방법 논문

레이저 스펙클 기법을 이용한 APP/PS1 마우스의 뇌혈류에 대한 전기침 효과 평가

DOI:

10.3791/69915

⸱

2026년 2월 13일

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences

이 논문에서

요약

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여기서는 뇌혈류를 정량화하는 레이저 스펙클 조영 영상과 Morris Water Maze를 결합한 프로토콜을 소개하며, APP/PS1(AD 모델) 마우스에서 전기침술의 효과를 평가하는 데 활용되었으며, 이는 AD 뇌혈관 연구에 유용합니다.

초록

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알츠하이머병(AD)은 진행성 인지 저하와 뇌혈관 기능 장애가 특징이며, 뇌혈류(CBF) 감소와 신경혈관 단위 장애가 포함됩니다. 전기침술(EA)은 신경 기능 개선에 잠재력이 입증되었으며, 그 메커니즘은 CBF 조절과 관련이 있을 수 있습니다. 레이저 스펙클 영상은 CBF의 실시간 평가를 위한 광시야 방법으로, 뇌 혈액 관류의 변화를 정확히 평가할 수 있습니다. 이 실험에서 우리는 전기 침술이 AD 모델 마우스(APP/PS1 형질전환 마우스)에서 CBF와 인지 능력에 미치는 영향을 관찰했습니다. 쥐에서 중뇌동맥과 그 가지혈관의 혈액 관류는 레이저 스펙클 영상으로 관찰되었습니다. 쥐의 공간 인지 기능은 모리스 물 미로를 사용해 평가되었습니다. 결과는 EA가 APP/PS1 마우스의 인지 기능을 향상시킬 수 있음을 보여주었으며, Morris 워터 미로 테스트에서 탈출 지연이 유의미하게 감소했다(P<0.05). 더불어, 레이저 스펙클 조영 영상(LSCI)은 AD 모델 마우스에서 야생형 대조군에 비해 유의미한 뇌 저관류를 확인했으며(P < 0.05), 특히 EA 치료는 CBF를 통계적으로 유의하게 증가시켰습니다(P < 0.05)하여 AD 마우스의 대뇌 저관류를 역전시켰습니다. 레이저 스펙클 영상은 EA에 의해 유도된 뇌혈관 개선을 평가하기 위한 시각화 기법입니다. 이러한 발견은 뇌혈관 기능 장애를 표적으로 삼아 AD의 보조 치료제로서 EA를 뒷받침합니다.

서론

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알츠하이머병(AD)은 진행성 인지 장애와 기억력 저하를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질환입니다. 이 도구는 세포외 베타-아밀로이드(Aβ) 플라크, 세포 내 신경섬유 엉킴(NFT), 그리고신경 손실의 병리학적 특징을 처리합니다. 이러한 고전적 특징들이 치료 연구의 주요 초점이었지만, 점점 더 많은 증거가AD2의 발병 및 진행에서 뇌혈류 감소(CBF)가 중요한 역할을 한다는 점을 강조하고 있습니다. CBF 감소는 AD 발병 초기 단계에서 발생하며 인지 기능 장애의 심각도와 관련이 있습니다. 따라서 뇌혈관 손상을 개선하는 치료 전략은 AD 증상을 완화하고 질병의 경과를 개선하는 효과적인 방법입니다.

전기침술(EA)은 전통 침술과 전기 자극을 통합한 현대 기법으로, 알츠병 환자의 인지 기능 향상에 잠재력이 입증되었습니다. 연구에 따르면 EA는 Aβ 침착 감소, 신경염증 완화, 시냅스 가소성 촉진 등 여러 메커니즘을 통해 유익한 효과를 발휘할 수 있습니다. 특히, EA의 신경보호 효과가 CBF5 조절 능력과 밀접하게 연관되어 있을 수 있다는 추측이 점점 커지고 있습니다. 그러나 AD 모델에서 EA가 뇌 혈역학에 미치는 영향을 직접 실시간 입증하는 증거는 제한적입니다. 이러한 증거가 부족한 것은 EA가 뇌 기능을 어떻게 개선하는지에 대한 포괄적인 이해를 방해합니다.

