LncRNA 노크다운 골육종 세포의 증식 능력을 검출하는 콜로니 형성 분석

요약

이 실험 프로토콜은 lncRNA 녹다운과 콜로니 형성 분석법을 결합하여 lncRNA가 골육종 세포 증식에 미치는 영향을 정량화하는 안정적이고 비용 효율적이며 효율적인 방법을 제공합니다.

초록

비정상적으로 긴 비암호화 RNA(lncRNA) 발현은 골육종 세포의 세포 증식에 깊은 영향을 미치며, 이들이 잠재적인 치료 표적으로 작용할 수 있음을 시사합니다. 그러나 lncRNA에 대한 기능적 연구는 여전히 대부분 이론적이며 일부 검증에 국한되어 있습니다. 단일 세포의 궁극적인 증식 운명을 구체적으로 반영하는 군집 형성 분석은 장기 증식 잠재력을 평가하는 금본위로 여겨집니다. 본 프로토콜은 lncRNA 녹다운 세포에서 콜로니 형성 분석법을 사용하여 lncRNA가 골육종 세포 증식 능력에 미치는 영향을 평가하는 신뢰할 수 있는 실험 프로토콜을 확립하였습니다. 이 실험 프로토콜은 lncRNA가 골육종 세포 증식에 미치는 조절 효과를 평가하기 위해 안정적이고 비용 효율적이며 효율적인 검사법을 제공합니다. 이 접근법은 골육종 세포 연구에 적합할 뿐만 아니라 다른 종양에서 lncRNA 조절 세포 증식 능력을 향상시키는 실질적인 도구로도 활용됩니다. 이 연구에는 lncRNA 녹다운 및 콜로니 형성 분석의 상세한 검출 프로토콜이 포함되었으며, 골육종 세포에서 작은 핵소체 RNA 숙주 유전자 6(SNHG6)의 넉다운 사례(143B)가 포함되었습니다. 실험 결과는 SNHG6 발현이 효율적으로 억제되었고, 군집의 수와 크기가 현저히 감소함을 동반했다. 이 발견들은 SNHG6가 골육종 세포의 장기적인 증식 잠재력을 유지하는 데 필수적임을 시사합니다(143B).

서론

단백질 코딩 잠재력이 없는 200 뉴클레오타이드를 초과하는 전사체로 정의되는 장비암호화 RNA(lncRNA)는 최근 몇 년간 다양한 생물학적 과정을 조절하는 중요한 조절자로 부상했습니다 ^1,2. 이들은 골육종, 전립선암, 폐암 등 다양한 암의 발생과 발병에 중요한 역할을 합니다 ^3,4,5. 골육종에서 누적된 증거는 비정상 장기 비암호화 RNA(lncRNA) 발현이 세포 증식에 깊은 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 예를 들어, lncRNA POU3F3의 침묵은 골육종 세포(MG63 및 U2OS)의 증식을 유의미하게 억제하고 세포자사멸을 촉진시켰다⁶. 마찬가지로, lncRNA HOXA-AS3의 노크다운은 U2OS와 SW1353 세포에서 콜로니 형성을 줄이고 성장을 억제했습니다⁷. 통제되지 않은 증식이 암 생물학의 특징이자 치료 전략의 주요 결정 요인임을 고려할 때, 특히 골육종에서 종양에서 lncRNA 조절 세포 증식을 밝히는 것은 여전히 매우 중요하고 필수적입니다.

세포 증식을 평가하는 여러 접근법이 존재하지만, 각각은 고유한 한계를 가지고 있습니다. CCK-8과 MTT와 같은 색도 측정법 또는 대사 분석법은 편리하고 빠르며 고처리량입니다. 하지만 주로 단기 판독을 제공하며 대사 변동에 의해 쉽게 혼동되고^{, 사용되는 시}약으로 인한 광학 또는 광화학적 간섭 위험도 있습니다. BrdU와 EdU 통합 등 DNA 합성 기반 방법은 장기적인 증식 결과를 반영하지 않고 S상 진입의 스냅샷 분석에 한정하면서도 더 높은 특이성을 제공합니다 ^9,10. 마찬가지로, Ki-67과 같은 증식 마커에 대한 면역염색은 세포 주기 활동만 즉각적으로 나타내며 클로노제인 용량¹⁰을 예측하지 못합니다. RTCA와 같은 실시간 모니터링 시스템은 높은 재현성을 가진 연속 성장 곡선 분석을 가능하게 하지만, 높은 비용과 단기 또는 중기 평가에 대한 제한으로 인해 실^{용성이 떨}어집니다. 반면, 클로노제닉 분석법은 단일 세포가 무제한으로 증식하고 눈에 띄는 집단을 형성하는 능력을 독특하게 포착하여 그 궁극적 운명을 직접적으로 반영합니다. 노동 집약적이고 시간이 많이 들지만, 클로노제닉 분석은 장기 증식 잠재력을 평가하는 데 있어 금본위로 남아 있으며, 단기나 대체 검사로는 얻을 수 없는 통찰을 제공합니다¹².

