다양한 추출 방법이 Terfezia claberii의 시험관 내 생리활성 프로필에 미치는 영향

Summary

Terfezia claveryi 추출물의 시험관 내 생체활성은 생물물리학적 추출 방법과 용매 극성에 의존했습니다. 마세레이션 보조 추출(MAE)에서 추출한 물 추출물이 가장 강한 항산화 활성을 보인 반면, Soxhlet 추출(SE) 추출물은 SH-SY5Y 세포에서 더 큰 세포독성을 유발했습니다. 이 결과는 Terfezia claveryi 추출물의 시험관 내 생체 활성에 대해 명확한 방법별 차이를 보여줍니다.

Abstract

테르페지아 클라베리(Terfezia claveryi)는 전통적으로 건조 지역에서 소비되는 식용 사막 송로버섯입니다. 최근 몇 년간 항산화, 항균, 치료 특성 가능성으로 인해 과학적 관심을 점점 더 받고 있으며, 식품 및 건강 관련 분야에서의 응용 가능성을 시사합니다. 그러나 생물학적 잠재력에 대한 증거가 증가하고 있음에도 불구하고, 다양한 추출 전략이 생리활성 화합물 회수와 Terfezia claveryi의 시험관 내 생활성 프로필에 미치는 영향은 아직 문헌에서 명확히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 다양한 추출 방법과 다양한 극성을 가진 용매를 사용해 얻은 Terfezia claveryi 추출물의 시험관 내 생체 활성을 평가하였습니다. 추출 수율을 산정하고, 얻은 추출물을 항산화, 항생제, 항생체막 및 세포독성 활성 여부를 검증하였으며, 이는 확립된 시험 시스템을 사용하였습니다. 항산화 능력은 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH), 2,2′-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS), 철 환원 항산화력(FRAP) 검사를 통해 측정되었으며, 세포독성 효과는 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서 조사되었습니다. 추출 수율은 방법과 용매 극성에 따라 달라졌으며, 초음파 보조 추출법(UAE)으로 제조된 수용성 추출물에서 가장 높은 수율이 18.40%로 나왔습니다. 항산화 활성은 추출 방법에 따라 유의미한 차이를 보였으며, 마세레이션 보조 추출법(MAE) 방법으로 얻은 수용성 추출물은 페놀 화합물이 풍부한 프로필과 가장 강한 라디칼 스캐빈싱 능력을 보였다. 이 추출물에 대한 LC-MS/MS 분석 결과, 9가지 페놀 화합물이 존재함이 밝혀졌으며; 퀴닉산과 엽록산이 우성 성분으로 확인되었습니다. 반면, Soxhlet 유래 추출물은 SH-SY5Y 세포에서 더 강한 세포독성 효과를 유도했습니다. 항균 및 항생생물막 반응은 추출 방법 간 변동이 상대적으로 적어 추출 전략에 대한 의존도가 약함을 나타냈다. 전반적으로 이 결과들은 생물물리학적 추출 방법과 용매 선택이 Terfezia claveryi 추출물의 시험관 내 생리활성 프로필을 결정하는 중요한 요인임을 보여주며, 항산화 및 세포독성 활성에서 뚜렷한 효과를 관찰합니다.

Introduction

건강을 개선하고 질병을 예방 및 치료하기 위해 다양한 버섯 종을 사용한 것은 고대로 거슬러 올라갑니다 ^1,2,3. 거대균류는 일반적으로 두 그룹으로 분류됩니다: 에피지어스(버섯)와 지하지오스(트러플)⁴. 사막 송로버섯으로 알려진 Terfezia claveryi(T. claveryi)는 세계적으로 유명하고 식용 가능한 송로버섯 종으로, Terfezia⁵ 속에 속합니다. T. claveryi는 헬리안테움 종이 널리 퍼지는 건조 및 반건조 지역에 흔히 분포합니다 ^{6,7,8,9,10,11}. 최근 몇 년간 암과 신경퇴행성 질환과 같은 만성 질환의 전 세계적 부담이 크게 증가하여, 새롭고 안전하고 효과적인 치료제에 대한 시급한 필요성이 부각되고 있습니다. 글로벌 보건 보고서에 따르면, 암은 전 세계 주요 사망 원인 중 하나로 남아 있으며, 고령화 인구와 함께 신경퇴행성 질환도 계속 증가하고 있습니다. 이러한 증가하는 공중보건 문제를 감안하여, 곰팡이와 약용 식물에서 유래한 천연 제품을 생물활성 화합물의 잠재적 공급원으로 조사하는 것이 중요한 연구 우선순위가^{되었습니다.}

