토양 내 뿌리에서 분출된 카복실산의 공간적으로 분리된 샘플링을 위한 폴리아크릴아마이드 ZrOH 하이드로겔

Summary

이 프로토콜에서는 다양한 작물 발달 단계에서 온전한 토양 재배 뿌리에서 뿌리에서 뿌리가 분출된 카복실산을 샘플링하는 비파괴적 현장 내 방법으로 폴리아크릴아마이드 지르코늄 하이드록사이드 하이드로겔(ZrOH 하이드로겔)을 상세히 설명합니다. 또한 이온 크로마토그래피-질량분석법(IC-MS)을 이용한 이들의 국소 매핑 및 정량 작업도 개괄합니다.

Abstract

교란되지 않은 토양 식물 뿌리에서 뿌리 분출물의 샘플링과 신뢰성 있는 정량화는 여전히 도전적입니다. 우리는 또한 리조박스 식물 뿌리에서 분출되는 7가지 카복실산(아코니테이트, 시트레이트, 푸마레이트, 락테이트, 말레이트, 옥살레이트, 숙시네이트)의 샘플링, 2D 매핑 및 정량화를 위한 비파괴 방법을 개발했습니다. 여기서 설명된 방법은 모든 검사된 카복실레이트를 흡수하는 폴리아크릴아마이드 지르코늄 하이드록사이드 하이드로겔(ZrOH 하이드로겔)을 사용하며, 95.3% ± 3.12%에서 111% ± 1.99%까지 효율을 조절할 수 있습니다. ZrOH 하이드로겔은 카복실레이트에 대한 결합 능력이 높으며, 용액의 pH와 카복실레이트 종에 따라 최대 1.82 μmol ^cm-2까지 높으며, 이는 일반적으로 근권에서 얻을 수 있는 농도보다 높습니다. 더불어, ZrOH 하이드로겔에 결합된 카복실산은 안정적이며, 분석 전 4°C에서 몇 주간 보관할 수 있습니다. 적용을 위해 식물은 뿌리 시스템에 최소한의 교란을 주고 쉽게 접근할 수 있도록 토양이 채워진 라이조박스에서 재배됩니다. 뿌리 방출된 카복실레이트를 샘플링하기 위해 ZrOH 하이드로겔을 관심 지역에 24시간 동안 신중하게 도포합니다. ZrOH 하이드로겔을 채취한 후 지도 작성 목적으로 절단하고, 겔 조각을 용출하여 이후 카복실레이트 분석(예: 이온 크로마토그래피-질량분석법)을 사용합니다. 우리의 연구 결과는 ZrOH 하이드로겔이 뿌리권 내 카복실산 농도를 포착하고 측정하는 데 효과적임을 시사합니다. 이 방법의 새로움은 온전한 토양 식물 뿌리에서 뿌리 분출물을 샘플링할 수 있고, 전통적인 방법(토양-수경재배 혼합법)이 종종 파괴적이고 단회 샘플링만 허용하는 것과 달리 시간 분해 샘플링이 가능하다는 점에 있습니다. 무엇보다도, 이 방법은 정량적이고 고해상도의 밀리미터 규모 2D 이미지를 생성할 수 있게 하여 뿌리 축을 따라 카복실레이트 분출물과 뿌리 내 공간적 분포를 시각화할 수 있게 합니다. 또한, 이 방법은 성장 주기 동안 다양한 성장 단계에서 뿌리 분출물을 샘플링하는 것을 용이하게 합니다.

Introduction

식물 뿌리는 뿌리권에 다양한 화합물을 분출하여 물리적, 화학적, 생물^{학적 특성을 형성}합니다. 1. 식물이 비생물적 및 생물학적 스트레스 조건에 노출되면 뿌리 분출이 특히 심각해집니다. 뿌리 분출물은 실제로 영양분/금속 가용성과 동원, 미생물 군집과 활동, 토양 집합체 안정성, 그리고 병원체에 대한 식물의 방어에 직접적이든 간접적이든 영향을 미칠 수 있습니다 ^1,2,3. 가장 중요한 뿌리 분출물 중 하나는 영양분 용해(인(P), 철(Fe), 구리(Cu), 아연(Zn) 포함), 중금속 내성, 그리고 근권^내 유익한 미생물 증진에 중요한 역할을 하기 때문에 카복실산염^입니다.

특히 분출된 카복실산에는 시트레이트, 락테이트, 옥살레이트, 말레이트, 석크산, 푸마레이트 ^6,7,8이 포함됩니다. 예를 들어, 시트레이트는 Fe 또는 알루미늄(Al)(수소)산화물에 결합된 P를 동원하여 P 획득에 중요한 역할을 합니다 ^7,9. 그러나 토양 식물에서 뿌리 분출물을 정확히 샘플링하고 정량화하는 것은 주로 교란되지 않은 토양 뿌리 시스템에 물리적으로 접근하기 어렵고 뿌리 분출물 샘플 확보가 어렵기 때문에 실험적 도전 과제로 남아 있습니다 ^10,11. 또한, 분출된 화합물은 미생물 분해가 빠르게 이루어지며(몇 분에서 몇 시간 이내) ¹² 토양 광물 표면에 강하게 흡착됩니다 ^1,10. 뿌리 분출 연구에서 또 다른 도전 과제는 시간이 지남에 따라 분출물을 모니터링하는 점인데, 대부분의 수집 방법은 뿌리를 교란하거나 토양에서 재배한 식물을 수확해야 하므로 동일한 뿌리를 다시 평가하기 어렵기 때문입니다 ^1,11. 따라서 뿌리 분출물의 정확한 샘플링, 정량화 및 모니터링은 공간적 변화를 포착하고 식물 성장 중 반복적인 샘플링을 용이하게 하는 기법이 필요합니다¹¹.

본 연구에서는 Tiziani 등이 처음에 시트레이트를 위해 개발한 비파괴 현장 측정법을 제시하^였으며, 현재는 더 정제되어 샘플링, 정밀한 공간 위치 파악, 그리고 온전한 식물 근원에서 토양에서 재배된 식물 뿌리에서 분출되는 6개의 추가 카복실산(아코니테이트, 푸마레이트, 락테이트, 말레이트, 옥살레이트, 숙시네이트)의 정량화에 적용되었습니다. 이 방법은 뿌리 분^{출물을 샘플}링하기 위해 지르코늄 하이드록사이드 기반 폴리아크릴아마이드 하이드로겔(ZrOH 하이드로겔)을 사용합니다. ZrOH 하이드로겔은 음이온(카복실레이트 포함)에 강한 결합 능력을 보이며, 쉽게 용출될 수 있습니다 12,13,14. ZrOH 하이드로겔은 (1) 뿌리 시스템에 하이드로겔을 단순히 뿌리 시스템에 배치하여 근부 카복실산을 샘플링할 수 있게 하며, (2) 결합된 카복실산을 최소 6주간 미생물 광화로부터 효과적으로 보호하며, (3) 겔에 결합한 후에도 뿌리권 내 카복실산의 공간적 분포가 보존되며, (4) 밀 스케일 2D 카복실산염 지도화가 가능하다 ¹².