광학 영상 기술의 발전은 뇌 혈역학을 연구하는 강력한 도구를 제공했습니다. 빠르고 광시야가 가능한 광학 기법인 LSCI는 부피 통합 조직 혈류 지도시각화를 위한 고시공간 해상도를 제공하여 전기침술에 의한 관류 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 합니다. 최적의 광학 접근을 위해서는 두개골 노출이 필요하지만, LSCI는 침습적 조직 침투를 방지합니다. LSCI는 1990년대에 도입되어 지난 수십 년간 신경과학 분야에서 널리 적용되어왔습니다. 모든 영상 기법과 마찬가지로 LSCI도 고유한 한계가 있습니다: 광학 관통 깊이가 제한되어 표면 피질 혈관을 유리하게 하면서도 심부 뇌 영역(예: 해마, 기저핵)으로의 접근을 제한하고, 절대 CBF 값이 아닌 상대적 혈류(관류 단위)를 정량화하며, 혈관 형태와 조직 광학 산란에 의해 정확도가 미묘하게 영향을 받습니다 8,9. 그러나 이러한 한계는 LSCI의 유용성을 저해하지 않으며, 표면 피질 혈류의 실시간 평가에 특화된 적용을 정의합니다. EA 유발 피질 관류 변화에 초점을 맞춘 연구에서 LSCI는 신뢰할 수 있고 실행 가능한 데이터를 제공합니다. 구체적으로, 우리는 APP/PS1 마우스에서 CBF를 정량화하기 위해 목표 ROI 구분과 최적화된 매개변수를 갖춘 표준화된 LSCI 프로토콜을 구축했으며, 뇌혈관 개선과 인지 결과를 연계하기 위해 Morris Water Maze 검사를 보완하였습니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 베이징 중의대 동물윤리위원회(BUCM20250708-005)의 승인을 받았으며, 중국 실험동물 관리 및 사용 지침에 부합하였습니다.

1. 준비

  1. 이 실험에는 6개월 된 수컷 APP/PS1 쥐 12마리와 6개월 된 수컷 C57bl/6 마우스 6마리가 사용되었습니다.
  2. 모든 쥐는 베이징 중의대학 동물실험센터에 보관되었으며, 한 우리당 3마리의 쥐가 있었습니다. 그들은 멸균된 식수와 표준 펠릿 식단을 무료로 이용할 수 있었습니다.
  3. 주거 환경은 12시간 빛과 어둠 주기로 유지되었으며, 주변 온도는 23± 2°C로 조절되었습니다.

2. 동물 분류와 개입

  1. 6개월 된 수컷 APP/PS1 쥐 12마리(무게 27.88g ± 0.48g)를 두 개의 실험군(n = 6/그룹)으로 무작위로 배정하는데, 알츠하이머병(AD) 모델 그룹과 전기침술(EA) 치료 그룹입니다.
  2. 야생형(WT) 그룹으로 6개월 된 수컷 C57BL/6마우스(무게 29.90g ± 0.81g)를 사용하세요.
  3. WT 대조군과 AD 모델 그룹의 경우, 생쥐를 부드럽게 통풍이 잘 된 쥐 구속기에 넣고 실험적 개입은 하지 않습니다.
  4. EA 치료 그룹의 경우, WT 대조군과 AD 모델 그룹에 사용된 것과 동일한 마우스 억제제로 쥐를 부드럽게 제지하여 과도한 움직임을 제한하고 호흡이 막히지 않도록 합니다. 이 표준화된 구속 조건 하에서, 일회용 멸균 침(0.25 mm × 13 mm)을 머리의 바이후이(GV20)와 인탕(GV29) 경혈(그림 1A)에 코 쪽을 향해 2-3mm 깊이로 삽입합니다. EA 장치의 양극과 음극 단자를 각각 이 두 경혈점에 연결하고 15분간 자극을 제공합니다(그림 1B). 자극 매개변수를 0.1 mA의 세기와 2Hz의 주파수를 가진 분산-밀도 파동 패턴으로 구성하세요.
  5. 각 그룹에게 48시간마다 1회씩 개입을 시행하며, 각 세션은 15분씩 진행되어 총 30일간 진행됩니다.
    참고: 2020년 5월 15일 중국 침술 및 몹교협회가 발표한 표준인 T/CAAM 0002-2020: 실험동물용 흔히 사용되는 침구의 이름 및 위치 3부: 쥐10에 따라 경혈 선택, 위치 확인, 침 시술을 수행하십시오.