동시에 항생제 내성의 급속한 출현은 전 세계 보건에 또 다른 주요 위협이 되고 있습니다. 약물 내성으로 인해 기존 항생제의 효과가 크게 감소하여 대체 항생제 전략의 긴급한 필요가 생겼습니다. 자연 공급원에서 유래한 2차 대사산물, 특히 페놀 및 폴리페놀 화합물은 다양한 항균 기전과 내성 발생 경향이 낮아 점점 더 관심을 받고 있습니다¹⁴. 산화 스트레스는 암, 신경퇴행성 질환, 대사 증후군 등 많은 만성 질환의 근본적인 기전적 요인입니다. 과도한 활성 산소종(ROS)의 생성은 궁극적으로 DNA 손상, 지질 과산화, 단백질 산화를 일으켜 세포 항상성을 방해할 수 있습니다. 이와 관련하여, 자유 라디칼을 제거하고 산화환원 균형을 조절할 수 있는 천연 항산화제는 산화 손상과 질병 진행을 완화하는 유망한 물질로 간주됩니다¹⁵.

트러플은 불포화지방산, 단백질, 미네랄, 비타민, 아미노산, 페놀, 폴리페놀 등 항균, 항산화, 항암 특성과 관련된 성분들이 풍부합니다.^{16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24}. 이들의 항산화 능력은 자유 라디칼 제거 효과와 연관되어 있습니다^{25, 26, 27}. 송로버섯 종 중에서 T. claveryi는 식용 구조, 지역 경제적 가치, 그리고 페놀 화합물의 풍부함으로 특히 주목할 만하다²³. 전통적인 섭취와 생물학적 활성에 관한 새로운 증거에도 불구하고, 추출 전략이 화학적 조성과 생물학적 효과에 미치는 영향을 종합적으로 조사한 연구는 여전히 제한적입니다.

송로버섯에서 생물학적 활성 화합물을 회수하는 과정은 적용된 추출 기법과 용매 극성 등 추출 매개변수에 크게 영향을 받습니다. 초음파 보조 추출(UAE), 마세레이션 보조 추출(MAE), 소크슬렛 추출(SE)과 같은 생물물리학적 추출 방법은 극성 화합물에 대한 에너지 투입, 추출 효율, 선택성 측면에서 유의미한 차이를 보인다²⁸. 그러나 대부분의 연구는 단일 추출 방법이나 제한된 용매 시스템에 의존해 왔으며, 이러한 방법들이 T. claveryi의 시험관 내 생물학적 활성 프로필에 미치는 영향을 비교적으로 다룬 연구는 제한적입니다. 따라서 본 연구는 다양한 극성을 가진 용매를 사용하여 T. claveryi 추출물의 시험관 내 생물학적 활성을 체계적으로 비교합니다. 추출 방법과 용매 극성이 생물학적 활성에 방법 의존적 차이를 초래할 것이라는 가설이 제기되었다. 따라서 본 연구의 목적은 (i) 다양한 방법 및 용매 간 추출 수율을 비교하는 것, (ii) 방법별 항산화 및 세포독성 활성의 변동성을 평가하는 것, (iii) 추출 전략에 대한 민감도를 고려하여 항생제 및 항생생물막 반응을 조사하는 것입니다.

Protocol

참고: T. claveryi 추출물의 전체 실험 작업 흐름은 도식적으로 1에 요약되어 있습니다. 연구에 사용된 모든 재료 는 재료표에 설명되어 있습니다.