뿌리 분출물 샘플링 기법은 토양 기반 기법(뿌리 세척 또는 토양-수경재배 하이브리드, 토양-뿌리 분출물 수집기(SOIL-REC) 장치, 마이크로 흡착컵, 여과지/한천 시트, 분비물 트랩, RHIZOtest 기법)과 수경재배 삼출물 샘플링 방법으로 분류됩니다. 뿌리 세척 또는 토양-수경재배 하이브리드 방법은 식물 전체를 토양에서 신중하게 제거하고 뿌리 시스템을 세척한 후 샘플링 용액에 담가 뿌리 분출물¹⁵를 수집하는 방식을 포함합니다. 간단하기 때문에 토양 식물에서 분출물을 채취하는 가장 널리 사용되는 방법입니다. 하지만 뿌리를 토양에서 추출하는 것은 뿌리털과 더 가는 뿌리가 손실될 위험이 있습니다. 더불어, 뿌리의 철저한 청소가 필요하며, 이는 뿌리 손상을 초래하고 뿌리 분출물의 질과 양을 저하시켜 시간 분석 샘플 링을 불가능하게 합니다 ^8,11. SOIL-REC 방법은 두 개의 다공성 나일론 망(≤ 30 μm) 사이에서 뿌리가 자라는 특수 설계된 라이조박스 시스템에서 식물을 재배하고, 뿌리 분출물^{수집 도구를 사용}해 뿌리 분출물을 수집하는 방식을 포함^{합니다. 이} 방법은 뿌리 시스템을 보존하고 토양 오염을 최소화하며, 뿌리 분출물을 반복적으로 수집할 수 있게 합니다. 하지만 복잡한 구성(복제 횟수가 적음), 샘플링에 사용되는 대량 분출물로 인한 희석이 더 많고, 재현성이 어렵고⁸번 복제 간에 큰 차이가 있어 최적화가 여전히 필요합니다.

주변 용액과 평형을 이룰 수 있는 작은 수지 조각, 한천 젤 시트 또는 필터 페이퍼를 적용하거나, 접근성 있는 온전한 토양 자란 근의 뿌리 구간에 분출물을 흡착시키는 방법(즉, 라이조박스 또는 뿌리 창을 이용)^18,19. 이 방법은 시간 분해 샘플링과 국소 분출물 조성의 부분 측정을 가능하게 하지만, 공간 해상도는 낮다. 반면, 미생물 광물화로 인한 인위적 현상에 취약하고 다루기가 번거롭다. 마찬가지로, 개별 뿌리 분출물을 샘플링하는 데 사용되며, 단일 뿌리를 수평 측면 방에 가두고, 밀봉된 페르스펙스 링에 샘플링 용액을 국소적으로 배치한다⁸. 이 방법은 수경재배와 토양 재배 뿌리 모두에 적용할 수 있으며, 국지적 샘플링을 가능하게 한다¹². 그러나 적은 양을 수집하고, 시간 분해 샘플링은 거의 불가능하며, 개별 뿌리를 분리하는 것은 기계적 스트레스에 취약하여 뿌리 대사와 분출에 영향을 줄 수 있다⁸. 마이크로 흡착컵은 근권에서 토양 용액을 수집하는 데 사용되며, 토양 자란 뿌리에서 현장 샘플링이 가능하다 ²⁰. 그러나 소량 채취되고 샘플링은 부분적으로 시간 분해되며, 분출물은 흡착과 미생물 분해에 취약하다¹⁶. RHIZOtest 기술은 뿌리를 작은 원통형에서 수경재배하여 바닥에 30 μm 나일론 메시로 덮은 뒤 토양 디스크로 옮겨 뿌리^{와 토양} 8,21,22 사이의 용질 교환을 가능하게 하는 방식입니다. 뿌리 매트를 샘플링 용액에 담그면서 분출물을 수집합니다. 이 방법은 뿌리와 토양과의 접촉을 유지하지만 인공 성장 조건을 사용합니다. 단기 실험에 한정되며 시간 분해 샘플링이 없습니다. 이 방법 중 공간 분출 패턴을 결정하기 위해 사용할 수 있는 방법은 수지, 한천 젤 시트, 여과지, 분출 트랩, 마이크로 흡착컵뿐입니다.

수경재배 삼출물 샘플링 방법은 수경재배와 반수경재배 기법을 포함합니다. 수경재배는 뿌리 분출물을 수집하는 데 자주 사용되는 방법으로, 식물을 영양액에서 재배한 후 샘플링 용액(H₂O, CaSO₄, CaCl₂, micropur)으로 대체하여 삼출물 샘플을 얻습니다^15,23. 이 방법은 간단하며 뿌리에 가해지는 기계적 스트레스를 최소화합니다. 재현성이 높고 필요 시 멸균되어 뿌리 분출물의 질이 향상되고 시간 측정 샘플링이 가능해 ^5,16. 그럼에도 불구하고, 이는 식물 생리학, 형태(예: 뿌리 털 발달), 뿌리 분출 과정을 변화시킬 수 있는 매우 인공적인 시스템입니다 ^6,15. 반수경재배에서는 식물을 유리 구슬, 모래 또는 버미큘라이트 위에 지속적으로 스콜레이팅하는 영양액과 함께 재배하며, 분출물을 스콜레이팅 용액에 수집합니다 ^8,18. 이 방법은 수경재배에 비해 약간 덜 인위적이며 시간 측정 샘플링이 가능합니다. 하지만 시스템은 거의 완전히 수분에 포화되어 있어 부분적으로 혐기성 조건에 견딜 수 있는 식물이 필요합니다.

다른 접근법과 비교할 때, ZrOH 하이드로겔 방법은 여러 가지 장점을 제공합니다. ZrOH 하이드로겔은 토양 재배(자연 조건에 가까운 상태)에서 뿌리 분출물을 샘플링할 수 있으면서 뿌리계에 미치는 영향을 최소화하고, 식물의 생애 주기 동안 시간 측정 샘플링이 가능하며, 미생물 분해 감소와 높은 카복실산 결합 능력 덕분에 24시간 이상 뿌리 분출물을 수집할 수 있습니다¹². 또한, 하이드로겔을 샘플링/보존하는 데 필요한 바이오사이드(예: 마이크로퍼, NaN₃)는 필요하지 않으며, 이는 장기적으로 분석 기기에 영향을 미치고 화학 분석에 방해가 될 수 있습니다. 이는 카복실산이 ZrOH 하이드로겔에 화학적으로 결합되어 있기 때문입니다. 또한 샘플은 분석 전 몇 주에서 몇 달 동안 보관할 수 있어, 하나의^{실험 환경에서 많은} 샘플을 수집할 수 있으며, 이는 하이드로겔 ^24,25의 Zr의 항균 특성 때문일 수 있습니다. 또한 ZrOH 하이드로겔은 뿌리권 내 분출 화합물 및 기타 음이온을 2D 밀리미터 해상도로 매핑할 수 있게 하며, 전체 뿌리 시스템 12,14,26을 샘플링할 수 있습니다. ZrOH 하이드로겔은 냉장 내 저장 공간(4 °C)이 적으며, 이는 일반적으로 냉동고(-20 °C)에 보관되는 고전적 방법의 대용량에 비해 적습니다. 주요 제약은 공기 방울이 거의 없거나 전혀 없는 고품질 ZrOH 하이드로겔을 생산하는 데 익숙해지는 것과, 리조박스가 인공 재배 환경 시스템이라는 점입니다. 또 다른 한계는 이 방법이 7가지 카복실산(아코니테이트, 시트레이트, 푸마레이트, 락테이트, 말레이트, 숙시네이트, 옥살레이트)¹², 설폰아마이드(설파디아진, 설파메타진, 설파클로로피리다진, 클린다마이신)²⁷, 무기 음이온(P, V-바나듐, As-비소, 세-셀레늄, 모-몰리브덴, Sb-안티몬의 황화물과 옥시아니온)14,26,28,29)에 대해서만 개발되었다는 점입니다. ZrOH 하이드로겔은 부유 입자 시약인 이미노디아세트산과 함께 사용되어 리조스피어^{28, 29, 30}에서 양이온(Al, Fe, Ca-칼슘, Mg-마그네슘, Mn-망간, Ni-니켈, Zn-아연)을 현장 샘플링과 매핑하는 데 사용되었습니다.

여기서는 토양 자란 근간계에서 카복실산을 시간 및 공간적으로 분해한 현장 샘플링을 가능하게 하는 ZrOH 하이드로겔 기반 방법도 제공합니다. ZrOH 하이드로겔 기법을 이용한 뿌리 분출물의 샘플링 및 2D 매핑을 포함한 라이조박스 실험 수행 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 이 실험은 하이드로겔 준비, 리조박스 충전, 식물 재배, 하이드로겔 적용, 회수 및 절단, 하이드로겔에서의 카복실산 용출 및 분석, 그리고 이어서 2D 이미지 생성을 포함합니다. 또한 이온 크로마토그래피-질량분석법(IC-MS)을 이용한 카복실레이트 분석과 같은 중요한 단계에 대한 노트도 제공합니다.

