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방법 논문

온도 조절 심장 보존 중 심장 에너지 연속 측정을 위한 인-31 자기공명 분광법

310 조회수

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DOI:

10.3791/70070

⸱

2026년 3월 17일

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Division of MR Research, Russell H. Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 4Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pediatric Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 글에서는 장기 보존 중 심근 에너지를 연속적이고 정량적으로 평가할 수 있는 체 외 외부 인-31 자기공명 분광법을 위한 재현 가능하고 온도 조절 프로토콜을 설명했습니다.

초록

신뢰할 수 있는 장기 보존은 기증자 가용성을 높이고 이식 결과를 개선하는 데 매우 중요합니다. 기증자 심장의 표준 보관은 여전히 표준이지만, 보존 기간 동안 심근 에너지를 정밀하게 모니터링할 방법이 필요합니다.

인-31 자기공명 분광법(31P MRS)은 인인크레아틴(PCr), 아데노신 트리인산(ATP), 무기인산(Pi), 세포내 pH 등 주요 에너지 대사산물의 직접적이고 동적인 측정을 가능하게 합니다. 이 기술은 체 외 저장 기간 동안 심근 대사 상태를 종단적, 정량적, 정밀하게 평가할 수 있게 합니다. MRS의 장점으로는 에너지 상태의 동적 평가와 심실 에너지의 전반적 평가가 있습니다.

프로토콜은 돼지 기증자 회수, 심마비 투여, 그리고 심장 절제술로 시작됩니다. 대동맥궁은 상완두동맥 줄기통 근위부에서 절단되어 올라가는 대동맥의 길이를 극대화합니다. 리브가 있는 캐뉼라가 원위 상행 대동맥에 고정되고, 왼쪽 심방에는 표시가 있으며, 심장은 온도에 따라 특정 심마비가 미리 채워진 원통형 단열 용기에 넣습니다. 뚜껑은 캐뉼라에 연결되어 심장을 안에 매달고, 용기는 밀봉되어 1시간 동안 1°C 이내의 온도를 유지합니다.

용기는 인으로 조율된 코일을 위한 구멍이 있는 맞춤형 스티로폼 상자에 넣어, 코일 중심이 좌심실(LV) 중심과 일치하도록 합니다. 정찰 영상이 31P코일 근처에 LV 위치를 확인해 줍니다. B0 시미킹은 균일한 여기를 보장하며, 이후 비국소화된 31P MR 스펙트럼을 획득합니다. 후처리는 PCr/ATP, PCr/Pi 비율, 세포 내 pH 계산을 위한 스펙트럼 피크를 식별합니다.

우리 프로토콜에서는 31P MRS를 0시점부터 8시점 사이의 연속 시점에서 시행합니다. 시간 간격으로 심장은 원하는 온도의 표준 저장 장치에 저장됩니다.

31P MRS는 에너지 소모의 시간 의존적 변화와 저장 온도가 시간에 따라 에너지 소모를 완화하는 역할을 연구할 수 있게 했습니다.

서론

심장 이식은 말기 심부전 환자들에게 결정적인 치료법으로 남아 있습니다. 그러나 적합한 기증자 장기의 지속적인 부족과 현재 보존 전략의 한계는 최적의 결과와 이식 가능성 확대에 큰 장애물입니다 2,3. 전통적으로 기증자 심장은 냉정적 저장(cold static storage)으로 보존되는데, 이는 간단하고 비용 효율적이지만, 장기간 운송 중 아임상적 에너지 고갈에 취약합니다 2,4. 프로그램이 점점 더 위험도가 높고 지리적으로 먼 장기를 수용함에 따라, 허혈 시간과 총검사에만 의존하지 않고 보존 중 심근의 대사 상태를 객관적으로 평가할 수 있는 도구에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 또한 심근 대사와 허혈 내성은 온도에 크게 영향을 받으며, 냉각 부족과 과도한 저체온증은 저장 중 에너지 소진과 세포 손상을 악화시킬 수 있습니다. 따라서 기증자 심장을 여러 임상적으로 관련 있는 보존 온도에서 평가하는 것은 시간이 지남에 따라 심근 생존력을 유지하는 데 가장 적합한 상태를 식별하는 데 도움이 됩니다.

