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방법 논문

쥐에서 만성 두개내 다전극 뇌파 기록의 수술 후 회복 및 안정성

153 조회수

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DOI:

10.3791/69937

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2026년 4월 24일

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1Core Facility Center, Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Intensive Care Unit, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 3Department of Neurosurgery, Anesthesiology, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 4First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 5Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 6Institute of Heart Lung and Blood Vessel Disease, Beijing Key Laboratory of Precision Medicine of Coronary Atherosclerotic Disease, Clinical center for coronary heart disease, Capital Medical University, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 8Department of Physiology, Amsterdam University Medical Centre

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 쥐에서 만성 다중 전극 EEG 이식 후 수술 후 평가를 위한 표준화된 틀을 제시하며, 신호 질의 순차적 모니터링, 행동 회복, 신경염증 지표를 포함하여 안정적인 장기 기록의 적절한 시작 여부를 결정합니다.

초록

두개내 다중 전극 이식은 뇌 영역 전반에 걸쳐 신경 신호를 동시에 획득할 수 있게 하지만, 수술 후 교란을 초래하여 데이터 품질과 실험 시간에 영향을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 Sprague–Dawley 쥐를 대상으로 만성 다부위 두개내 EEG 전극 이식과 구조화된 이식 후 평가를 위한 표준화된 워크플로우를 설명합니다. 텅스텐 와이어 전극은 조직 파괴를 최소화하는 수술 전략을 사용하여 세 개의 미리 정의된 두개내 부위(전대 대상피질, 해마 CA1, 내감피질)에 입체전술적으로 이식됩니다.

이식 후, 프로토콜은 전극 위치 정확도, 국소 필드 전위 무결성, 통증 관련 행동, 섭식 행동, 신경염증 지표 등 다섯 영역에 걸쳐 종단적 평가를 명시합니다. 전기생리학적 및 행동 평가는 사전 정해진 수술 후 시점(기초 및 수술 후 1일, 4일, 7일, 10일, 13일)에 수행되어 초기 수술 후 영향(n = 3)의 일관된 모니터링을 지원합니다. 조직학적 분석은 연구 종료 시점의 국소 조직 반응을 특징짓는 데 사용됩니다(시점당 n = 3).

실험 준비 상태와 장기 기록 시작에 관한 결정을 안내하기 위해 운영 기준과 평가 간격이 제공됩니다. 이 프로토콜은 착상 후 모니터링에 대한 구조화된 접근법을 제공하며, 하위 신경생리학적 실험의 적절한 시기를 안내합니다.

서론

두개내 뇌파 검사법(EEG)은뇌 조직에서 신호를 직접 기록하여 신경 활동의 고해상도 측정을 가능하게 하며, 두피 EEG 접근법보다 공간 특이성과 신호 정확도에서 이점을 제공합니다3. 다중 영역 두개내 기록은 네트워크 수준 상호작용에 대한 통찰을 제공하며, 이는 인지 및 질병의 신경 역학을 연구하는 데 널리 사용되며, 설치류 모델에서 기전 및 종단 연구를 위해 흔히 구현됩니다 4,5.

텅스텐 와이어 전극은 기계적 안정성과 생체 적합성 때문에 만성 기록에 흔히 사용됩니다 6,7,8. 그러나 이식은 신경 생리, 조직 완전성, 동물 행동을 일시적으로 방해할 수 있는 침습적 수술이 필요합니다 9,10,11. 급성 수술 스트레스, 국소 염증, 교세포 반응, 섭식 또는 통각 행동 변화와 같은 도전 과제가 초기 이식 후 시기 동안 신호 품질과 실험적 해석에 영향을 줄 수 있습니다 12,13,14. 그러나 이 회복 기간은 주로 경험적 수준이며, 보고된 회복 기간은 5일에서 7일 사이입니다15,16. 반대로 장기적인 지연은 조직 재형성이나 전극 변위와 관련된 추가 혼동변수를 유발할 수 있습니다17.