Protocol

1. ZrOH 하이드로겔 제제

참고: 겔 준비를 위해서는 오염을 방지하기 위해 깨끗한 환경과 재료가 필요합니다. 용액 준비, 젤 세척, 품질 보증을 위한 수화 공급은 실험실 1급 물(≤18 MΩ·cm)만 사용하십시오. 하이드로겔 준비를 시작하기 전에 독성 폐기물(액체 및 고체)이 이미 후드에 배치되어 있는지 확인하세요. 젤 준비를 시작하기 전에 오븐을 약 42–45 °C로 1시간 동안 예열하세요. 재료 및 화학물질에 대한 자세한 내용은 재료표에 나와 있습니다.

1. 유리 조립 준비
   1. 10% (w/v) HNO₃ 산성 욕조를 준비하는데, 65% HNO₃ 153.8 mL를 실험실용 1급 물 846.2mL에 흡기 후드에서 첨가합니다.
   2. 유리판(6.1 x 17cm), 핀셋, 테플론 U자형 스페이서(0.25mm 또는 0.4mm), 플라스틱 클립을 산성 욕조에 최소 4시간 담가세요.
   3. 유리판, 핀셋, 플라스틱 클립, 테플론 스페이서를 산성 욕조에서 꺼내고, 실험실 1등급 물로 최소 세 번 세척하세요. 그 후 층류 또는 청소 작업대에서 완전히 자연 건조시키세요.
      참고: 유리판은 젤 준비와 같은 날 준비해야 하며, 오염을 최소화하기 위해 종이로 건조하지 않도록 주의해야 합니다.
   4. "U"자 모양 스페이서를 건조 유리판에 올려놓고 두 번째 스페이서를 추가한 뒤 클립으로 고정합니다. 피펫팅을 쉽게 하기 위해 유리판을 약 ~~1mm 정도 오프셋하세요( 그림 1A 참조).
   5. 젤 용액을 주조하기 전에 유리판 조립체를 필름 후드 아래 깨끗한 플라스틱 호일 위에 올려놓으세요.
2. 폴리아크릴아마이드 젤 제제³¹
   1. 젤 용액: 15 mL 확산 구배 박막(DGT) 겔 가교차 결합체를 47.5 mL 실험실용 I 물과 깨끗한 플라스틱 바이알에 혼합하여 100 mL 젤 용액을 준비한 후, 37.5 mL 아크릴아마이드 용액(40%)을 추가합니다. 각 용액을 추가할 때마다 혼합물을 충분히 저어줍니다. 젤 용액은 냉장고(4 °C)에서 최소 3개월 이상 보관할 수 있습니다.
      참고: 각 용액의 정확한 양을 피펫/계량하며, 비스-아크릴아마이드가 아닌 아크릴아마이드 용액만 사용하세요. 비스-아크릴아마이드는 2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(MES) 완충제에 넣으면 부드러운 젤이 생성됩니다.
   2. 0.1g APS를 1g_{H 2 O}에 녹여 10% (w/v) 과황산암모늄(APS) 용액을 준비합니다. 매일 신선하게 준비하고 사용 전에 완전히 용해되도록 하세요.
   3. 젤 칵테일을 준비한 후 4 mL 젤 용액과 28 μL 10% APS를 혼합한 후, 깨끗한 플라스틱 바이알에 10 μL 99% N,N,N'N'--테트라메틸레틸레넬디아민(TEMED)을 첨가합니다. 각 용액을 추가한 후 혼합하세요. 혼합물이 빠르게 중합되므로 최대 3개의 젤을 준비할 수 있습니다. 칵테일의 부피는 사용할 플레이트와 스페이서 크기에 따라 조절할 수 있습니다.
      참고: 다양한 시약을 혼합할 때 기포와 거품을 피하세요.
   4. 그림 1B, C²⁶에 나타난 대로 유리판 조립체 중앙에서 젤 혼합물을 천천히 피펫으로 옮기세요. 기포가 있을 경우, 유리 조립체를 부드럽게 기울이거나 펜으로 유리판을 두드려 제거하세요.
      참고: 기포 없는 젤을 얻으려면 긁힌 유리판을 피하고 사용 후에는 산성 욕조에 보관하며, 폴리에틸렌 봉지에 보관하지 말고 다음 사용 전에만 세척하세요. 1 mL 또는 5 mL 피펫에 작은 팁을 달아 젤을 주조하고, 중앙에서 천천히 넣어 플레이트를 45° 각도로 기울인 채 고르게 퍼지게 하세요.
   5. 조립체를 예열된 오븐에 넣고 최소 1시간 동안 42−46 °C에서 젤이 완전히 굳도록 유지하세요(액체가 떨어지지 않도록).
   6. 깨끗하고 녹이 없는 면도날을 이용해 조립체를 부드럽게 지렛대에서 밀고, 실험실에서 쓰는 1급 물(그림 1D–F)에 담긴 세척용 물로 유리판에서 젤을 씻어내세요. 젤을 쉽게 제거하려면, 몇 분간 물에 담갔다가 실험실용 1급 물이 담긴 1-L 비커에 씻어내세요.
      참고: 핀셋으로 젤을 당기는 것은 플레이트에 달라붙을 수 있으니 피해야 합니다. 이로 인해 젤이 변형될 수 있습니다. 중합 후에는 겉으로 보이는 기포가 젤 내부가 아니라 젤과 유리판 사이에 위치하며, 플레이트를 제거하면 이 기포가 명확해집니다.
   7. 수화 후 24시간 이내(준비 후 2시간 간격으로) 물을 최소 3–4번 교체하여 남은 중합 화학물질을 씻어내세요. 수화 과정에서 물을 반복적으로 교체함으로써 반응하지 않은 시약과 같은 불순물이 확산되고 pH가 낮아져 겔 내 전하 축적을 방지합니다.
   8. 젤을 실험실 1등급 물(약 24시간 단기간 동안) 또는 0.01 mol ^L-1 NaCl 또는 NaNO₃ 을 냉장고(4 °C)에 보관하세요. 젤 시트가 즉시 ZrOH 침전에 사용되지 않을 경우에는 이 젤들은 NaCl에 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
      참고: 세척 중 오염을 최소화하기 위해 중합 직후 겔을 침전시키는 것을 권장합니다.
3. ZrOH 겔¹⁴의 침전
   1. 250mL 플라스틱 비커에 실험실용 1등급 물 40mL에 3.22g의 지르코늄 디클로라이드 옥타하이드레이트(ZrOCl 2.8H_2O)를 녹입니다.
   2. 최대 4개의 젤 시트를 놓고 최대 100 mL까지 채우세요. 또는 실험실용 1급 물 20 mL에 ZrOCl_{2.8H 2}O 1.66 g 녹인 후 젤 2개를 넣고 최대 50 mL까지 채우세요.
   3. 젤 시트를 최소 2시간 동안 담가서 젤 내 Zr 분포를 고르게 하세요.
   4. 각 젤을 pH 6.7(pH 1 ^L-1 NaOH로 조절)에서 완충된 0.05몰 ^L-1 2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(MES) 100mL에 옮겨 침전시킵니다. 고르게 침전되도록 첫 30-60초 동안 핀셋으로 젤을 부드럽게 저어줍니다.
   5. 플레이트 셰이커에서 ≤100rpm으로 40분간 부드럽게 흔들어 젤에 Zr(OH)₄ 가 완전히 침전되도록 합니다.
      참고: 젤이 서로 달라붙는 것을 방지하기 위해 느린 흔들기 속도가 선호됩니다.
   6. 겔을 실험실에서 사용하는 1등급 물에 1−2리터 비커에 24시간 동안 넣어 클^라이 온을 제거하고, 2시간 간격으로^최소 3회 물을 교환합니다. 클^라이 온의 완전한 제거는 헹구액의 전도도를 측정하거나 염화물 시험을 수행하여 확인할 수 있습니다.
   7. 젤은 0.03 mol ^L-1 NaNO₃ 또는 NaCl에 보관되지만, 질산염은 토양 미생물 활동을 빠르게 촉진하고 주요 식물 영양분이기도 하므로 토양 실험에서는 NaCl이 선호됩니다^13,32.
   8. ZrOH 하이드로겔은 최대 60주(4°C 냉장고에 보관)까지 시험되었으며, 특성과 우수한 성능을 유지하는 것으로 나타났습니다(목표 가치의 ±10%)³².
4. 젤 커팅
   1. 긁힘 없는 플렉시글라스 플레이트, 핀셋, 그리고 해슬하지 않은 날카로운 면도날을 깨끗이 닦으세요. 플렉시글라스 플레이트가 없을 때는 두껍고 튼튼한 유리판을 사용할 수 있습니다.
   2. 플렉시글라스 플레이트를 실험실용 1급 물로 적셔 ZrOH 하이드로겔 시트를 확산시키세요.
   3. ZrOH 하이드로겔 시트를 핀셋으로 플렉시글라스 플레이트 위에 펴고, 기포가 없도록 평평하게 눕히세요. 시트에 구멍이 있는 부분을 식별하세요; 절단 시 이 부위는 피해야 합니다.
   4. 날카로운 면도날로 ZrOH 하이드로겔 시트를 원하는 크기로 정밀하게 자릅니다. 절단 후 플레이트에서 물을 제거하면 잘린 부분을 명확히 볼 수 있습니다.
      참고: 2D 매핑을 위해 측면을 더 쉽게 식별하기 위해, ZrOH 하이드로겔 조각을 직각의 사다리꼴로 잘라내고 가장 긴 면이 왼쪽 위에 위치하도록 권장합니다.
   5. ZrOH 하이드로겔은 실험실 1등급 물(단기 보관 및 젤 도포 직전) 또는 0.03 mol ^L-1 NaNO₃/NaCl에 보관하여 장기 보관(>24시간)을 보관하세요.

