 넣고 실온에서 20분간 배양한 후 최소 20분간 어두운 곳에서 보관하다가 영상 촬영을 마칩니다.
  5. 영상
    1. 40배 대물렌즈를 가진 역방향 공초점 현미경으로 이미지를 획득하세요. 무작위 필드를 선택하고 셀의 아래에서 위로 Z-스택(10-20개의 층)을 모으세요. 이미지 획득에 사용되는 특정 현미경 매개변수는 아래에 나열되어 있습니다:
      공초점 레이저 주사 현미경: ZEISS LSM 900
      레이저 라인: 트랙 1 (561 nm, 4.0%), 트랙 2 (488 nm, 16.0%), 트랙 3 (405 nm, 60.0%)
      검출기 이득: 525V
      Z-단계 크기: 20개의 광학 단면 (총 깊이: 5.32 μm)

2. 표피 세포와 피부 세포의 공동 배양

  1. 1.2.1-1.2.5 단계에 따라 각질구와 섬유아세포를 준비합니다.
  2. 400 μL 배지에 10,000개의 각화구와 6,000개의 섬유아세포를 우물에 씨앗합니다. 씨앗을 뿌린 후에는 방을 교차 흔들어 세포가 고르게 분포되도록 하세요. 37 °C에서 24시간 배양하세요.
  3. 약 24시간 정도 잠복 후 현미경으로 세포 합류를 관찰합니다. ~80%에 도달하면 다음 고정 단계로 진행하세요.
  4. 1.3-1.4 단계에 설명된 대로 멤브레인을 고정하고 염색하세요.
  5. 0.1% Triton X-100으로 세포를 투과시켜 항체가 세포 내 표적에 접근할 수 있도록 하며, 상온에서 3분간 사용한 후 1x PBS로 3회 세척합니다.
    참고: 0.1% Triton X-100은 사용 전에 신선하게 준비해야 합니다.
    주의: 수생 생물에 해로운 트리톤 X-100은 화학 폐기물로 처리되어야 하며, 결코 하수구에 버려지지 마십시오.
  6. 2% BSA 140 μL 용량으로 상온에서 20분간 비특이적 항체 결합을 줄이기 위해 PBS에 블록을 삽입합니다.
    참고: 2% BSA는 사용 전에 신선하게 준비해야 합니다.
  7. 항사이토케라틴 5항체를 1:200(v/v) 희석한 2% BSA와 함께 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
  8. PBS 1개로 3회 세척한 후, Alexa Fluor 594 결합 2차 항체와 함께 실온에서 어두운 환경에서 1-2시간 인큐베이팅합니다.
  9. PBS 1×로 3번 세척하세요. DAPI와 영상으로 핵을 염색하세요. 1.4.5-1.5.2 단계에 따라 합니다.

3. TNT의 세포골격 구성 요소 식별

  1. 세포 배양
    1. 1.2-1.3단계에 따라 세포를 배양하고 고정하세요. 0.1% Triton X-100으로 실온에서 3분간 투과시키고, 그 후 PBS 1배로 세척하세요.
    2. 2% BSA를 넣고 실온에서 20분간 블록을 사용하세요. 항α-튜불린 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
    3. 1배 PBS로 3회 세척한 후 Alexa 플루오르 접합 2차 항체와 함께 실온에서 어두운 환경에서 1-2시간 배양합니다.
      참고: 이후 단계들은 어두운 환경에서 수행되어야 합니다.
    4. PBS 1배에 3번 세척하세요. F-액틴과 팔로이딘, 그리고 1.4.3-1.5 단계에 따른 이미지에 라벨을 붙이세요
  2. 세포의 공동 배양
    1. 2.1-2.2 단계에 따라 공동 배양을 준비하세요. 고정액 3번으로 상온에서 15분간 고정하세요.
    2. 100 mM NH4Cl 140 μL 용액으로 대체하고 상온에서 10-30분간 배양합니다. PBS 1배에 3번 세척하세요.
    3. 먼저, 2.4-2.8단계에서 설명한 대로 투과, 차단, CK5 면역염색을 수행하여 표피 세포를 식별합니다.
    4. 다음으로, 3.1.2-3.1.4 단계에 따라 α-튜불린 면역염색을 수행합니다.
    5. 마지막으로 F-액틴을 팔로이딘으로 염색하고 1.4.2-1.5.2 단계에 설명된 영상 촬영을 진행합니다.