만성 두개내 EEG가 널리 사용되고 있음에도 불구하고, 이식 후 모니터링을 위한 전기생리학, 행동, 염증, 조직학적 평가를 통합하여 실험 시기를 정하는 표준화된 프레임워크는 없습니다. 따라서 본 프로토콜은 마취된 Sprague–Dawley(SD) 쥐(6주 생후)에서 만성 두개내 다중 전극 이식 모델에서 이식 후 상태를 평가하는 구조화된 접근법을 제시하여 이 공백을 메우고 있습니다. 전대상피질(Cg1), 해마 CA1, 후두피질(EC)에 이식된 텅스텐 와이어 전극을 사용하여 프로토콜은 2주간 전극 안정성, EEG 신호 특성, 행동 지표 및 염증 지표를 종단적으로 평가합니다. 평가는 실용적 편의를 위해 전신마취 하에서 수행되지만, 이 접근법은 전극 이식과 안정성에 대한 틀 수립이라는 주요 목적에 영향을 미치지 않습니다. 이 프로토콜은 수술 후 모니터링을 안내하고, 하위 신경생리학적 연구를 시작하기 위한 적절한 시점을 일관되게 결정하는 데 목적이 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 기관 지침에 따라 수행되었으며, 캐피털 메디컬 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 ID: AEEI-2024-391)의 승인을 받았습니다.

1. 동물 준비

  1. 6주 된 수컷 SD 쥐(체중 220–230g)를 확보하세요. 동물들을 병원체가 없는 특정 환경(24± 2°C, 50± 10% 습도, 12시간 빛/어둠 주기)에 보관하세요. 음식과 물을 자유 롭게 제공하세요. 수술 7일 전까지 쥐를 적응시키세요.
  2. 전극 이식 후에는 헤드스테이지 손상을 방지하기 위해 쥐를 개별적으로 동일한 환경 조건에서 수용합니다.
    참고: 연구 흐름도와 해당 측정값은 그림 1A에 제시되어 있습니다. 시약과 장비 는 재료표에 나열되어 있습니다.

2. 다중 전극 이식 수술

  1. 이소플루란(3–4% 유도, 2% 유지 투여)으로 쥐를 마취시키고, 분당 2L의 산소로 투여합니다.
  2. 쥐를 입체 투입 프레임에 넣고 온도 조절 가능한 온열 패드를 사용해 체온을 37°C로 유지합니다. 각막 건조를 방지하기 위해 에리스로마이신 안과 연고를 바릅니다.
  3. 두피를 면도하고 0.5% 요오도포르 용액으로 소독하세요.
  4. 두피 중앙 절개(1× 2cm)를 하여 두개골을 노출시키고, 멸균 면봉으로 골막을 부드럽게 제거하세요.
  5. 두개골 준비 및 드릴링
    1. 브레그마와 람다를 식별하고 두개골을 전후면과 내측 외측 평면에서 평평하게 만든다.
    2. 저속 치과 드릴을 이용해 간헐적 식염수 관개를 사용하여 목표 좌표에 ≤ 직경의 버 홀을 드릴링합니다.
  6. 전극 준비 및 삽입
    1. 노출된 팁 길이 4–8 mm(플러시 컷 끝)의 폴리이미드 절연 텅스텐 와이어 전극(샹크 직경: 300 μm)을 사용하세요. 전극 임피던스(| Z|)를 측정하세요 1 kHz에서; 허용 가능한 값은 7–10 kΩ 범위이며, 위상각은 1°에서 2° 사이입니다.
    2. 다음 영역에 천천히 전극을 삽입하세요: Cg1(전측대상피질): AP +1.2 mm, ML −0.2 mm, DV −2.4 mm; CA1(해마): AP −3.3 mm, ML −1.8 mm, DV −3.0 mm; EC(내감피질): AP −6.7 mm, ML −4.0 mm, DV −8.0 mm.
    3. 반대쪽 CA1 부위에 스테인리스 스컬 스크류 하나를 이식하고 접지 전극으로 사용하세요.
  7. 전극 고정 및 폐쇄
    1. 이식 시 입체 위치 좌표를 사용하여 전극 깊이와 표적 지정 정확성을 확인; 전극 경로를 조직학적으로 확인하여 사후 전극 위치를 확인합니다.
    2. 전극과 나사는 치과용 수지로 고정하세요(한 층당 30–60초 경화).
    3. 전극 단선을 헤드스테이지 커넥터에 연결하고 주변 피부를 봉합하세요.
  8. 마취를 유지하면서 해당 시점에서 30분간 기초 EEG 활동을 기록합니다(그림 1A).

3. 수술 후 관리 및 취급

  1. 쥐가 완전히 움직일 수 있을 때까지 온기 패드에서 회복할 시간을 주세요.
  2. 집쥐는 부드러운 침구와 자유 롭 게 먹이와 물을 섭취하며 스트레스를 완화하기 위해 온도와 습도가 조절된 환경입니다.
  3. 절개 부위, 전극 안정성, 헤드스테이지 무결성을 매일 점검하세요.
  4. 집 동물을 개별적으로 관리하고, 매일 상처 관리(0.5% 요오도포르 용액)를 제공하며, 이전 연구들과 일치하여 약물 작용 없이 복지를 모니터링하여 혼란 효과를 피한다 6,18.