1. 곰팡이 물질의 검증 및 준비

1. 자료 수집 및 처리
   참고: 2023년 5월, 터키 중앙 아나톨리아 키르세히르 주의 초원과 모래 토지에서 신선한 T. claveryi 송로버섯이 채집되었습니다. 샘플링은 세 곳에서 이루어졌습니다: 데델리 마을(북위 38°54′15.8", 동경 34°06′40.3"; 해발 ~1050m), 부유카야파 마을(북위 38°53′45.1", 동경 34°19′37.5"; 해발 ~1020m), 악자길 마을(북위 39°01′39.9", 동경 34°12′39.8"; 해발 ~1100m)입니다. 채집지는 반건조 대륙성 기후로, 겨울은 춥고 여름은 덥고 건조하며, 연평균 강수량은 약 380–420mm입니다. 모든 샘플은 최근 농업 활동이 없는 자연 열매 기간 동안 수확하여 잠재적 인위적 오염을 최소화하였습니다.
   1. 깨끗하고 손상되지 않은 트러플을 골라 껍질을 벗기고, 증류수로 세 번 씻으세요.
   2. 샘플을 작은 조각으로 썰어 일정한 무게(약 20일)에 도달할 때까지 그늘 건조시킵니다.
   3. 기계식 분쇄기를 사용해 건조 물질을 분쇄하고 328마이크론(50메쉬) 체를 통과시킵니다.
   4. 처리된 샘플은 지퍼백에 넣어 시원하고 건조하며 어두운 실온 환경에 보관하여 추가 분석이 진행될 때까지 보관하세요.
2. T. claveryi의 분자 식별
   1. 분자 식별을 위해 건조된 T. claveryi 샘플에서 유전체 DNA를 분리합니다.
   2. DNA 양과 순도를 분광광도계로 평가하세요.
   3. 범용 프라이머 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGGGG-3′)과 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATGC-3′)를 사용하여 내부 전사 스페이서(ITS) 영역을 증폭하여 종 식별 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행합니다.
   4. 1x TAE 버퍼에서 준비하고 에티듐 브로마이드 염색 후 자외선 조명 하에 시각화한 1.5% 아가로스 겔에서 PCR 증폭 산물을 전기영동으로 분리합니다.
   5. 제조사 지침에 따라 단일 밴드 PCR 제품을 정제하세요²⁹. 정제된 증폭자를 생거 시퀀싱에 적용.
   6. contig assembly programme(CAP) 알고리즘을 사용하여 순방향 및 역방향 시퀀스 읽기를 합의 시퀀스로 변환합니다.
   7. 종 동일성은 공공 데이터베이스에 있는 참조 서열과 합의된 ITS 서열을 비교하여 확인되었습니다.
      참고: T. claveryi 의 바우처 표본은 향후 참고를 위해 실험실 컬렉션에 보관되었습니다. 종 확인은 ITS 기반 분자 분석(보충 파일 1)을 통해 확인되었습니다.

