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연구 논문

쥐 척수 손상 모델에서 경직 및 PANopsosis에 대한 Gualou Guizhi 항경사 과립의 치료 효과

225 조회수

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DOI:

10.3791/69894

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2026년 2월 10일

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1Department of Neurosurgery, The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation for Medical Institutions in Fujian Province (Fujian University of Traditional Chinese Medicine), 3Department of Rehabilitation, Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ultrasound, The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 행동, 생체역학, 영상 및 조직학적 방법을 활용하여 척수 손상(SCI)으로 인한 경직에 대한 Gualou Guizhi 항경련 과립(GLGZ)의 효과를 평가하고, PANoptosis 관련 기전을 탐구합니다.

초록

척수 손상(SCI) 후 근육 경직은 삶의 질에 심각한 영향을 미치며, 효과적인 치료법은 제한적입니다. 병원에서 개발한 전통 중의학(TCM) 제형인 구로우 구이즈 항경련 과립제(GLGZ)는 경련을 완화할 수 있습니다. 본 연구는 척추손상 유발 경직에 대한 GLGZ의 효능과 PANopsosis(세포자사멸사, 네크토시스, 파이롭토시스가 포함된 새로운 프로그램적 세포사사)와의 연관성을 평가하는 것을 목표로 했습니다.

180-200g 무게의 수컷 스프래그-도울리 쥐가 사용되었습니다. 척수손상은 Allen 체중 감소법으로 유도되었습니다. 성공적인 모델 쥐들은 모델 그룹 또는 GLGZ 용량군 중 하나(고용량, 중간, 저용량)에 무작위로 배정되었습니다. 샴쥐는 척수 손상 없이 후궁절제술을 받았습니다. 중재는 4주간 지속되었습니다. 중재 후에는 사지 운동 기능이 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB) 척도로 평가되었습니다. 대퇴근 경직성은 초음파 전단파 탄성술(SWE)을 통해 평가했으며, 척수의 완전성은 자기공명영상(MRI)으로 확인하였습니다. 헤마톡실린-에오신(HE), Nissl, Luxol 빠른 청색 염색을 통해 조직병리학적 변화를 관찰하였다. 다중성 면역형광 염색을 사용하여 CARD(ASC, 녹색), Caspase-8(주황색), 수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나제 3(RIPK3, 노란색)을 포함한 세포자사멸사 관련 speck 유사 단백질을 표지하여 PANopsosis를 평가하였습니다.

GLGZ는 용량 의존적으로 BBB 점수를 개선했습니다: 샴(21.00 ± 0.00), 모델(5.8 ± 1.1), 고용량(10.6 ± 1.3), 중용량(8.5 ± 1.2), 저용량(7.1 ± 1.0). SWE는 근육 경직 감소를 보였다: 모델(6.68 ± 0.74 m/s), 고용량(2.19 ± 0.36 m/s, P < 0.001), 중용량(3.04 ± 0.45 m/s, P = 0.002), 저용량(4.08 ± 0.65 m/s, P = 0.031) 대 모델. 모델군(3.65 ± 1.03 mm²)과 비교했을 때, GLGZ는 모든 용량군에서 척수 병변 크기를 감소시켰습니다(모든 P< 0.05), (고용량 1.33 ± 0.79 mm², 중용량 1.94 ± 0.67 mm², 저용량군 2.50 ± 0.79 mm²). 조직학 검사 결과 GLGZ는 신경세포를 보존하고 수초의 수리를 촉진하는 것으로 나타났습니다. GLGZ는 용량 의존적으로 ASC, Caspase-8, RIPK3 발현을 감소시켰습니다.