4. 종단 EEG 기록

  1. 이식 후 1일, 4일, 7일, 10일, 13일에 뇌파 기록을 수행하세요.
  2. 쥐에게는 이소플루란으로 마취(유도 3–4%, 유지 1.5%).
  3. 녹화 케이블을 안정화하여 움직임 아티팩트와 전자기 잡음을 최소화하세요.
  4. 오전 9시부터 30분간 뇌파 검사를 기록하여 생체 변동성을 조절하세요.
  5. 다음 획득 매개변수를 사용하세요: 샘플링 속도: 1,000 Hz; 하드웨어 밴드패스 필터: 0.5–40 Hz; 게인: 8–10. 추가 필터링과 아티팩트 제거를 오프라인에서 수행합니다.
  6. 허용 가능한 EEG 신호는 안정적인 기준선, 최소한의 잡음 또는 드리프트, 생리학적으로 그럴듯한 진폭과 주파수 성분을 보입니다; 이 기준을 충족하지 않는 기록은 제외합니다.

5. 뇌파 신호 분석

  1. 참조된 소프트웨어를 사용해 EEG 신호를 분석하세요.
  2. 신호를 시각적으로 점검하고 움직임이나 전기적 아티팩트가 있는 구간을 제거합니다.
  3. FFT(pwelch 함수)를 사용하여 파워 스펙트럼 밀도(PSD)를 계산합니다.
  4. 미리 정의된 주파수 대역에 대해 PSD 곡선(AUCpsd) 아래 면적 을 계산하여 진동 활동을 정량화합니다.
  5. 신호 대 잡음비(SNR)를 목표 신호 대역(0.5–40 Hz)과 배경 잡음 대역(40–80 Hz)의 전력 비율로 계산합니다.
    참고: 안정적인 신호는 연속된 기록일에 걸쳐 일관된 PSD 프로필을 보입니다.

6. 통증 평가

  1. 수술 하루 전(기준선)과 모든 기록일에 쥐 그라머스 척도19,20을 사용해 통증을 평가합니다.
  2. 관측실(25cm × 15cm × 15cm)을 사용하고, 카메라를 왼쪽 상단 모서리에 45° 각도로 위치시키세요.
  3. 얼굴 이미지를 촬영하고, 이미지 순서를 무작위로 하며, 안와 수축, 코/뺨 평평, 수염 변화, 귀 위치(0–2 척도)를 기록합니다.
  4. 점수를 합산하여 시점별 동물 한 마리의 총 통증 점수를 산출합니다.

7. 먹이 행동과 체중

  1. 쥐의 무게를 재고 매일 먹이 섭취량을 측정하세요. 24시간 후 미리 무게를 달아 먹이 섭취량을 계산하세요.
  2. 비디오 녹화 시스템을 사용해 24시간 동안 쥐 행동을 연속적으로 기록합니다. 실험 조건에 눈이 멀었던 실험자들의 오프라인 먹이 행동을 분석합니다.
  3. 먹이를 지속적으로 모니터링하세요. 먹이 주기를 5초부터 15분21초까지 지속되는 ≥1 이벤트로 정의하세요.
  4. 체중 조정 섭취량(g × 100/g 체중); 평균 식사량(g/식사 횟수); 섭취량(g/총 급식 시간 분)을 계산합니다.

8. 신경염증 평가

  1. 이소플루란 과다 투여 후 참수하여 쥐를 안락사시키세요.
  2. 이식된 반구에서 뇌 조직을 기저선 및 수술 후 1, 4, 7, 10, 13일차에 수집하세요(각 시점에 n = 3일).
  3. 서부 블롯팅
    1. 뇌 조직에서 총 단백질을 추출하고 빅신코닌산(BCA) 분석법을 사용해 단백질 농도를 정량합니다. 모든 샘플을 최종 농도인 2 μg/μL로 조절하고 100 °C에서 5분간 변성을 시킵니다.
    2. 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하여 120V 전압에서 90분 동안 사용하며, 레인당 20μg의 단백질을 적재합니다.
    3. 단백질을 PVDF 막에 300 mA로 1시간 동안 옮깁니다.
    4. 막을 차단하고 4°C에서 종양 괴사 인자-α(TNF-α)과 인터루킨-6(IL-6)(1:1,000)에 대한 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이팅합니다.
    5. HRP 결합된 2차 항체(1:20,000, 2시간, 상온)와 함께 인큐베이팅합니다.
    6. ECL을 사용해 밴드를 시각화하고, 자동 노출 모드를 사용하는 화학발광 이미징 시스템으로 영상을 촬영합니다.
    7. ImageJ를 사용해 덴시토메트리를 수행하세요.