2. 곰팡이 물질 준비 및 추출

1. T. 클라베리 추출물 제제
   1. 약 30g 건조된 T. claveryi 가루의 무게입니다.
   2. 모든 추출 방법에서 고액 비율을 일정하게 유지하기 위해 150mL의 용매(메탄올, 아세톤, n-헥산, 에틸 아세테이트 또는 증류수를 포함)를 추가하세요.
   3. 모든 추출 절차에는 분석용 용매를 사용하세요.
   4. 각 추출물을 저압 상태에서 정성 필터 페이퍼로 필터링하세요.
   5. 로터리 증발기를 사용하여 30–45°C의 저압 압력에서 여과물을 농축합니다.
   6. 농축된 추출물을 동결건조(동염건조)하여 용매가 완전히 제거될 때까지 보관합니다.
   7. 건조 원유 추출물을 추가 분석할 때까지 −20 °C에서 보관하세요.
      참고: 방법론적 일관성과 비교 가능성을 보장하기 위해 모든 샘플에 동일한 추출 후 처리 단계를 적용하세요.
2. 생물물리학적 추출 방법
   1. 분쇄 보조 추출(MAE)
      1. 분말 T . claveryi 샘플을 밀폐 추출 용기에 넣으세요.
      2. 선택한 용매를 첨가하면서 용매 대 고체 비율을 일정하게 유지하세요.
      3. 혼합물을 어두운 실온에서 72시간 배양하세요.
      4. 용기 증발을 막기 위해 용기를 닫아두세요.
      5. 마세레이션 기간 동안 외부 교반을 하지 마십시오.
      6. 추출 기간이 끝날 때 혼합물이 가라앉도록 하세요.
      7. 추가 가공 전에 추출물을 여과하세요.
   2. 삭슬렛 추출 (SE)
      참고: 응축기 물 순환을 잘 유지하고 역류 시 건식 가열을 피하세요.
      1. 분말 샘플을 셀룰로오스 추출 골무에 넣으세요.
      2. 골무를 둥근 바닥 플라스크에 연결된 소크슬렛 추출실 안에 위치시킵니다.
      3. 선택한 용매를 플라스크에 넣으면서도 용매 대 고체 비율을 일정하게 유지합니다.
      4. 온도조절 가열 맨틀을 이용해 용매를 역류시키기 위해 가열합니다.
      5. 24시간 동안 지속적으로 발치하세요.
      6. 추출 온도는 각 용매의 끓는점(n-헥산: 68.7 °C; 에틸 아세테이트: 77.1 °C; 메탄올: 64.7 °C; 아세톤: 56 °C; 증류수: 100 °C)로 유지합니다.
   3. 초음파 보조 추출술(UAE)
      참고: 초음파 과열 방지를 위해 온도를 지속적으로 모니터링하세요.
      1. 분말 T . claveryi 샘플을 추출 용기에 넣으세요.
      2. 선택한 용매를 첨가하면서 용매 대 고체 비율을 일정하게 유지하세요.
      3. 혼합물을 35kHz의 고정 주파수와 520W 출력으로 25분간 소닉네이트합니다.
      4. 추출 온도를 약 30°C로 유지하세요.
      5. 소닉 처리 중 온도를 25–28 °C 이내로 유지하기 위해 5분 간격으로 얼음을 추가하세요.
3. 추출 효율
   1. 추출 전에 건조된 곰팡이 물질(W_p)을 무게를 재세요.
   2. 용매를 완전히 제거한 후 건조 원유 추출물(W_ext)을 무게를 재세요.
   3. 식(1)을 사용하여 추출 효율을 계산합니다.
      (1)
   4. 각 건조 원유 추출물을 해당 용매에 다시 용해하여 표준화된 농도인 10 mg/mL의 정액을 준비합니다.
   5. 각 시험관 내 생물활성 실험 전에 재고 용액을 신선하게 준비하세요.
      참고: 모든 추출물 농도를 표준화하여 이후 생체 활성 분석에서 비교 가능한 용량을 보장하세요.