2. 라이조박스 실험 설정

참고: 식물은 토양이 채워진 라이조박스에서 재배되며, 디자인이 다양합니다. 물을 주고 균일한 물 분배를 위해 바닥이나 뒤쪽에 구멍이 있는 라이조박스 사용을 권장합니다( 보조 그림 1 참조). 재료와 화학물질에 대한 자세한 내용은 재료표에 나와 있습니다.

1. 라이조박스 충전 및 수분 보유 용량 결정²⁶
   1. 2mm 체로 자연 건조 토양을 체로 체를 내고 토양을 균질화합니다. 중간 질감의 토양을 권장하지만, 특정 취급 기법(예: 리조박스, 채우기, 개봉, 물 주기)이 있다면 모래나 점토 토양도 사용할 수 있습니다.
   2. 라이조박스의 모든 부품(비어 있음)과 클램프, 플라스틱 호일을 함께 무게로 재고 무게를 기록합니다( 보충 그림 2C 참조). 수분 보유 용량(WHC)을 결정하는 데 필요한 개수에 2–3개의 추가 라이조박스를 추가합니다.
   3. 라이조박스를 채우기 위해 필요한 건조 토양의 질량을 추정합니다. 일반적으로 라이조박스는 상단에서 최대 2cm까지 채웁니다. 권장 벌크 밀도는 약 1.0–1.4 g ^cm-3입니다.
   4. 라이조박스의 종류와 취급의 편리성에 따라 건조한 토양을 조심스럽게 채우세요. 채우는 동안과 후에는 평평한 판으로 다져지지 않고 평탄하게 다질 수 있습니다. 약간 촉촉한 토양을 사용해 리조박스를 채우는 것도 가능하며, 특히 미세하거나 점토질이 많은 토양의 경우 토양 구조를 유지할 수 있습니다(자세한 설명은 Wagner et ^al.26 참조).
   5. 또는 리조박스가 위에서 채워진 경우, 플라스틱 호일을 리조박스에 고정하고 앞판으로 덮은 후 클램프로 고정합니다( 보충 그림 2A–D 참조).
   6. 편의를 위해 충전 과정에서 핵공막을 설치하고 표면에 평평하게 놓이도록 하세요. 근원 분출물을 샘플링할 때는 핵공 막이 필요합니다.
   7. 토양으로 채워진 라이조박스의 무게와 클램프를 함께 기록하세요. 빈 라이조박스의 무게를 토양으로 채운 라이조박스의 무게를 빼서 각 라이조박스의 건조 토양(m미터_{건조 토양})을 계산한 후 무게를 기록합니다.
   8. 수분 보유 용량은 먼저 라이조박스를 탈이온수로 포화시키고 ~8시간 동안 배수하도록 하여 결정합니다. 라이조박스를 무게 측정하고, 2.1.7단계에서 기록된 토양 채워진 라이조박스 무게를 현재 무게에서 빼서 물 질량(m_w)을 계산합니다. 그 다음 mw를_{m로 나}누어 WHC (g ^g-1)를 결정하는데, 그 결과는 비율입니다.
      참고: 실제 매핑에 WHC 결정에 사용되는 리조박스는 사용하지 마세요. 수분 포화가 혐기증을 유발하여 산화환원 인공물을 유발할 수 있기 때문입니다.
   9. 대부분의 식물이 성장하는 동안 최적의 수분 함량은 토양 유형과 식물 종에 따라 50%−60% WHC(즉, WHC 계수, f_WHC = 0.5−0.6)로 유지되어야 합니다. 각 리조박스에 추가해야 할 물(m_{w add})을 다음과 같이 추정하세요: m_{w add} = WHC x f_{WHC x m 건조한 토양.}
   10. 심기 전에 _{mw를 첨가}물로 뿌리상자에 물을 주세요. 구멍을 통해 물을 준다면, 표면에 5-10mL의 물을 추가하세요.
   11. 식물 성장 중 식물에 물을 주는 데 필요한 물주기 뿌리상자의 질량을 기록하세요.
2. 식물 재배 및 관리^12,26
   1. 발아나 심기 전에 씨앗을 멸균하세요. 일반적인 방법은 곰팡이 성장을 막기 위해 70% 에탄올에 3분간 담근 후 1% NaClO에 15분간 넣는 것입니다. 그 후 씨앗을 탈이온수(약 6–7회)로 헹구세요.
   2. 씨앗을 필터 페이퍼나 발아 롤 사이에 미리 발아시키고, 물 또는 0.05 mmol L⁻¹ CaSO₄ 에 적셔서 근처가 나올 때까지 진행합니다.
   3. 각 라이조박스에 묘목 한 개씩을 옮겨 앞 플레이트 가까이에 놓고, 흙을 조금 덮은 뒤 물을 조금 넣으세요.
   4. 라이조박스를 알루미늄 호일로 감싸 뿌리권 내 광화학 환원을 방지하고, 조류 및 기타 광합성 미생물의 성장을 방지하며, 빛에 노출될 때 뿌리에 스트레스를 주는 것을 방지하세요. 또는 빛이 통과하지 못하게 하는 검은색 전면 플레이트도 있어 알루미늄 호일 대신 사용할 수 있습니다.
   5. 라이조박스를 선반에 올려 성장실이나 온실에서 온도, 상대습도, 빛 강도를 조절한 상태로 기울이도록 하세요. 25°−35°의 기울기를 권장합니다.
   6. 식물의 필요에 따라 최소 주 2–3회 중력 측정 방식으로 라이조박스에 물을 줍니다. 이는 라이조박스의 무게를 측정하여 1.2.11 단계에서 기록된 무게 차이를 보완하기 위해 물을 추가하는 방식으로 이루어집니다. 하지만 식물의 바이오매스가 상당히 높고 물 수요가 증가할 때는 바이오매스를 고려하여 물량을 조절해야 합니다.
   7. 특정 작물 관리 관행(예: 비료)은 실험 환경, 토양 특성, 재배 식물 종, 그리고 식물 성장 중 질병 및 해충 방제에 대한 주요 필요에 따라 수행됩니다.
   8. 성장 기간과 뿌리 삼출물 샘플링은 주로 리저박스의 크기, 식물 종, 그리고 연구 목적에 따라 달라집니다.