3. MWM 시험

참고: 30일 개입 기간 24시간 후, 세 실험군의 모든 쥐를 모리스 워터 메이즈(MWM) 테스트에 적용하는데, 여기에는 숨겨진 플랫폼(장소 내비게이션) 시험과 탐침 시험11,12가 포함됩니다. 정식 시험 전 1일간의 적응 기간을 두어 스트레스를 최소화하고, 쥐들이 실험실, MWM 장비, 취급 절차에 익숙해질 수 있도록 하세요.

  1. 준비 절차
    1. MWM 장비와 관련 신호 획득/처리 시스템을 음향 감쇠 실험실에 배치하세요. 시험 환경의 주변 온도를 약 25°C로 유지하고, 조명 조건을 다음과 같이 표준화하세요: 미로의 네 사분면 위에 천장 카메라에 촬영되지 않을 수 있는 높이에 60W LED 튜브 조명 4개를 설치하세요. 불투명한 커튼이 테스트 구역 전체를 둘러싸여 외부 환경 간섭을 차단하고 의도치 않은 공간 신호가 쥐의 이동에 영향을 미치지 않도록 했습니다.
    2. MWM 세팅 중앙에 직경 90cm× 높이 50cm의 원형 흰색 탱크를 놓으세요. 천장에 장착된 비디오 카메라를 자동 추적 시스템과 녹화기에 연결하여 테스트 내내 지속적인 데이터 수집을 할 수 있습니다.
    3. 탱크를 북쪽(N), 남쪽(S), 동쪽(E), 서쪽(W)으로 표시된 네 개의 동일한 구역으로 나누고, 북동쪽(NE), 북서쪽(NW), 남서쪽(SW), 남동쪽(SE) 등 네 개의 일치 사분면으로 나누세요.
    4. 각 사분면의 외벽에 뚜렷한 모양의 시각적 도형(정사각형, 삼각형, 원형)을 부착하여 쥐의 시야 안에 위치시켜 공간적 기준점으로 활용합니다.
    5. 24± 1°C에서 전기 히터로 유지된 30cm 물로 탱크를 채웁니다; 흰색 식용 안료를 넣어 물을 불투명하게 만듭니다.
  2. 숨겨진 플랫폼 시험
    1. 이 시험 기간 동안 SE 사분면에 잠긴 플랫폼을 고정하세요.
    2. 쥐를 무작위로 세 개의 교대 구역(북동, 북서, 남서)에서 풀에 넣고, 초기 방향은 수조 벽을 향하도록 하세요.
    3. 각 마우스가 숨겨진 플랫폼을 독립적으로 찾을 수 있도록 최대 60초를 허용하세요.
    4. 각 시도마다 공간 학습을 평가하기 위해 탈출 지연(릴리스부터 플랫폼 상승까지의 시간)을 기록합니다.
      참고: 각 쥐는 5일 연속으로 하루에 세 번의 시험을 완료했습니다. 만약 쥐가 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면, 부드럽게 플랫폼으로 안내되어 공간 기억을 강화하기 위해 10초간 머물게 한 후 시험을 종료했습니다.
  3. 탐사 재판
    1. 플랫폼을 제거하세요.
    2. 한 번씩 쥐를 수조 벽을 향한 수영장에 풀어주고 60초간 자유롭게 헤엄치도록 허용하세요.
    3. 주요 결과 지표인 평균 수영 속도와 이전 승강장 위치를 넘은 건너 횟수를 기록하세요.
  4. 검사 후 관리
    1. 매 MWM 세션 후에는 부드러운 수건으로 쥐를 충분히 말리고 전기 히터로 부드럽게 데워 저체온증을 예방하세요.