3. 항산화 활성 결정

1. DPPH, ABTS, FRAP 분석을 사용하여 항산화 활성 분석을 수행하세요.
2. 갓 준비한 육즙 용액에서 0.25에서 1.0 mg/mL 사이의 다섯 가지 농도를 추출하세요.
3. 재현성을 보장하기 위해 모든 측정을 3부로 수행하세요.
4. 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 분광광도측정 방식으로 흡광도 값을 기록합니다.
   참고: 모든 검사는 소폭의 수정을 거쳐 확립된 문헌 프로토콜에 따라 수행하십시오.
5. DPPH 급진적 청소 활동
   참고: T. claveryi 추출물의 DPPH 급진 청소 활동은 문헌에 기술된 방법에 따라 평가되었으며, 소폭의 수정이^{있었습니다.} DPPH 용액과 반응 혼합물을 빛 노출로부터 보호하세요.
   1. 70% 메탄올에 DPPH 용액을 준비합니다.
   2. DPPH 용액을 517 nm에서 흡광도가 1.00± 0.02로 조정합니다.
   3. 추출물 50 μL를 다양한 농도로 마이크로플레이트 웰에 피펫팅합니다.
   4. 각 웰에 250 μL DPPH 용액을 추가합니다.
   5. 반응 혼합물을 어두운 실온에서 30분간 배양하세요.
   6. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용해 517 nm에서 흡광도를 측정합니다.
   7. 메탄올을 음성 대조군으로, 아스코르빈산을 양성 대조군으로 사용하세요.
   8. 용량-반응 곡선을 구성하고 IC₅₀ 값을 계산하여 급진적 청소 활동을 정량화합니다.
6. ABTS 양이온 라디컬 스캐빈저 활동
   참고: 문헌에 설명된 방법에 따라 ABTS 라디컬 스캐빈징 분석법을 수행하되, 약간의 수정을^{가해야 합니다}. ABTS의 라디칼 용액은 사용 최소 16시간 전에 준비하고 빛으로부터 보호하세요.
   1. 반응 혼합물을 어두운 실온에서 16시간 배양하여 ABTS 라디컬 용액을 생성합니다.
   2. 분석 전에 ABTS 용액 1mL를 에탄올 80mL에 희석하세요.
   3. 희석된 ABTS 용액의 흡광도를 734nm에서 0.80± 0.02로 조정합니다.
   4. 추출물 50 μL를 다양한 농도로 마이크로플레이트 웰에 피펫팅합니다.
   5. 각 웰에 250 μL ABTS 용액을 추가합니다.
   6. 혼합물을 실온에서 10분간 배양하세요.
   7. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용해 734 nm에서 흡광도를 측정합니다.
   8. 용량-반응 곡선을 구성하고 IC₅₀ 값을 계산합니다.
7. 철 환원 항산화 능력(FRAP) 분석
   참고: FRAP 검사는 문헌에서 제안된 방법에 따라 수행하며, 약간의 수정^{을 가합니다}. FRAP 시약은 사용 전에 신선하게 준비하고 반응 혼합물을 빛으로부터 보호하세요.
   1. FRAP 시약을 참조된 프로토콜에 따라 준비하세요.
   2. 다양한 농도의 추출물 20 μL를 마이크로플레이트 웰에 피펫 흡입합니다.
   3. 신선하게 준비된 FRAP 시약 280 μL을 추가합니다.
   4. 반응 혼합물을 실온에서 어두운 환경에서 45분간 배양하세요.
   5. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용해 593 nm에서 흡광도를 측정합니다.
   6. Trollox를 표준으로 사용하여 보정 곡선을 생성하세요.
   7. 항산화 용량은 추출물 1g당 트롤록스 당량(TE)으로 표현됩니다.

4. 총 페놀 함량(TPC) 분석

참고: 문헌에 설명된 Folin–Ciocalteu 방법을 사용하여 T. claveryi 추출물의 총 페놀 함량(TPC)을 측정하며, 약간의 수정이 있습니다.³³. 배양 중에는 반응 혼합물을 빛으로부터 보호하세요. 사용 전에 탄산나트륨 용액을 신선하게 준비하세요.

1. 신선하게 제조한 정액에서 1 mg/mL 농도로 추출액을 준비하세요.
2. 추출물 25 μL을 마이크로플레이트 웰에 피펫 넣고, 증류수 75 μL, 그리고 Folin–Ciocalteu 시약 25 μL를 추가합니다.
3. 혼합물을 실온에서 6분간 배양하세요.
4. 각 웰에 7% (w/v) 탄산나트륨 용액 100 μL을 추가합니다.
5. 반응 혼합물을 실온에서 어두운 환경에서 90분간 인큐베이팅하세요.
6. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용해 665 nm에서 흡광도를 측정합니다.
7. 갈산을 표준으로 사용하여 보정 곡선을 준비하고, 추출물 1mL당 mg 갈릭산 환가량(GAE)으로 결과를 계산합니다.

5. LC-MS/MS를 이용한 식물화학적 분석

참고: 이전에 발표된 크로마토그래피 방법에 따라 LC-MS/MS 분석을 수행하시고 소폭 수정^{사항을 포함하세요}. 모든 샘플과 이동상을 0.22μm 멤브레인 필터로 여과하고, 분석 전에 이동상을 탈기합니다.

1. 정량적 식물화학 프로파일링을 위해 총 페놀 함량이 가장 높은 추출물을 선택하세요.
2. 30°C에서 유지된 역상 C18 컬럼을 사용하여 크로마토그래피 분리를 수행합니다.
3. (A) 0.1% 제형산을 탈이온수에 넣고 (B) 0.1% 아세트니트릴에 개양산을 넣은 이동상을 준비하고, 유속을 0.4 mL/min으로 설정하며, 주입량을 5 μL로 조정하고 총 실행 시간을 17분으로 설정합니다.
4. 질소를 건조, 피복, 네뷸라이징 가스로 사용하여 전기분무 이온화(ESI) 조건에서 질량분석법 검출을 수행합니다.
5. 건조 가스 온도를 350 °C, 유량 12 L/min, 피복 가스 온도를 250 °C, 유량 5 L/min, 네뷸라이저 압력을 55 psi로 조정합니다.
6. 각 페놀 표준에 대한 외부 보정 곡선을 준비하고, 해당 보정 곡선을 사용해 분석 물질을 정량화하세요.