서론

근육 경련은 척수 손상(SCI)의 흔한 합병증으로, 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다. 병리학적 과정에는 초기 기계적 손상, 2차 염증, 산화 스트레스, 세포자멸사, 신경 재생 장애 등이 포함됩니다 1,2. 현재 치료(수술적 감압, 약물치료, 재활)는 효과가 제한적이며, 장기 약물 복용은약물 내성과 같은 부작용을 일으킵니다. 따라서 새로운 기전과 치료법을 탐구하는 것이 매우 중요합니다.

최근 연구들은 세포 세포 사사인 PANopsosis(세포자멸사, 카스파제 의존), 괴사(RIPK3/MLKL 의존), 피롭토시스(caspase-8/GSDMD 의존)4가 SCI의 2차 손상의 주요 병리학적 기전임을 확인했습니다. (ASC, caspase-8, RIPK3)의 비정상적인 활성화는 신경세포 손실과 교세포 흉터 형성을 유도하여 경직5를 악화시킵니다. 따라서 PANopsosis를 표적으로 하는 것은 SCI의 2차 손상 연쇄 반응을 차단하는 유망한 전략으로 떠올랐습니다.

전통 중의학(TCM)은 다중적 효과(예: 항염증, 항산화 스트레스)로 인해 신경학적 질환에 주목받고 있습니다6. 구아루 귀지 항경련 과립(GLGZ)은 장중징의 『황금실 개요』에서 유래하여 병원 준비제로 최적화되었습니다. 성분으로는 트리코산테스 키릴로위(Trichosanthes kirilowii , 톈화펜), 계피나무(Cinnamomum casia , 귀즈), 파에오니아 락티플로라(Paeonia lactiflora , 바이샤오), 글리시리자 우랄렌시스(Glycyrrhiza uralensis , 간차오), 대추, 생강8이 포함됩니다. 예비 연구에서는 GLGZ가 신경전달물질을 조절하고 염증을 억제함으로써 중추신경계 손상 후 경련을 완화한다는 것이 밝혀졌습니다.9. 그러나 척수손상으로 인한 경직에 미치는 영향과 PANopsosis와의 잠재적 연관성에 대해서는 아직 밝혀지지 않았습니다.

단일 표적 기존 약물과 달리, GLGZ의 다성분 특성은 SCI의 복잡한 병리학적 네트워크와 일치하여 염증, 신경 손실, 수초 손상, 그리고 잠재적으로 PAN옵토시스를 동시에 다룹니다. 본 연구는 GLGZ가 척수 병리학적 수리(염증 감소, 뉴런 보존, 수초 수리)를 촉진하고 PAN옵토시스를 억제함으로써 SCI 쥐의 근육 경직을 완화한다고 가설을 세웁니다. 이 가설을 검증함으로써, 우리는 증상 완화와 핵심 병리학적 수리를 통합한 유망한 치료법으로서 GLGZ에 대한 실험적 증거를 제공하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

동물 모델링
이 연구는 푸젠 중의학대학교 제2부속병원 윤리위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. FJPSPH-IAEC2024114)를 운영하며, 동물 복지 지침을 준수하여 진행되었습니다. 180-200g의 수컷 스프래그-도울리 쥐는 22-26°C, 40-70% 습도의 통제된 환경에서 사육되었습니다. 척수손상은 Allen 체중 강하법10에 의해 유도되었습니다: 3-4% 이소플루란 흡입 마취, T10 정중 절개, T9-T11 구간 노출, 후궁 절제술(경막 온전함), 충격(2 mm 팁, 0.5 m/s 속도, 1.3 mm 깊이, 1초 지속). 가짜 쥐는 충격 없이 후궁 절제술을 받았습니다. 포함 기준: 수술 후 24시간 기준 BBB 점수 < 8; 제외 기준: 감염, 척수 절단. 수술 후 관리: 진통(부프레노르핀, 0.1 mg/kg 시술, 12시간마다 3일), 방광 발현(1주일간 6시간마다 투여), 멸균 상처 관리. 성공적인 모델 쥐들은 무작위로 모델 그룹에 배정되었고, 고용량(2.32 g/kg, n = 10), 중간 용량(1.16 g/kg, n = 10), 저용량(0.58 g/kg, n = 10) GLGZ 그룹이 배정되었습니다.