여기서는 143B 골육종 세포에서의 SNHG6-녹다운 사례와 함께 lncRNA 녹다운 및 콜로니 형성 분석에 대한 상세한 검출 프로토콜을 포함합니다. 이 접근법은 골육종 연구에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 종양에서 lncRNA 매개 증식을 조사하는 실질적인 도구로도 활용됩니다.

프로토콜

시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 플라스미드 형질전환

1. 10cm 배양 접시당 5× 143B 세포⁵ 개(총 두 접시)를 시드하고, 세포를 완전 배지(DMEM + 10% FBS)에서 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
2. 24시간 후에 플라스미드(shNC 및 shSNHG6), PEI, Opti-MEM을 포함한 형질전환 시약을 준비합니다.
   참고: 사용 전에 모두 실온에 균형을 맞춘 것을 확인하세요.
3. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 4개를 꺼내 마커펜으로 플라스미드(shNC와 shSNHG6)와 PEI(2개 튜브)를 표시하세요.
4. 각 튜브에 500 μL 옵티-MEM을 추가하세요.
5. 플라스미드 튜브에 10 μg의 플라스미드(shNC 또는 shSNHG6)를 추가하고, 각 PEI 튜브에 30 μL(1μg/μL)을 추가합니다.
6. 부드럽게 위아래로 섞고, 실온에서 5분간 배큐하세요.
7. 플라스미드 튜브와 PEI 튜브를 결합하여 부드럽게 섞은 후 상온에서 20분간 배양하세요.
8. 인큐베이터에서 143B 세포를 꺼내 배양지를 부드럽게 흡인하세요. 각 접시에 7mL의 무혈청 배지를 추가하세요. 접시에 첨가할 플라스미드(143B shNC 또는 143B shSNHG6)를 표시하세요.
9. 미리 준비된 형질전환 혼합물을 해당 배양 접시에 드롭 식으로 추가합니다.
   참고: 피펫을 원을 그리며 천천히 넣고, 바깥쪽 가장자리에서 접시 중앙 쪽으로 고르게 분배하세요. _CO2 5% 인큐베이터에서 37°C에서 배양하세요.
10. 8-12시간 후 상청액을 버리고, 각 10cm 배양 접시에 완전 DMEM 배지 10mL를 추가합니다. 세포를 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
11. 상청액이 제거되고 완전한 DMEM 배지로 교체된 후 72시간 후 형광현미경으로 관찰합니다.

2. 군체 형성 분석

1. 10cm 배양 접시(shNC 및 shSNHG6)에서 배지를 제거하고, 1.5 mL 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 소화한 뒤, 피펫으로 부드럽게 세포를 분리한 뒤, 5mL의 완전 배지를 추가하여 소화를 종료합니다.
2. 세포 현탁액을 15mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.
3. 20 μL 세포 현탁액을 빼내고 세포 수를 세세요.
   참고: shNC 그룹과 shSNHG6 그룹 내 셀 수가 일관되게 유지되도록 셀 수를 여러 번 수행해야 합니다. 여기서는 SNHG6 넉다운 효율의 RT-PCR 검증을 위해 3개 ×^{10개의 5} 세포를 수집합니다.
4. 6웰 플레이트에 10׳ 셀 2개를 씨앗 주세요. 완전한 DMEM 배지를 최종 부피 2 mL에 추가한 후 5%_CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 세포를 배양합니다.
   참고: 매개체는 이틀에 한 번씩 새 완전 DMEM 매체로 교체하세요.
5. 매일 군집 형성을 모니터링하세요.
   참고: 대조군(shNC) 내 대부분의 군집이 ≥50개의 세포를 포함하거나 10-14일 배양 후 중 먼저 도착한 경우 배양을 종료하세요.
6. 인큐베이터에서 세포를 꺼내 상원액을 버리세요.
7. 각 웰당 1mL PBS로 세포를 두 번 세척하고, 세척 후 PBS를 버립니다.
8. 세포를 10% 포르말린 용액 1mL로 15분간 고정한 후 10% 포르말린 용액을 버립니다.
9. 각 웰당 1mL PBS로 세포를 두 번 세척하고, 세척 후 PBS를 버립니다.
10. 0.5% 결정 바이올렛 염색액 1mL로 세포를 10-30분간 염색한 후 염색액을 버립니다.
11. 천천히 흐르는 수돗물로 세포를 부드럽게 세척하세요.
12. 실온에서 공기 건조 셀을 사용하세요.
13. 카메라로 이미지를 촬영하세요.