6. 항균 활성 검사

참고: 확립된 미생물학적 프로토콜에 따라 한천 우물 확산 방법을 사용하여 항균 활성을 평가하십시오. 모든 미생물학적 절차를 생물안전 캐비닛 내에서 무균 조건 하에 수행하세요. 사용 전후로 모든 재료를 멸균하세요.

1. 항균 검사를 위해 다음 유형균을 선택하세요: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, 대 장 균 ATCC 25922, 황색포도상구균 ATCC 25923, 장구균 FAECALIS ATCC 29212, 세레우스 박균 ATCC 14579, 표 피포도상구균 ATCC 12228, 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC 19115, 아시네토박터 바우만니 ATCC 17978, 시겔라 이질 증 ATCC 13313, 클렙시엘라 폐 렴 ATCC 13883 엔테로박터 에어로제네스 ATCC 13048.
2. 각 박테리아 균주를 트립톤 대두 육수(TSB)에 접종하여 최적의 성장 온도에서 배양하여 광학 밀도가 OD₆₀₀ = 0.7에 도달할 때까지 합니다.
3. 박테리아 배양물을 멸균 면봉을 사용해 트립톤 대두 한천(TSA) 플레이트에 균일하게 바릅니다.
4. 멸균된 코르크 보러를 사용해 한천에 무균으로 구멍을 내립니다.
5. 각 추출물(100 μg/mL)을 해당 웰에 100 μL씩 추가합니다.
6. 플레이트를 37°C에서 18시간 배양하세요.
7. 각 웰을 둘러싼 억제 영역의 직경을 측정하여 항균 활성을 평가합니다.
8. 모든 실험을 3배로 수행하고 결과를 평균값으로 표현하세요.

7. 바이오필름 억제

참고: 기준 박테리아 균주에 대해 결정 바이올렛 염색 분석법을 사용하여 항생체막 활성을 평가하십시오. 모든 시술은 무균 조건에서 수행하고, 세척 과정에서 부착된 바이오필름을 건드리지 않도록 하세요.

1. 기준 균주로 Escherichia coli ATCC 25922와 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853을 선택하여 37°C의 TSB에서 로그 성장 단계에 도달할 때까지 배양합니다.
2. 박테리아 현탁액을 광학 밀도 OD₆₀₀ = 0.132로 조정하세요.
3. 추출액 100 μL(0.625–10 mg/mL)을 멸균된 96웰 마이크로타이터 플레이트에 피펫 넣고, 각 웰에 100 μL 박테리아 현탁액을 첨가한 후 부드럽게 혼합합니다.
4. 플레이트를 37°C에서 24시간 배양하세요. 대조군으로는 TSB만 함유된 웰과 추출물이 없는 박테리아 현탁액을 포함하는 웰을 사용하세요.
5. 부착되지 않은 세포는 조심스럽게 제거하고, 웰을 증류수로 두 번 세척한 후 플레이트를 자연 건조시키세요.
6. 각 웰에 0.4% (w/v) 크리스탈 바이올렛 용액 200 μL을 추가하고 30분간 배양합니다.
7. 과도한 얼룩을 제거하고, 웰을 증류수로 두 번 헹군 후 플레이트를 완전히 마른다.
8. 결합된 염료를 용해시키기 위해 에탄올을 첨가하고, 마이크로플레이트 리더기를 사용해 595nm에서 흡광도를 측정합니다.
9. 항생제막 활성을 식(2)을 사용하여 계산합니다.
   (2)

8. 세포 배양 및 세포독성 활성 분석(MTT 분석)

참고: 표준 세포 생존 프로토콜에 따라 MTT 검사법을 사용하여 세포독성 효과를 평가하십시오. 모든 절차를 생물안전 캐비닛 내에서 멸균 조건 내에서 수행하며, 사용 전에 배지와 시약을 37°C까지 예열하세요.