3. 근 삼출물 샘플링 ^12,26

참고: 여기서는 뿌리 삼출물의 비파괴 샘플링에 관한 세부 정보를 제공합니다. 샘플링 전에 필요한 모든 재료가 준비되어 있고, 실험용 빈 샘플도 샘플링 중에 포함되어야 합니다. 재료와 화학물질에 대한 세부 사항은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 샘플링 최소 2시간 전, 또는 하루 또는 최소 2시간 전부터 뿌리상자의 수분 함량을 90%−95% WHC(산소 스트레스에 민감한 작물의 경우 80%)로 천천히 끌어올립니다. 이는 먼저 2.1.9단계에서 90%−95% WHC를 사용해 추가할 물량(m_{w add})을 계산한 후, 리조박스의 총 무게, 습한 토양, 식물 무게 추정치를 재계산함으로써 정확하게 달성할 수 있습니다. 균형을 사용해 리조박스가 재계산된 무게에 도달할 때까지 탈이온수를 추가합니다.
2. 리조박스에서 알루미늄 포일을 풀고, 관심 있는 영역을 전면 판에 표시해 그립니다. 이 단계는 뿌리 구간이나 어린 식물만 샘플링할 때만 필요합니다.
3. 플라스틱 호일과 ZrOH 하이드로겔(1.3단계 참조)을 관심 영역과 라이조박스 크기에 따라 지정된 크기로 절단합니다. 충전 과정에서 핵포어 막이 설치되지 않았다면, ZrOH 하이드로겔보다 약간 더 큰 원하는 크기로 절단합니다.
4. 리조박스를 평평한 받침대 위에 올려놓고 앞판을 위로 향하게 한 뒤 조심스럽게 열어보세요( 그림 2A 참조). 뿌리와 흙이 손상되지 않도록 하면서 천천히 플라스틱 호일을 제거하세요.
5. 관심 지역에 자를 위치시키고 고해상도 사진을 촬영하며, 이는 이후 데이터 처리에 필요합니다. 자는 처리 중 이미지를 직접 보고 정확한 크기를 판단하는 기준 역할을 하며, 특히 많은 리조박스를 샘플링해야 할 때 더욱 그렇습니다.
6. 표적 뿌리 부위에 소량의 물을 첨가하여 표면에 얇은 수막이 형성되도록 합니다( 그림 2B 참조). 토양의 더 높은 수분 함량(선호되는 90%–95% WHC 또는 산소 스트레스에 민감한 작물의 경우 80%)이 샘플링 시 토양-젤 접촉을 원활하게 합니다. 더 높은 수분 함량은 분자가 하이드로겔에 지속적으로 흐르도록 하는 데 필요합니다.
7. 미리 잘린 핵구멍 막을 관심 토양 표면/뿌리 영역에 직접 놓고, 토양-뿌리 경계면에 평평하게 놓이도록 하세요( 그림 2C 참조).
8. ZrOH 하이드로겔을 관심 영역의 핵공 막에 직접 평평하게 놓고, ZrOH 하이드로겔 왼쪽에 놓인 자와 함께 사진을 찍습니다( 그림 2D 참조). 자는 ZrOH 하이드로겔의 크기를 결정하는 데 도움을 주며, 샘플링 중 특성 변화가 있을 경우 샘플 영역을 파악하며, 장기간 보관(>1년) 동안 면을 식별할 수 있습니다.
9. ZrOH 하이드로겔을 앞판에 덮어 보호하려면 플라스틱 호일을 ZrOH 하이드로겔 위에 덮어줍니다( 그림 2D 참조).
10. ZrOH 하이드로겔의 이동을 줄이기 위해 라이조박스를 부드럽게 닫으세요. 라이조박스를 닫을 때 ZrOH 하이드로겔의 이동을 최소화하려면, Wagner 등(²⁶)이 설명한 바와 같이 젤 샌드위치(뉴클포어 막 + ZrOH 하이드로겔 + 플라스틱 호일)를 비닐 전기 테이프로 리조박스의 깨끗한 전면 판에 부착하는 방법도 있습니다.
11. 다시 알루미늄 호일로 리조박스를 감싸고 24시간 동안 성장실/온실에 넣으세요. 뿌리 분출물은 젤이 건조하지 않는 한, 실험 환경과 연구 목적에 따라 더 오래 또는 짧은 시간 동안 채취할 수 있습니다.
12. 적용 기간이 끝난 후, 리조박스를 부드럽게 열고 테이프와 멤브레인을 조심스럽게 제거한 후 하이드로겔을 꺼내세요. 하이드로겔을 멸균 밀폐 백에 넣고, 닫기 전에 몇 방울의 물을 넣은 후 냉장고(4 °C)에 보관하여 분석이 완료됩니다. 빈 젤은 대조군과 유사한 방식으로 보관하세요. 2D 매핑을 위해 ZrOH 하이드로겔과 플라스틱 시트를 함께 들어 올리고 상단에 표시를 하세요.
13. 시간 해상도 실험이 수행되지 않았다면 뿌리의 형태학적 매개변수, 신선한 중량, 건조 중량을 결정하여 분출물 데이터 정규화를 수행합니다.
14. 시간 측정 연구가 이루어진다면 리저박스를 닫고 기후 챔버나 온실에 다시 넣으세요.

4. 카복실산염의 용출 및 측정¹²

참고: 블랭크 및 표준 물질을 준비할 때는 신선한 실험실 1등급 물과 고순도 분석 기준이 필요합니다. 품질 보증을 위해 인증된 품질 관리 기준을 사용해야 합니다. 분석 전에 0.2 μm 또는 0.45 μm 나일론 필터를 통해 샘플을 여과하여 튜빙 막힘을 방지하여 용액(샘플 및 표준)에 입자가 없는지 확인하세요. 재료 및 화학물질에 대한 자세한 내용은 재료표에 기재되어 있습니다.