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결과

이 표준화된 프로토콜을 사용하여 터널링 나노튜브(TNT)는 단일 배양 및 공동 배양 조건 모두에서 인간 피부 세포에서 성공적으로 확인되었습니다. 항체 특이성을 검증하기 위해, 실험 분석 전에 모든 항체에 대해 양성 및 음성 대조군 염색이 수행되었으며, 이는 보완 그림 1, 보충 그림 2, 보충 그림 3, 보 충 그림 4에 나와 있습니다. 대표적인 이미지는 TNT가 세포를 연결하는 얇고 액틴을 포함하는 채널로 재현 가능하게 검출함을 보여줍니다.

단일 세포 집단에서 TNT의 검출
피부 섬유아세포 배양에서 TNT는 인접 세포를 잇는 길고 얇은 돌출부로 관찰되었습니다. WGA(녹색)로 막 염색을 하고 팔로이딘(빨간색)으로 F-액틴 표지를 부착하여 이들의 동일성을 확인했으며, 기질 위에 TNT가 현탁되어 있고 노란색 화살촉으로 강조되...

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토론

이 프로토콜에서 중요한 단계는 고정 및 염색 과정에서 TNT를 보존하는 것입니다. 이 구조물은 매우 연약하고 쉽게 손상됩니다. 고정 시 부드러운 다루기, 적절한 타이밍, 신선한 고정제 사용이 TNT 무결성을 유지하는 데 필수적입니다. Z-스택 공초점 영상의 사용은 기질 위에 떠 있는 TNT를 필로포디아 또는 다른 부착 돌출부와 구분하는 데 똑같이 중요합니다. 그렇지 않으면 오해를 초래할 수 있습니다. 이러한 고려사항은 특히 강한 기질 부착력과 뚜렷한 액틴 기반 돌기가 있어 TNT 식별을 복잡하게 하는 피부 세포에서 실험실 간 반복 가능한 TNT 시각화를 위한 표준화된 절차의 필요성을 강조합니다.

고정 프로토콜은 세 가지 뚜렷한 해결책으로 설계되어 다양한 실험적 요구를 충족하여 미세한 구조 보존과 항원성 사이의 균형을 달성합니다. 핵심 원칙은 조성과 단계를 조정하여 주요 염색 대상의 품질을 우선시하는 것입니다. 고정액 1...

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계를 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 프로젝트는 중국 국가자연과학기금(보조금번호 82273554)의 지원을 받았습니다. 저자들은 닝보 장랑병원의 생체재료 및 조직재생공학 연구실에 지속적인 지원을 제공해 주신 것에 감사를 표하며, 현재 및 과거 팀원들의 귀중한 논의에 감사드립니다. 저자들은 또한 항저우 의과대학 연구실험센터의 펑리 선생님께서 공초점 현미경 접근을 돕는 데 있어 관대한 지원과 강력한 지원을 제공해 주신 것에 대해 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15mL 튜브키르겐KG2611멸균, RNase/Dnase, 그리고 발열 물질 없는 상태입니다
37 & deg; C 인큐베이터써모 사이언티픽5103287737도 CO2 인큐베이터는 이상적인 시험관 내 환경을 제공합니다.
액틴-트래커 레드-로다민비요타임C2207액틴-트래커 레드-로다민 프로브는 형광 염료 로다민으로 표지된 팔로이딘으로, 최대 여기 파장은 540nm, 최대 방출파장은 565nm입니다.
알렉사 플루오 결합체 밀 배아 응집체(WGA)분자 프로브W11261그리고 nbsp; 알렉사 플루어 488 켤레
항알파 튜불린 항체앱캠AB7291알파 튜불린 항체 - 로딩 컨트롤(ab7291)은 알파 튜불린을 검출하는 마우스 단클론 항체입니다. 사람, 쥐, 쥐 모두 적합해.
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NH4Cl 메드켐익스프레스HY-Y1269 염화암모늄은 pH 조절을 위한 극성 화합물입니다.
팔로이딘 결합 오리건 그린TM488라이프 테크놀로지O7466색상: 녹색. 여기 파장 범위: 496/520.
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트라이톤-X 100솔라비오T8200-100ml이 제품은 부드러운 변성 조건에서 막 성분을 복원하는 데 사용되는 다목적 비이온 계면활성제입니다.
트립신-EDTA 용액GIBCO25300054소화 능력 덕분에 트립신은 세포 해리, 일상적인 세포 배양 전달, 1차 조직 해리에 널리 사용됩니다.
Y-27632메드켐익스프레스HY-10071Y-27632는 ROCK-I 및 ROCK-II의 경구 활성 ATP 경쟁 억제제입니다

참고문헌

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