1. 인증된 세포 저장소에서 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y를 추출하여, 25cm² 배양 플라스크에 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민을 보충한 Dulbecco's 변형 Eagle 배양지(DMEM)에서 세포를 배양합니다.
2. 배양물을 37°C에서 5%_CO2 가 포함된 가습 대기에서 유지하고, 세포를 약 80% 합류율로 배양합니다.
3. 트립신화로 세포를 분리하고, 웰당 2× 10⁴ 개의 밀도로 96웰 플레이트에 씨앗을 심고, 부착을 위해 24시간 배양합니다.
4. 세포를 150, 300, 600, 1200, 2000 μg/mL 농도로 추출 물로 처리 하고 24시간 배양합니다.
5. 배양지를 제거하고, 각 웰에 100 μL MTT 용액이 포함된 신선 배지 100 μL를 추가하여 37 °C에서 4시간 배양합니다.
6. 배지를 흡입하고, 각 웰에 100 μL 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해한 뒤, 마이크로플레이트 분광광도계를 사용해 570 nm에서 흡광도를 측정합니다.
7. 모든 실험을 세 번씩 수행하세요.

그림 1: 실험 워크플로우의 도식적 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

9. 통계 분석

1. 적절한 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 통계 분석을 수행하고, 학생 t검정 또는 양측 분산분석(ANOVA)을 사용하여 대조군과 처방군을 비교하세요.
2. 모든 데이터를 평균± 표준오차(SEM)로 표현합니다.
3. p < 0.05에서 통계적 유의성을 정의하라.
4. 통계적 유의성은 별표를 사용하여 다음과 같이 표시하세요: p < 0.0001은 ****, p < 0.001은 **, p < 0.01은 **, p < 0.05는 *, 그리고 비유의성은 "ns"를 사용하세요.

Results

T. claveryi의 분자 식별
ITS 영역의 PCR 증폭은 T . claveryi 의 분자 동정을 위해 범용 프라이머 ITS1과 ITS4를 사용하여 수행되었습니다. 결과된 서열은 BLAST 알고리즘을 사용해 NCBI 데이터베이스의 참조 서열과 분석하여 종 식별을 확정할 수 있었습니다(보완 파일 1).

추출 효율
추출 효율은 추출 방법과 용매 극성에 따라 달랐습니다(표 1). MAE 방식의 추출 효율은 다음과 같은 순서로 감소했습니다: 물> 메탄올, 에틸 아세테이트> 아세톤> 아세톤 > n-헥산(2.15–15.01%). SE와 UAE 방법도 유사한 용매 의존적 경향을 보였으며, 추출 효율은 다음 순서로 감소했습니다: 물> 메탄올 > 에틸 아세테이트> n-...