4. 레이저 스펙클 대비 영상

  1. 각 그룹에서 무작위로 세 마리의 쥐를 선택해 LSCI 시스템을 이용해 실시간으로 전면에서 CBF를 모니터링합니다.
  2. 동물 준비: 모든 동물 수술은 마취 상태에서 수행하세요. 쥐를 1.25% 트리브로모에탄올(0.02 mL/g) 복강 내 마취하여 지속적인 자연 호흡을 보장하고 수평 수술판에 올려놓습니다. 마취된 쥐를 37°C로 유지하는 온도 조절 온열 패드 위에 올려 중심 체온을 안정시킵니다. 두피를 면도하고 밑 근육과 뇌막을 조심스럽게 해부하여 두개골을 노출시키세요; 노출된 두개골 표면을 0.9% 멸균 생리식염수로 촉촉하게 유지하여 건조를 방지하세요.
  3. 영상 설정: 시스템의 스캐닝 헤드를 노출된 두개골 창문에 수직으로 20cm 고정 거리로 위치시킵니다. 자동 초점과 자동 게인 기능을 활성화하여 이미지 선명도와 명암도를 최적화하고, 모든 실험에서 게인 값을 140-160 범위 내에서 자동으로 유지합니다. 추가로 표준화된 영상 매개변수를 다음과 같이 설정하세요: 노출 시간 = 20 ms, 시간 상수 = 1.0초, 작동 모드 = 시간 기준, 필터 = 250 프레임, 샘플 간격 = 5000 ms, 이미지 해상도 = 1032 × 772.
  4. 데이터 수집: 25Hz 샘플링 속도로 연속 스펙클 이미지를 획득하고, 미리 설정된 시간 및 필터 파라미터에 동기화합니다.
  5. ROI 분석: 분석 소프트웨어를 사용하여 전전두엽 피질 상공의 관심 영역(ROI)을 정의하며, 특히 이 피질 영역 내 전대뇌 및 중부 동맥 영역을 목표로 합니다. 이 혈관 영역의 투자 반응률(ROI)을 구분하고, 각 ROI에서 평균 플럭스 값(관류 단위로 표현됨)을 추출하여 이후 통계적 비교를 수행합니다.

5. 통계 분석

  1. SPSS 27.0을 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  2. 숨겨진 플랫폼에서 그룹 차이를 분석하고, 시험 결과를 조사하며, 학생의 t-검정을 사용해 CBF를 분석했습니다. 통계적 유의성을 P < 0.05로 정의하고, 높은 통계적 유의성은 P < 0.01로 설정하라.

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결과

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AD 모델 마우스에서 EA가 공간 학습과 기억에 미치는 영향

모리스 워터 미로 테스트 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 그림 2A 는 숨겨진 플랫폼 테스트 중 5일간의 탈출 지연 시간을 보여줍니다. AD 그룹의 탈출 잠복기는 변동 추세를 보인 반면, WT와 EA 그룹은 꾸준히 감소했습니다. AD 그룹의 탈출 잠복기는 4일차부터 5일차까지 WT 그룹보다 유의미하게 길었습니다(P < 0.01). EA 그룹은 4일차부터 5일차까지 AD 그룹보다 유의미하게 짧은 잠복 시간을 보였다(P < 0.05).

그림 2B 는 프로브 테스트 결과를 보여줍니다. 수영 속도는 AD 그룹이 WT 그룹에 비해...