9. 안전 및 폐기물 처리

  1. 능동 청소 시스템을 사용해 아이소플루란을 다루세요.
  2. 날카로운 도구와 생물학적 조직은 지정된 생물학적 위험 용기에 폐기하세요.
  3. 화학 시약은 기관 안전 규정에 따라 폐기됩니다.

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결과

모든 21마리의 SD 쥐는 두개내 전극 이식을 허용하고 연구 프로토콜을 완료하였다. 종단적 측정(EEG, 체중, 섭식 행동, 통증 점수)은 동일 동물로부터 시점(n = 3)에 걸쳐 수집되었으며, 신경염증 평가는 각 시점에서 최종 측정 기준이었다(n = 하루 3마리: 기준선, 1, 4, 7, 10, 13). 데이터는 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 정규성을 평가하였다. 정규분포 데이터는 SEM 평균± 표현되며, Bonferroni 보정과 함께 일방향 또는 반복 측정 ANOVA를 사용해 비교하였다. 비모수 데이터는 Kruskal-Wallis 검정과 던의 사후 검정을 사용해 분석하였다. 양측 p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. EEG 신호 회복은 연속된 시점에 걸쳐 AUCpsd의 정체기로 정의되며, 수유, 체중, RGS 점수는 기초선으로 돌아올 때 회복된 것으로 간주됩니다.

전극 위치...

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토론

설치류에서 EEG 모니터링을 위한 만성 두개내 전극 이식은 고시간 해상도에서 신경 역학을 연구하는 핵심 기법으로 남아 있습니다. 적절한 수술 후 모니터링 및 회복 창을 설정하는 것은 신호 신뢰성과 동물 복지를 모두 보장하는 데 매우 중요합니다. 본 연구는 SD 쥐에서 다중 전극 이식 후 전기생리적 안정성, 행동 결과, 염증 반응을 평가하기 위한 구조화된 틀을 제공하며, 장기 기록 프로토콜에서의 실질적 지침을 제공합니다.

뇌파, 행동 및 생리적 회복
전기생리학적, 행동적, 생리학적 모니터링 프레임워크를 결합하여, 이 프로토콜은 다중 전극 이식 후 두개내 EEG 신호가 예측 가능한 안정화 과정을 겪는다는 것을 입증합니다. EEG 스펙트럼 출력은 수술 후 1일째에 처음에는 감소했으나, 모든 영역(Cg1, CA1, EC)에서 3–4일 이내에 안정되었습니다. 이러한 초기 억제는 수술 후 EEG...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 수도의과대학 우수 청년 인재 프로젝트(A2308)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
능동 이소플루오란 청소 시스템RDWR510-31-6
동물찰스 강
BCA 분석 키트솔라비오PC0020
케미닥 영상 시스템바이오-래드17001401
치과용 수지정점XG473P03
ECL 검출 시약솔라비오PE0010
에리스로마이신 눈 연고렌허1.00E+11
염소 항토끼 2차 항체단백질 기술SA00001-2
그래프패드 프리즘 9.0그래프패드 소프트웨어통계 분석 소프트웨어
헤드스테이지 앰프바이오팩 시스템즈 주식회사EEG100C
온열 패드위옌 기술S-100
이미지J국립보건원(NIH)이미지 분석 소프트웨어
IL-6 폴리클론 항체단백질 기술21865-1-AP
아이오도포어클린붐430-DFXDY100
이소플루란후륜구동R510– 31
NeuroExplorer와 함께한 신경 기록 장치 (v 5.012)플렉슨OPX-A1600-128-16C전기생리학 데이터 분석 소프트웨어
PVDF 멤브레인시티바RPN303F
SDS-PAGE 시스템바이오-래드1658004
입체 이동 장치중시 과학기술ZS-PDC
TNF-&α; 다클론 항체단백질 기술17590-1-AP
이송 장치바이오-래드1703937
텅스텐 와이어A-M 시스템785500
비디오 녹화 시스템배슬러acA1920
β-액틴 단클론 항체단백질 기술2D4H5

참고문헌

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