운동 기능 분석
바소, 비티, 브레스나한(BBB)의 점수 채기는 무작정 수행되었습니다. 쥐들은 5분간 개방된 들판에서 관찰되었으며, 하지관절 움직임, 체중 지지, 보행, 협응력을 기록했습니다.

전단파 탄성법 측정을 위한 대퇴직근 강성 측정
선형 배열 프로브(18L6)를 사용하는 도플러 초음파 시스템이 사용되었습니다. 쥐는 측면 누운 자세(근육 이완 상태)에 배치되었습니다. SWE는 프로브를 근육에 대해 90° 각도로 위치시키고, 깊이는 1-2cm였습니다. 관심 영역(ROI)은 0.5 × 0.5 cm로 설정되었으며, 측정당 10개의 프레임이 획득되었습니다. 최종 강성 값은 세 가지 유효한 측정값의 평균을 나타낸 값입니다. 전단파 속도(SWV)가 기록되었으며; 녹색 품질 관리 결과 유효한 이미지11.

MRI 검사
MRI는 T2 가중 지방 억제 서열과 동물 특이적 코일을 사용한 7.0T 스캐너를 사용하여 수행되었습니다. 획득 매개변수는 다음과 같았습니다: 반복 시간(TR) 3,800 ms, 에코 시간(TE) 72 ms, 슬라이스 두께 1 mm, 복셀 크기 0.1 × 0.1 × 1 mm, 매트릭스 256 × 256, 시야각(FOV) 25.6 × 25.6 mm, 4개의 신호 평균, 호흡 게이팅. 병변 부위는 영상 처리 소프트웨어를 사용해 측정되었습니다.

조직학적 염색
HE 염색은 순차적인 탈파라핀화, 재수화, 5분간 헤마톡실린 염색, 흐르는 물로 세척, 1% 염산-에탄올 분화 30초, 에오신 염색 2분, 탈수, 투명화 및 장착 과정을 통해 수행되었습니다. 시각적 검사로서, 염색된 절면에서는 청색 핵과 붉은 세포질이 나타났다.

니슬 염색은 탈파라핀화, 재수화, 0.1% 톨루이딘 블루에서 50-60 °C에서 30분간 배큐한 후 증류수로 세척, 에탄올 분별, 탈수, 투명화 및 마운팅으로 진행되었습니다. 시각적 체크포인트로, 가짜 그룹에서 짙은 파란색 닛슬 차체가 명확히 관찰되었습니다.

럭솔 빠른 청색-크레실 바이올렛 염색은 탈파라핀화, 재수화, 60°C에서 럭솔 파스트 블루에서 2시간 배양, 95% 에탄올로 세척, 탄산리튬에서 30초간 분화, 이어서 70% 에탄올 분화, 10분간 크레실 바이올렛 대염색, 탈수, 투명화 및 장착으로 수행되었습니다. 크레실 바이올렛의 작업 농도는 0.1%였습니다. 시각적 체크포인트로, 가짜 그룹에서는 짙은 파란색 미엘린이 관찰되었습니다.

다중성 면역형광 염색은 탈파라핀화, 재수화 및 항원 회수를 시작으로, 시트레이트 버퍼(pH 6.0)를 95°C에서 20분간 수행하였다. 절제는 3% 과산화수소로 10분간 처리한 후, 37°C에서 5% BSA로 1시간 동안 차단하였습니다. 1차 항체는 4°C에서 하룻밤 배양되었습니다(ASC: 1:500; 카스파제-8: 1:400; RIPK3: 1:500). PBS-T(0.1% Tween-20, 3 x 5분)로 세척한 후, 절편을 HRP 표지된 2차 항체(1:1000)로 37°C에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 후 플루오로크롬 표지가 적용되었습니다: ASC에는 YTR520 Plus, Caspase8에는 TYR570 Plus, RIPK3에는 TYR690 Plus(30분), 이어서 5분간 DAPI 핵 염색을 했습니다. 슬라이드가 장착되었고, 500ms 노출, 게인 1.0, 배율 ×200, 각 형광색소와 일치하는 필터 세트를 사용한 형광현미경을 사용해 영상을 촬영했습니다.