1. 냉장고에서 충전된 빈 ZrOH 하이드로겔을 꺼내 자로 치수를 측정한 후, 0.25mm 스페이서의 경우 0.4mm, 0.4mm 스페이서의 경우 0.64mm 두께로 각 부피를 계산합니다. 2D 매핑을 위해서는 깨끗한 면도날을 사용해 ZrOH 하이드로겔을 원하는 크기로 잘라내세요. 작은 조각을 자르고 적절한 용출량을 다루기 어려워 하한선은 약 2 x 2 mm임을 유념하세요.
   참고: 자 대신 자르는 플렉시글라스 플레이트 한쪽 면에 그래프지(밀리미터 그래프 페이퍼)를 사용해 ZrOH 하이드로겔을 거의 완벽한 조각으로 자르기 쉽게 합니다. ZrOH 하이드로겔의 두께는 베르니어 캘리퍼스로 확인되었습니다.
2. ZrOH 하이드로겔 또는 ZrOH 하이드로겔 조각을 플라스틱 바이알에 넣고, 0.5mol ^L-1 NaOH를 0.196^{cm 당} 0.196 cm 3 ZrOH 하이드로겔 비율에 따라 용출한 후 150rpm 속도로 24시간 동안 접시 셰이커에서 흔듭니다.
3. 용출량이 매우 작은(예: 2 x 2 mm) ZrOH 하이드로겔 조각의 경우, 실험실에서 1등급 물을 무게 단위로 추가하여 카복실산염 정량에 사용되는 분석 방법에 필요한 최소 부피에 따라 45-60 μL까지 만듭니다(예: IC-MS는 기기에 따라 오토샘플러에 최소 45 μL 샘플이 필요합니다). 부피를 45-60 μL로 만들기 위해 정확한 물 양을 기록하세요. 이는 희석 계수와 실제 농도 계산에 필요합니다.
4. 샘플을 여과(0.2 μm 또는 0.45 μm 나일론 필터)하여 바이알로 옮깁니다. 1.5 mL 플라스틱 IC 바이알 사용이 가능하므로 파손 없이 냉동할 수 있습니다. 330 μL 바이알도 소용량에 사용할 수 있으나, 기포가 없도록 주의해야 합니다.
5. 선호하는 분석 방법(예: IC-MS, HPLC)으로 용출액 내 카복실산염을 정량합니다. IC와 MS 검출을 결합하여 분리하는 것을 권장합니다. 또는 고성능 또는 초고성능 액체 크로마토그래피(HPLC 또는 UHPLC)를 첨단 MS(예: 시간-비행 또는 Orbitrap)나 분광광도 검출기와 결합하여 사용할 수 있습니다.
6. 측정이 끝나면 샘플과 표준체를 냉동고에 보관할 수 있습니다. 카복실산염이 포함된 모든 용액은 최대 1년간 -20°C에서 보관할 것을 권장합니다. 1년 이상 보관 기간이 길 경우, 품질 검사를 위해 신선한 표준 제도를 준비하고 측정할 수 있습니다.
7. 각 카복실레이트의 총 양을 엘루에이트 전체 부피(즉, NaOH 부피 + 하이드로겔 부피 + 첨가수)에서 계산하고, 뿌리 무게 또는 뿌리 면적으로 정규화한 후 용출 효율 계수를 곱합니다: 아코니테이트 0.94, 시트레이트 1.00, 푸마레이트 0.90, 락테이트 1.02, 말레이트 1.05, 옥살레이트 0.91, 셥시네이트 1.00( 보충표 1 참조). 희석 인자가 사용되었는지 반드시 고려하세요.

5. 2차원 매핑

참고: 분출물 데이터의 2D 이미지를 생성하는 전용 소프트웨어는 없습니다. 매핑은 Microsoft Excel과 Python으로 수행할 수 있습니다.

1. 각 젤 조각에서 4.7단계에서 얻은 데이터를 2D 격자(행 x 열) 내 해당 셀에 삽입합니다. 그리드는 샘플링 중 뿌리에서 촬영한 사진 위에 생성됩니다(4.1단계 참조).
2. 격자의 크기를 정의하고 데이터가 일치하는지 확인하세요.
3. 색상 척도를 선택하고 가장 낮은 값과 최고 값을 나타내는 색상 코드를 지정하세요.
4. 전례의 수치 데이터 범위를 지정하여 선택한 척도와 정확히 일치하는지 확인하세요.
5. 히트맵을 만들고 라벨이나 격자선이 없는지 확인하세요. 히트맵은 보조 파일 1에 제공된 예시 R 스크립트를 사용해 R 소프트웨어에서 쉽게 만들 수 있습니다.
6. 이미지를 처리하여 샘플링 중 얻은 뿌리 사진 옆에 위치시켜 카복실레이트의 공간적 분포를 해석할 수 있도록 합니다.
   참고: 오늘날에는 인공지능 도구를 사용해 매핑도 수행할 수 있습니다. 절차는 간단합니다: 엑셀에서 숫자 그리드를 복사해 채팅에 붙여넣기만 하고, 원하는 젤 조각 크기와 색상 척도가 포함된 히트맵을 요청하면 됩니다. 첫 시도에서 출력이 항상 완벽하지는 않을 수 있지만, 반복 과정이 보통 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 수동 방법보다 훨씬 빠르다는 장점이 있습니다.

Results

ZrOH 하이드로겔 방법은 처음에 토양 식물 뿌리에서 시트레이트 샘플링을 위해 개발되었으며, 분출물¹¹의 공간적 분포를 성공적으로 분해하는 데 사용되었습니다. 이 방법을 다른 카복실산에 적용하기 전에, 우리는 ZrOH 하이드로겔이 다른 카복실산과 함께 사용될 수 있는지 규명했습니다(보충표 1 참조). 또한, 2019년에 실시된 리조박스 실험에서 생성된 적재된 저장 ZrOH 하이드로겔을 용출하고 분석했습니다. ZrOH 하이드로겔은 Tiziani 등(1 mL, 0.5 mol ^L-1 NaOH)이 설정한 동일한 용출 매개변수를 사용하여 아코니테이트, 시트레이트, 푸마레이트, 락테이트, 말레이트, 옥살레이트, 석신산염에 대해 5시간 이내에 적재량의 100%를 흡수할 수 ^{있습니다(~}0.2 μmol, 10 mL). ZrOH 하이드로겔은 최대 3.29 μmol ^cm-2 ± 0.40 μmol ^cm-2의 카복실레이트에 결합할 수 있으며, 이는 일반적으로 근권에서 발견되는 농도(주로 nmol 범위)보다 훨씬 높습니다. 더불어, 카복실레이트 가재된 ZrOH 하이드로겔은 안정적으로 유지되어 분석 전 몇 주간 보관할 수 있어 샘플링 중과 후 미생물 분해를 최소화합니다.

그림 3의 결과는 P가 부족한 토양에서 재배된 루피누스 알버스 L(루핀) 식물의 클러스터 뿌리를 따라 시트레이트 분출물의 공간적 분포를 2D 시각화한 것입니다. 이 지도는 2019년 8월 시트레이트 샘플링을 거쳐 2025년 8월에 ZrOH 겔을 분할하여 5 x 2mm 젤 조각에 대해 수행된 48개의 개별 측정으로 구성되어 있습니다. 분명히 ZrOH 하이드로겔은 방출된 시트레이트를 효과적으로 흡수했으며, 작은 젤(0.10 cm²)에서도 정량화된 결과를 보여주었으며, 엘루에이트의 사전 농축이 필요하지 않았습니다. 가장 높은 시트레이트 분출률은 클러스터 뿌리 영역에서 발견되었으며(최대 2.8 nmol ^cm-2 겔 ^h-1), ¹일차에는 67.2 nmol ^cm-2 겔로 추정되었으며, 가장 낮은 비율은 토양과 접촉한 젤 조각에서 관찰되었다. 클러스터 뿌리 길이는 0.2 mm에서 15.6 mm 사이였으며, 총 길이는 250 mm였다. 이 결과는 하이드로겔이 뿌리 방출 카복실레이트 샘플링에 24시간 동안 적합함을 확인시켜 준다. ZrOH 하이드로겔은 시트레이트 외에도 락테이트, 푸마레이트, 말레이트, 옥살레이트 등 다른 카복실레이트와도 결합할 수 있었다(표 1). 4°C에서 6년간 보관된 ZrOH 하이드로겔에서 대부분의 카복실산이 검출된 결과, 카복실레이트의 손상이 최소화되었음을 시사합니다. 그러나 다양한 식물 종에서 발견된 7가지 검사된 카복실산에 대해 훨씬 더 많은 정보를 수집하기 위한 실험이 진행 중입니다.