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토론

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본 연구는 Baihui(GV20)와 Yintang(GV29) 경혈점에서의 장기 EA 개입이 APP/PS1 형질전환 마우스에서 공간 학습 결핍을 유의미하게 완화한다는 것을 보여주며, 이는 Morris Water Maze hidden Platform 테스트에서 탈출 지연 단축을 반영합니다. 이 발견은 EA가 Aβ 침착 감소와 신경염증 완화 등 다양한 AD 모델에서 인지 기능을 개선한다는 이전 보고와 일치합니다13. 특히, 경혈 선택은 전통 중의학 이론에 기반을 두고 있어 인지 장애 관리에 적용되는 전통적인 근거를 제공합니다.

이 연구의 핵심 발견은 LSCI에 의해 정량화된 바에 따라 APP/PS1 형질전환 마우스에서 야생형 대조군에 비해 CBF가 유의미하게 감소한다는 확인입니다. 이 관찰은 AD 발병기전의 특징으로 대뇌 저관류를 입증한 광...

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공개 사항

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저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 베이징 중의학대학교 침술-뜸학과 투이나의 과학연구수양 프로젝트의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
침 바늘(베이징 중옌 태허 메디컬 컴퍼니, 유한회사, 중국0.25 mm & 시간; 13mm침 바늘
레이저 스펙클 대비 영상 시스템유전자 & 과학적이에요. Ltd.무어 FLPI-2
마우스 제압기헝타이 실험실 장비 센터HT-A2
트리브로모에탄올난징 아이베이 생명공학 유한회사;M2910마취

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Wang, X. Alzheimer's disease: Insights into pathology, molecular mechanisms, and therapy. Protein Cell. 16 (2), 83-120 (2025).
  2. Goldsmith, H. S. Alzheimer's disease: A decreased cerebral blood flow to critical intraneuronal elements is the cause. J Alzheimers Dis. 85 (4), 1419-1422 (2021).
  3. Oliver, B., et al. Causes and consequences of baseline cerebral blood flow reductions in Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (7), 1501-1516 (2021).
  4. Cai, M., et al. Electroacupuncture attenuates cognition impairment via anti-neuroinflammation in an Alzheimer's disease animal model. J Neuroinflammation. 16 (1), 264(2019).
  5. Ding, N., et al. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Front Neurosci. 13, 37(2019).
  6. Jafari, C. Z., et al. Effect of vascular structure on laser speckle contrast imaging. Biomed Opt Express. 11 (10), 5826-5841 (2020).
  7. Du, E., et al. Multifunctional laser speckle imaging. Biomed Opt Express. 11 (4), 2007-2016 (2020).
  8. Paul, R., et al. Optimized laser speckle-based imaging system and methods for deep tissue cerebral blood flow imaging in small rodents. Neurophotonics. 12 (2), 025017(2025).
  9. Kazmi, S. M. S., et al. Flux or speed? Examining speckle contrast imaging of vascular flows. Biomed Opt Express. 6 (7), 2588-2608 (2015).
  10. Standard T/CAAM 0002-2020: Names and locations of commonly used acupuncture points for laboratory animals part 3: Mice. , China Association for Acupuncture and Moxibustion. (2020).
  11. Tian, H., et al. Analysis of learning and memory ability in an Alzheimer's disease mouse model using the Morris water maze. J Vis Exp. (152), e60055(2010).
  12. Sun, R. Q., et al. Improvement of electroacupuncture on APP/PS1 transgenic mice in behavioral probably due to reducing deposition of Aβ in hippocampus. Anat Rec (Hoboken). 304 (11), 2521-2530 (2021).
  13. Wang, X., et al. Improvement of electroacupuncture on APP/PS1 transgenic mice in spatial learning and memory probably due to expression of Aβ and LRP1 in hippocampus. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7603975(2016).
  14. Ding, N., et al. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Front Neurosci. 13, 37(2019).
  15. Akshmisha, Y., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer's disease: A review. 3 Biotech. 12 (2), 55(2022).

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