자일렌과 에탄올의 경우, 모든 작업은 연기함 내에서 수행되었으며, 사용 중에는 장갑과 고글을 착용해야 했습니다. 염색 시약의 경우, 피부 접촉은 엄격히 피했다. 모든 폐기물은 지정된 유해 폐기물 용기에 폐기되었습니다. 생물학적 위험 물질의 경우, 최종 폐기 전에 철저한 오토클레이브 멸균이 이루어져 잠재적인 생물학적 오염을 방지했습니다.

통계 분석
그룹 비교에는 LSD 사후 검사를 이용한 일방향 ANOVA가 사용되었습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

BBB 점수
샴 그룹 BBB 점수는 21.00 ± 0.00으로, 모델의 5.8 ± 1.1, P < 0.001)보다 유의미하게 높았습니다. GLGZ의 용량 의존적 BBB 점수 증가: 고용량(10.6 ± 1.3, P < 0.001), 중용량(8.5 ± 1.2, P = 0.003), 저용량(7.1 ± 1.0, P = 0.028) 대 모델 대비

전단파 탄성법 대퇴직근 강성 분석
전단파 탄성술(SWE)은 색상 매핑과 수치 값을 통해 근육 강성 변화를 반영할 수 있습니다. 왼쪽 이미지는 품질 관리 차트를 보여주며, 녹색은 좋은 이미지 품질을 의미합니다; 오른쪽 이미지는 근육 강성 색상 척도를 보여주며, 높은 경직은 빨간색 또는 노란색 영역으로, 낮은 뻣뻣함은 파란색 또는 초록색 영역으로 표시됩니다. 샴 SW...

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토론

본 연구는 SCI 환자 쥐에서 GLGZ가 근육 경직에 미치는 개선 효과를 체계적으로 평가하고, 신경보호 및 PANoptosis와의 관계를 탐구하였습니다. 결과는 GLGZ가 용량 의존적으로 SCI 쥐의 BBB 점수를 개선하고 근육 경직을 줄일 수 있음을 시사했습니다. 연구는 또한 GLGZ의 작용 기전이 신경보호, 미엘린 수리, PANopsosis 억제와 관련이 있을 수 있음을 발견했습니다. 현재 척수손상 후 근육 경직에 대한 임상 약물 치료는 척수 손상의 핵심 병리학적 문제를 다루지 않고 주로 증상 완화에 그치고 있습니다. 이 연구는 동물 실험을 통해 GLGZ가 근육 경직 증상을 효과적으로 개선할 뿐만 아니라 척수 손상의 핵심 병리학적 과정을 수리를 목표로 한다는 것을 확인했습니다. 이는 척수 손상 치료에 GLGZ를 사용하는 실험적 증거를 제공합니다.