그림 1: 폴리아크릴아마이드 겔 준비 핵심 단계. (A) 유리판 조립체의 정렬 ~1 mm 오프셋. (B) 젤 주조 및 (C) 플레이트 중심부터의 젤 용액 고르게 퍼짐. (D) 모서리에서 면도날을 이용해 유리판을 지렛대 밀어. (E) 젤을 불려 유리판에서 분리하는 것. (F) 젤을 비커에 씻어내는 것. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 2: ZrOH 하이드로겔을 이용한 리조박스 재배 식물 뿌리 시스템 구간에서 뿌리 삼출물 샘플링. (A) 앞판과 플라스틱을 제거한 후 리조박스를 엽니다. (B) 세척병 내 탈이온수를 이용해 토양-뿌리 경계면을 적절히 적시. (C) 습식 토양-뿌리 경계면에 부착된 핵구멍 트랙-에칭 막. (D) 관심 부위에 ZrOH 하이드로겔을 적용한 리조박스, 전면 플레이트에 대한 젤 보호를 위해 플라스틱 호일로 덮은 상태. 이 그림의 확대판을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 3: ZrOH 하이드로겔을 이용한 뿌리 삼출물 샘플링과 감귤산 분출물의 밀리미터 크기 2D 이미지. (A) 표본 추출 중 관심 있는 뿌리 부위에 ZrOH 하이드로겔을 겹쳐 지도 작성에 사용되는 격자를 생성한 사진. (B) 인이 부족한 토양에서 자란 흰 루피누스 알버스 L. (루핀) 클러스터 뿌리의 분포를 보여주는 밀리미터 규모 2D 이미지. 각 격자는 5 x 2 mm 크기의 젤 조각을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

공장	치료	아코니타테	시트레이트	푸마레이트	락테이트	말레이트	옥살레이트	서시네이트
	mg P kg-1 토양	NMOL CM-2 H-1
루팡	50		0.02	0.21	0.15	<로크	0.06	<로크
루팡	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2	<로크
루팡	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19	<로크
루팡	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1	<로크
라이스 (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1	<로크
라이스 (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12	<로크	0.1	<로크
라이스 (네리카4)	50		0.01	0.24	0.35	<로크	0.09	<로크

표 1: 0, 50, 250 mg P ^kg-1 토양에 노출된 토양 재배 루피누스 알버스 L.(루핀)과 오리자 사티바 L.(쌀) 식물의 아코니테이트, 시트레이트, 푸마레이트, 락테이트, 말레이트, 옥살레이트, 석시네이트 분출량. LOQ는 정량 한계입니다

보충표 1: NaOH (1 mL, 0.5 mol ^L-1) 용출 매개변수(용출 효율 및 보정 계수) 및 ZrOH 하이드로겔의 7가지 카복실레이트 용량. 데이터는 평균 표준편차± 평균(개별 카복실산의 용출 효율 및 용량은 n = 4, 카복실레이트 혼합물은 n = 40)입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보조 그림 1: 물을 더 쉽게 주기 위해 권장되는 라이조박스의 도식적 표현입니다. 라이조박스는 물주기 시 물의 고르게 분배할 수 있도록 바닥과 뒤쪽에 고르게 배치된 라이조박스 프레임과 실험 중 뿌리 성장을 모니터링할 수 있는 분리 가능한 투명 전면 플레이트로 구성되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 라이조박스 조립 및 토양 충전 과정. (A) 라이조박스 프레임 뒷면의 구멍을 접착 테이프로 덮습니다. (B) 라이조박스 프레임의 앞쪽 또는 열린 면에 (핵구멍 멤브레인)을 붙이고, 그 위에 플라스틱 호일을 붙입니다(충분히 단단하고 평평한지 확인). (C) 앞판을 놓고 라이조박스를 클램프로 고정합니다. (D) 라이조박스를 채우면서 앞쪽으로 기울여 미세한 입자들이 분리 가능한 표면에 떨어지도록 하여 사진과 같이 매끄러운 표면을 만듭니다. (E) 또는 덮개가 있는 라이조박스 프레임 (A)를 열린 쪽에서 채우고, 분리 가능한 플레이트로 평평한 후 핵포어 막, 플라스틱 호일, 앞판으로 덮는 방법. (F) 라이조박스의 최종 설치, 물 주입 및 심기. 대체 충전 절차는 Wagner 등(2020)에 제시되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보조 파일 1: 이 파일에는 히트맵을 생성하는 데 사용된 R 스크립트에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

Discussion

여기서 설명하는 카복실산 샘플링 방법은 ZrOH 하이드로겔을 사용하여 적절한 겔 준비와 취급이 매우 중요합니다. ZrOH 하이드로겔을 다룰 때는 실험실용 몇 방울의 물로 촉촉하게 유지하는 것을 권장합니다. 준비 중에는 젤 혼합물을 준비한 후 신속히 주조하는 것이 중요하며(1.1.3단계), 유리판 사이에 기포가 생기지 않도록 해야 합니다. ZrOH 하이드로겔 중앙에 위치한 기포는 샘플링에 방해가 될 수 있어 특히 중요합니다. 반면, 가장자리의 기포는 도포 전에 젤을 다듬어 제거할 수 있습니다. 더불어, 근에서 방출된 카복실산염은 하이드로겔 내 침전된 ZrOH에 결합하여 침전 시 Zr의 고르게 분포하는 것이 필수적입니다. 젤 내 Zr 분포가 고르지 않으면 카복실레이트의 측면 확산이 일어나 공간 분포가 왜곡되고 2D 국^소화의 신뢰성이 저하될 수 있습니다. Zr 분포는 더 넓은 비커에서 2시간 이상 적힌 폴리아크릴아마이드 겔을 ZrOCl₂·8H₂O 용액에 담그고, 겔 수를 적게 배치하여 Zr 분포를 달성할 수^{있습니다 (단계} 1.2.3). 또한, Zr 분포는 ZrOH 하이드로겔을 개발한 Guan 등¹⁴가 권장한 주사 전자현미경(SEM, S-3400N II, 히타치, 일본)을 통해 검증할 수 있습니다. 그러나 SEM은 대형 샘플에 대한 표준 절차로서 실현 가능하지 않습니다.

또 다른 중요한 단계는 카복실산 샘플링을 위한 리조박스 충전, 핵공 막 도포, 그리고 젤 도포 전 물 주기입니다. 모래 또는 무거운 점토 토양을 채우고 다룰 때는 균일하게 매끄러운 표면을 유지해야 하며, 이는 젤 접촉을 위해 필수적이며, 배수 상태도 잘 유지됩니다. 매끄러운 표면은 핵공 막의 적절한 부착에도 필수적입니다. 근과 ZrOH 하이드로겔 사이에 좋은 접촉을 확립하는 것은 핵공막이 토양 표면에 적절히 부착되어 기포가 최소화되도록 하는 것이 중요합니다. ZrOH 젤 도포 전에 토양을 적절히 적시하여 ZrOH 하이드로겔이 단단히 부착되고 평평하며 촉촉하게 유지되도록 하는 것도 중요합니다. 2D 카복실레이트 매핑을 위해 젤을 절단할 때는 밀리미터 단위의 정확한 절단이 어려울 수 있습니다; 따라서 2 x 2 mm 이하로 해상도를 낮추지 않는 것을 권장합니다. 또한, 겔은 건조 시 수축하므로 샘플링 후 균열을 유지하기 위해 반드시 촉촉하게 유지하는 것이 중요합니다(단계 3.12). 현재 방법은 Tiziani 등¹²의 연구에서 채택되었으며, 이들은 카복실산의 분해를 방지하기 위해 NaN₃를 미생물 억제제로 사용할 것을 권장했습니다. 이 프로토콜에서는 뿌리 분출물(NaN₃ 또는 AgCl 3 기반 물질인 마이크로퍼)을 샘플링하는 데 흔히 사용되는 미생물 억제제를 사용하지 않습니다.

현재까지 이 방법은 7가지 카복실산(아코니테이트, 시트레이트, 푸마레이트, 락테이트, 말레이트, 옥살레이트, 숙시네이트)에 대해서만 검증되었으며, 뿌리 엑수돔은 복잡한 화합물(예: 페놀릭, 아미노산, 탄수화물, 카복실레이트)으로 구성되어 있습니다. 이 다른 중요한 화합물들은 현재 이 방법에서 고려되지 않았으며, ZrOH 하이드로겔도 샘플링에 대해 특성화되지 않았습니다. 토양 내 다른 옥시아니온(예: 인산염, 질산염)의 존재는 카복실레이트 흡수, 용량 및 용출량, IC 또는 HPLC에서의 카복실레이트 정량에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 큰 식물(예: 나무나 관목)에서 매우 큰 전체 뿌리 시스템을 샘플링하는 것은 매우 큰 ZrOH 하이드로겔(>30cm)을 생산하기 어려워 매우 어려울 수 있습니다. 그러나 이는 현재 모든 유출물 샘플링 기법에서 발생하는 문제입니다⁸. 또 다른 제한은 리조박스 사용입니다. 리조박스에서의 식물 성장은 수경재^{배 시스템보다} 훨씬 현실적이지만, 여전히 인위적인 구조이며, 뿌^{리 발달}을 위한 3차원 공간이 제한적입니다. 더불어 샘플링은 2D 표면에서 이루어지며, 이로 인해 겔과 접촉하지 않는 다른 방향으로 분출된 카복실산이 손실될 수 있습니다. 그러나 이 제한은 확산, 카복실레이트에 대한 ZrOH 하이드로겔의 결합 능력 증가, 그리고 적용 시 리조스피어 토양의 높은 수분 함량으로 완화될 수 있습니다. 하지만 이러한 측면을 규명하기 위해서는 추가 검증이 필요합니다.