Discussion

본 연구는 T. claveryi에 대한 비교 및 표준화된 추출-생물활성 플랫폼을 확립하여, 추출 전략이 화학적 조성과 생물학적 기능 모두에 결정적인 영향을 미친다는 것을 입증합니다. 이 프로토콜의 주요 방법론적 강점은 추출 매개변수의 엄격한 제어, 특히 고정된 고체-액체 비율, 표준화된 용매 양, 동일한 추출 후 처리 과정, 그리고 바이오어세이 전 균일한 용액 준비에 있습니다. 이 단계들은 워크플로우 내의 중요한 제어 지점을 나타냅니다. 용매 부피의 변동성, 용매 제거 불완전, 재구성 농도의 불일정은 항산화제 또는 세포독성 비교에 상당한 편향을 줄 수 있습니다. 따라서 동일한 하류 준비 조건을 유지함으로써 관찰된 생물학적 차이가 농도 인공물이 아니라 질적 조성 변화를 반영하도록 보장했습니다. 또한 UAE와 수성 SE 기간 동안 온도 조절이 필수적이었습니다. 초음파 추출 중 공동현상은 국소적으로 고에너지 미세환경을 생성하여 질량 전달을 촉진할 수 있지만,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트	네스트 사이언티브	701001	세포 배양 / 분석 플레이트
ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산))	시그마-올드리치	A3219	양이온 라디컬 스캐빈징 분석법
아세톤 (분석등급)	시그마-올드리치	179124	추출 용매
아세토니트릴 (LC-MS 등급)	시그마-올드리치	34851	유기 이동상
아시네토박터 바우만니	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 17978
1290 인피니티 UPLC 시스템을 탑재한 트리플 쿼드 LC-MS/MS	애질런트 테크놀로지스	6460	정량적 분석
분석 기둥 (C18, 4.6 & 100 mm, 3.5 & mu; m)	애질런트 테크놀로지스 (조박스)	959990-902	역위상 컬럼
항산화 기준 (아스코르브산 / 트롤록스)	시그마-올드리치	A7506 / 238813	양성 대조군
응용 바이오시스템즈 3730xl DNA 분석기	응용 생명시스템	3730xl DNA 분석기	DNA 시퀀싱 시스템
응용 생명 시스템 및 무역; 빅다이 &트레이드; 터미네이터 v3.1 사이클 시퀀싱 키트	응용 생명시스템	4337455	생거 시퀀싱 키트
박테리아 세레우스	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 14579
생물정보학 분석, BioEdit 소프트웨어, 사용 알고리즘: CAP 조직 조립	아이비스 바이오사이언스	NA	시퀀스 어셈블리 소프트웨어
셀룰로오스 추출 골무	피셔브랜드&트레이드; 그리고 nbsp;	11724043	삭슬렛 추출에 사용
디메틸설폭사이드 (DMSO)	머크	102952	용매
DNA 분리 키트 (Plant&; 균류 DNA 분리 키트 (폴란드)	EurX 유전자매트릭스	E3595	DNA 분리
DPPH (2,2-디페닐-1-피크릴히드라질)	시그마-올드리치	D9132	급진적 청소 분석
둘벡코의 변형 독수리 미디엄	염소자리, 그리고 nbsp;	맘하
엔테로박터 에어로젠	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 13048
장구균 대소	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 29212
대장균	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 25922
에탄올	머크	100983	용매
에틸 아세테이트	머크	109623	추출 용매
태아 소 혈청 (FBS)	카프리콘 사이언티픽	FBS-16A
BigDyeTerminator v3.1 사이클 시퀀싱 키트	서모피셔	4337455	시퀀싱 키트
폴린-치오칼테우 시약	시그마-올드리치	47641	총 페놀 함량
개미산	시그마-올드리치	33015	이동상 가산법
갈릭산	카를로 에르바	406335	보정 곡선
유전자 매트릭스 플랜트& 곰팡이 DNA 분리 키트	EurX	E3595	DNA 분리 키트
그래프패드 프리즘 (v9)	데이터 시각화 및 통계 분석	해당 없음	통계 분석
가열 맨틀	전기열(Electrothermal) 및 nbsp;	EME30500	용매 역류를 유지하기 위해 사용됩니다
하이프렙&트레이드; PCR 정화 시스템	마그비오	AC-60005
얼음	실험실 등급	—	UAE 내 온도 조절
클렙시엘라 폐렴	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 13883
L-글루타민	카프리콘 사이언티픽	독일
리스테리아 모노사이토제네스	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 19115
라이오필라이저	사이엔츠	해당 없음	추출물의 동결 건조
자기 비드 및 대시; 기반 PCR 정화 시스템	마그비오	AC-60005	PCR
메탄올	머크	106009	추출 용매
n-헥산	머크	103701	추출 용매
페니실린/스트렙토마이신	카프리콘 사이언티픽	독일
Pseudomonas aeruginosa(슈도모나스 아에루기노사)	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 27853
필터 페이퍼 (No. 541)	시티바	1541-125 V	추출물 여과 과정에서
회전 증발기	부치 R100	11100V101	용매 제거
시겔라 이질증	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 13313
탄산나트륨	머크	106392	총 페놀 분석
SPECTROstar 나노 마이크로플레이트 리더기	BMG 랩텍		흡광도 측정
황색포도상구균	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 25923
포도상구균 표피	ATCC	미국 버지니아주 매너서스	ATCC 12228
통계 분석 소프트웨어 (SPSS, v23)	데이터 분석	NA
서모 사이언티픽 나노드롭 2000	써모피셔 사이언티브	ND-2000
트립톤 대두 아가르 (TSA)	머크	독일	—
트립톤 두장 육수 (TSB)	머크	독일	—
초음파 균질기	사이엔츠	SCIENTZ-650L	초음파 보조 추출