결과는 GLGZ가 SCI 쥐에서 Basso-Beattie-Bresna...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 푸젠성 보건위원회 주요 과학 연구 프로젝트(2024ZD01006), 2023년 임상연구소 공개 프로젝트(LC2023001-연구소), 푸젠성 자연과학기단(2024J01733), 푸젠성 보건위원회 의학 혁신 연구 프로젝트(2022CXA052), 푸젠 중의학대학교 주요 과학기술 혁신 프로젝트 명단 기반 리더십-채용 프로젝트(XJB2022003-3)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
무수 에탄올 240403A1 탈수
무수 에탄올 241101A1착색
항형광 감쇠 필름 코팅제(DAPI 포함)와 nbsp;MA0221 그리고 nbsp; 면역형광 염색
ASC 항체Bs-6741RPANopsosis 분석 (1:300)
카스파제-8 항체13423-1-APPANopsosis 분석 (1:400)
형광 현미경  니콘ECLIPSECi-L 
완전 자동 디지털 유리 슬라이드 스캐너그리고 nbsp; GCell-60슬라이드 스캐너
헤마톡실린-이오신 키트R23718헤마톡실린-에오신(HE) 염색
이미지 분석 소프트웨어NIHImageJ 1.53k
럭솔 패스트 블루R23193럭솔 패스트 블루-크레실 바이올렛 스테인팅
MRI 스캐너브루커7.0T
다중 형광 염색 키트  240522그리고 nbsp; 면역형광 염색
골수질 염색 키트그리고 nbsp; G3245 골수성 염색 
중립  발삼 그리고 nbsp; MB9899 스테인 후 장착
Nissl 스테인 키트R23093  닛슬 스테인
RIPK3 항체Bs-3551RPANopsosis 분석 (1:400)
SPSS 22.0통계 분석 소프트웨어 
스프래그-도울리 쥐 및 nbsp;푸저우의 한이 생명공학 회사
주르타르산, 삼중인산나트륨10019418착색
초음파 시스템지멘스 아쿠손  선형 배열 프로브 (18L6)
자일렌240904A2착색

참고문헌

  1. Sezer, N., Akkuş, S., Uğurlu, F. G. Chronic complications of spinal cord injury. World J Orthop. 6 (1), 24(2015).
  2. Quadri, S. A., et al. Recent update on basic mechanisms of spinal cord injury. Neurosurg Rev. 43, 425-441 (2020).
  3. Huang, H., et al. Clinical neurorestorative therapeutic guidelines for spinal cord injury (IANR/CANR version 2019). J Orthop Transl. 20, 14-24 (2020).
  4. Li, P., et al. PANoptosis: cross-talk among apoptosis, necroptosis, and pyroptosis in neurological disorders. J Inflamm Res. 2025, 8131-8140 (2025).
  5. Lou, J., et al. TRIM56 modulates YBX1 degradation to ameliorate ZBP1-mediated neuronal PANoptosis in spinal cord injury. Adv Sci. 11 (42), 2407132(2024).
  6. Lu, Y., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine for treatment of spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 127, 110136(2020).
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  8. Huang, J., Tao, J., Xue, X., et al. Gua Lou Gui Zhi decoction exerts neuroprotective effects on post-stroke spasticity via modulation of glutamate levels and AMPA receptor expression. Int J Mol Med. 31 (4), 841-848 (2013).
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  10. Yang, Z., et al. Hypoxic-preconditioned mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles promote recovery of spinal cord injury by affecting astrocyte phenotype through the miR-21/JAK2/STAT3 pathway. CNS Neurosci Ther. 30 (3), e14428(2024).
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  14. Chakraborty, A., Sankaran, V., Murugan, R., Chellappan, D. R. Comparative spasmolytic effect between Cinnamomum tamala and Cinnamomum verum leaf essential oils and eugenol through in vitro and in silico approaches. Z Naturforsch C. 76 (9-10), 383-391 (2021).
  15. Li, B., et al. Machine learning and experiments revealed key genes related to PANoptosis linked to drug prediction and immune landscape in spinal cord injury. Mol Neurobiol. 62 (6), 7364-7379 (2025).
  16. Wang, L., et al. Mechanisms of PANoptosis and relevant small-molecule compounds for fighting diseases. Cell Death Dis. 14 (12), 851(2023).
  17. Yang, J., Zhu, X., Hu, H., Lin, X. The inhibitory effect of Gualou Guizhi decoction on post-ischemic neuroinflammation via miR-155 in MCAO rats. Ann Palliat Med. 10 (2), 1370-1379 (2021).

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