뿌리 방출 카복실산염을 샘플링하는 ZrOH 하이드로겔 방법은 일반적으로 사용되는 방법(즉, 토양-수경재배 하이브리드 및 수경재배 방법)에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 이 새로운 접근법은 교란되지 않은 토양 뿌리 시스템에서 카복실산염의 현장 샘플링, 시간 분해 샘플링(Santner, Mühlbacher 등, 미공개 데이터), 그리고 mm 규모 2D 매핑을 가능하게 합니다. 또한 ZrOH 하이드로겔은 최소 24시간¹²시간 동안 뿌리에 사용할 수 있습니다. 또한 동일한 뿌리 마디를 더 긴 시간 분해 기간 동안 반복 샘플링하는 것도 가능할 것입니다. 이 방법은 필터 페이퍼 적용과 같은 유사 방법보다 훨씬 더 발전되고 특성화되어^{있습니다.} ZrOH 하이드로겔은 카복실레이트의 높은 겔 용량 덕분에 장기간 샘플링이 가능하며, 예를 들어 말레이트는 0.44 μmol ^cm² ± 0.04 μmol cm⁻² 겔에서 pH 4.00에서 석시네이^트는 1.66 μmol ^cm² ± 0.10 μmol cm⁻2로 혼합 시 총 3.29 μmol ^cm²± 0.40 μmol cm⁻²입니다(보충표 1 참조). 토양-수경재배 하이브리드 방법에서 뿌리 세척 단계(보통 식물당 20–30분 소요)를 생략하면 뿌리 시스템 손상과 관련 편향이 크게 줄어들어 보다 현실적이고 대표적인 데이터를 얻을 수 있습니다.

특히, 가로딩된 ZrOH 하이드로겔은 특별한 저장 조건이 필요 없고 냉장 상태만 필요하며, 지금까지 적용 시 용출 후 전농축이 필요하지 않다는 점을 발견했습니다. ZrOH 하이드로겔은 또한 다른 음이온과 결합하며, 이들은 동일한 조건에서 용출되어 IC^14,34로 분석할 수 있습니다. 이로 인해 카복실레이트 분비가 근권^내 영양분의 공간적 분포와 연결될 수 있습니다.

결론적으로, 뿌리에서 방출된 카복실산을 샘플링하는 이 새로운 접근법은 근권 연구에 있어 근본적인 단계입니다. 카복실산은 식물 영양분(예: P, Fe)^35,36의 동원 및 획득, 그리고 유익한 미생물의 유인 유익 유입에 중요한 역할을 하기 때문에, 이 방법은 뿌리 특성과 식물 육종을 선별하는 데 사용될 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
에탄올	시그마-올드리치		70%
옥살산	시그마-올드리치	194131-250G	98%
트랜스-아크니틱산	시그마-올드리치	122750-25G	98%
지르코늄 디클로라이드 옥타하이드레이트 (ZrOCl2 및 시간; 8H2O, 98%)	써모 사이언티픽	A12342.22	98%
구연산	시그마-올드리치	C83155-500G	99%
질산나트륨	VWR 케미컬스	경품 번호: 19H224150	100%
질산 (HNO3)	시그마-올드리치	CAS-번호: 7697-37-2	>65% 분석 EMSURE® 리그. PH 유로, ISO
푸마르산	시그마-올드리치	240745-100G	>99%
수산화나트륨	시그마-올드리치	S8045-500G	≥ 98%
과황산암모늄 (APS_(NH4)2S2O8)	써모 사이언티픽	201531000	≥ 98.0%, 초순도, 전기영동을 위해
석신산	시그마-올드리치	S3674-100G	≥ 99%
2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(MES) 완충제	시그마-올드리치	M8250-250G	≥ 99.5%
염화나트륨	시그마-올드리치	71376-1KG	≥ 99.5%
가교체	DGT 리서치 Ltd (랭커스터, 영국)	나	2%, 아가로스 유도체
플레이트 또는 수평 셰이커			Any
이온 크로마토그래피 또는 IC-MS	써모 피셔 사이언티브	나	고성능 또는 초고성능 액체 크로마토그래피(HPLC 또는 UHPLC)는 첨단 MS(예: 비행 시간 또는 오비트랩)나 분광광도 검출기를 포함한 다양한 검출기와 함께 사용할 수 있습니다
pH 측정기			어떤 실험실 pH 전극도 사용할 수 있습니다
오븐	바이너	나	특정 온도를 유지하는 작은 오븐이라면 다 사용할 수 있고, 더 작은 오븐이 더 좋습니다.
나일론 filters_13 mm 0.45 & 마이크로; M	GVS 필터 기술	번호판: 7135431	더 큰 나일론 필터도 사용할 수 있지만, 유루액이 적기 때문에 작은 필터가 선호됩니다.
황산칼슘 이화물	시그마-올드리치	C3771-1KG / CAS-번호: 10101-41-4	CaSO4도 사용할 수 있습니다.
아크릴아마이드 용액, 40%	G-바이오사이언스	786-508	혼합된 아크릴아마이드 용액은 사용하지 마세요; 비스-아크릴아마이드. 연기 구역에서 조심해서 다뤄야 하는 독성 화합물입니다.
라이조박스	https://www.rhizosphere.com/	나	저희 리조박스는 Rhizosphere.com 디자인을 바탕으로 맞춤 제작됩니다
폴리프로필렌 바이알 키트, 1.5 mL	써모 사이언티픽	79812	플라스틱 IC 바이알은 깨지지 않고 냉동할 수 있기 때문에 선호됩니다. 330 & 마이크로; L도 사용할 수 있으나, 기포가 없도록 주의해야 합니다
시스-아코니틱산	써모 사이언티픽	A16010.06	기술, 85%
N,N,N',N'- 테트라메틸레틸렌디아민 (TEMED)	시그마-올드리치	로트 번호: BCBN1173V	조심해서 다뤄야 할 독성 화합물입니다
250 mL PP 바이알	사르스테트	로트 번호:2406082
알루미늄 호일	지역 슈퍼마켓	나
Beakers_1 L/ 2 L
클램프	지역 창고	나
유리판 (6.1 x 17 x 0.4 cm)	지역 창고	나
L-(-)-말산(Malic acid)	시그마-올드리치	M6413-25G
IC용 락산염 표준	시그마-올드리치	07096-100ML
층류 벤치
L-락틱산 무수	써모 사이언티픽	L13242.14
핵공 트랙-에칭 Membrane_0.2 및 마이크로; m	시티바	로트 번호: A29983896
플라스틱 호일/비닐봉지	지역 창고	나
플라스틱 핀셋	세마데니	602
플렉시글라스 판	지역 창고	나
PP 30 mL 바이알	압타카 스파	로트 번호: 250552
PTFE spacer_0.25/0.4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
면도날	지역 창고	나
통치자	지역 서점	나
차아염소산나트륨(NaClO)	카를로 에르바 시약	CAS-번호: 7681-52-9
Syringes_1 mL	헨케 사스 울프 (헨케-제트)	로트 번호: 22A17C8
비닐 전기 테이프	지역 창고	나