결과

lncRNA SNHG6가 골육종 세포의 증식 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해, 플라스미드 매개 녹다운 시스템을 성공적으로 구축하고 콜로니 형성 분석을 수행하였습니다. 실험 워크플로우에는 143B 세포의 플라스미드 트랜스펙션과 콜로니 형성 분석법이 포함되었습니다(그림 1).

143B 세포의 형질전환 효율은 형질전환 72시간 후 형광 현미경으로 확인되었습니다(그림 2). 결과는 대조군(shNC)과 SNHG6 녹다운군(shSNHG6)의 143개 세포의 형광 강도가 일관되게 나타나, 대조군과 녹다운군 모두의 플라스미드가 143B 세포에 성공적으로 트랜스펙션되었음을 시사합니다.

RT-qPCR 분석은 shSNHG6 플라스미드를 트랜스펙팅한 143B 세포에서 SNHG6의 성...

토론

암 관련 LNCNA를 치료적으로 표적으로 삼고, 바이오마커로서의 진단적 활용을 활용하는 것은 암 관리에서 신흥 접근법입니다. 골육종 발병 기전에서 lncRNA의 역할을 정의하는 것은 진단, 치료 및 예후를 진전시키는 데 매우 중요합니다.

이 분석의 성공을 보장하기 위해 중요한 단계를 따라야 합니다. 첫째, 단일 세포 현탁액을 확립하는 것은 신뢰할 수 있는 클론 분석의 절대적 전제 조건입니다. 세포 집합체의 존재는 가짜 콜로니를 유발하고 결과의 타당성을 훼손할 수 있기 때문입니다¹². 신뢰할 수 있는 단일 세포 현탁을 확립하기 위해, 세포 해리를 위해 트립신-EDTA를 사용한 후 부드러운 피펫팅으로 응집체를 제거합니다. 부드러운 피펫팅을 반복하여 도판 전에 완전한 해리를 ^{보장합니다.}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로튜브	머크	AXYMCT150C
10% 중성 완충 포르말린	빅트렉스	5205000
100 - 1000 & mu; L 확장 졸업 블루 팁	상하이 바이오사이언스 유한회사	BS10401ML
100mm 세포 배양 접시 실험실	우시 네스트 생명공학 유한회사	704001
143B	ATCC	ATCC CRL-8303TM
15 mL 원심분리관	상하이 바이오사이언스 유한회사	BL2002150
6웰 세포 배양 플레이트	우시 네스트 생명공학 유한회사	703001
CO2 인큐베이터	써모피셔 테크놀로지(중국)유한회사.	300583057
크리스탈 바이올렛	TCI 상하이	C0428
DMEM 매체	와이센트 코퍼레이션	319-005-CL
에펜도르프 리서치 플러스	에펜도르프	3123000233
FBS - 우수한 품질	와이센트 코퍼레이션	086-150
마크 펜	제브라 트레이딩(선전) 유한회사, nbsp;	YYST5
옵티-MEM	깁코	31985070
파스퇴르 피페트	랩지크	BS-XG-O3L
PBS 버퍼(건식 분말)	랩지크	BL601A
PEI	폴리이언스	24765
피펫 팁	머크	AXYT200Y
트라이플LE 발현효소	깁코	12604021
트립신/EDTA	깁코	R001100