보관 중 심근 생체에너지를 정확하고 동적으로 평가하는 것은 보존 기술을 개선하고 장기 활용을 극대화하는 데 필수적입니다. 현재 표준 관행은 약 4-8 °C8 범위 온도에서 정적 냉장 저장에 의존하고 있습니다. 이 프로토콜은 짧은 저장 기간 동안 성공적인 결과를 보였지만, 이 온도에서의 장기간 보관은 심근의 무결성을 위협할 수 있습니다. 따라서 성공적인 장기 이식을 보장하기 위해 최적의 저장 조건을 구분하기 위해 다양한 온도와 지속 시간에 걸쳐 대사 활동을 연속적으로 측정하는 것이 필수적입니다. 보존 손상의 기존 평가는 종종 침습적이고 파괴적이며 간헐적이고 지역적인조직 상태 스냅샷만 제공하는 심근 생검사 또는 생화학적 검사에 의존합니다. 반면, 인-31 자기공명 분광법(31P MRS)은 강력한 비파괴 방식으로, 인산크레아틴(PCr), 아데노신 삼인산(ATP), 무기인산(Pi), 세포내 pH 등 주요 에너지 대사산물을 온전한 심장 조직 6,10,11,12 내에서 직접 직렬적으로 측정할 수 있게 합니다. 동일한 장기에서 추가 조직 취급 없이 반복 측정을 가능하게 함으로써, 31P MRS는 심근 에너지 상태에 대한 전역 및 종단적 통찰을 제공하여 생검 기반 또는 혈청 대리체 접근법에 비해 실험적 정밀도와 재현성을 향상시킵니다 6,13.

31P MRS에 의한 심장 이식편 생존 가능성 평가는 Bernard 등에 의해 검토되었습니다14. 여기서는 보존 중 돼지 심장의 체외 3 Tesla 31P MRS에 대한 상세하고 온도 조절된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 기질 고갈을 모니터링하고, 저장 변수를 테스트하며, 보존 개입을 검증하는 실질적인 틀을 제공합니다. 이 프로토콜은 온도 의존적 보존, 허혈-재관류 손상, 한계 및 확장 기준 기증자 심장에 대한 용액 최적화 연구와 같이 정적 냉간 보관 중 연속 전심실 측정을 추구하는 실험실에 특히 적합합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 기관 동물 관리 지침을 따르며, 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호 SW24M319)에서 수술 수확까지 포함한 모든 생체 동물 시술에 대해 승인받았습니다. 이후 모든 체외 실험은 안락사 후 얻은 조직을 사용해 수행되었다.

1. 사전 수확 절차

  1. 인큐베이터의 온도를 목표 보존 온도보다 2°C 낮게 설정하세요. 인큐베이터를 최소 2시간 이상 안정시키세요.
  2. 인큐베이터에 6-7개의 얼음팩을 넣어 미리 정해진 온도로 냉각하세요. 운송 중 온도를 유지할 수 있을 만큼 얼음팩이 충분한 양인지 확인하세요.
  3. 수정된 세인트 토마스 심마비 용액을 준비하세요:
    1. 락테이트 링저 용액 백 1L 안에 추가하세요.
      1. 8.4% 중탄산나트륨 30 mL
      2. 30 mmol 5mL / 염화칼륨 10 mL
      3. 20 mmol/10mL 황산마그네슘 2.5 mL
      4. 50% 포도당 15mL
      5. 50mg/10mL 니트로글리세린 100mg
      6. 5000 U의 차가운 에리스로포이에틴
    2. 총 3L의 심마비 용액을 준비하여 미리 냉각된 인큐베이터에 보관하세요.
  4. 단열된 쿨러는 심장의 수직 높이를 최적의 위치에 올릴 수 있도록 내장된 실리콘 튜브를 따로 두세요. 쿨러 뚜껑 입구 끝 바로 아래에 있는 실리콘 튜브 위에 검은색 기준 표시를 남기세요.
  5. 채취한 심장을 고정하고 매달기 위해 갈비가 있는 캐뉼라를 따로 마련하세요. 캐뉼라 바깥 표면에 검은색 기준 표시를 하여 재현 가능한 정렬 지점으로 활용하세요.

2. 수확 절차

  1. 텔라졸, 케타민, 자일라진을 단일 주사기에 섞어 근육 주사로 투여하여 여러 차례 주사에 따른 스트레스와 통증을 최소화하기 위해 동물을 진정시킵니다.
    1. 텔라졸(50mg 틸타민 + 50mg 졸라제팜)을 각 성분별로 4.4 mg/kg으로 투여합니다.
    2. 케타민 2.2 mg/kg.
    3. 자일라진은 2.2mg/kg입니다.
  2. 동물을 기관내 삽관하고 마취하세요.
    1. 조수 부피는 5-10 mL/kg입니다.
    2. 호흡 속도는 분당 12-15 번입니다.
    3. 호기량 양압, 5cm h,2O.
    4. 산소 흐름은 분당 1-2 L에 0.5-2% 흡입 이소플루란.
  3. 말초 정맥 주사 관을 삽입하고 흉골 절개술을 시행하며 심막15를 열어주세요. 필요 시 항부정맥제를 투여하세요.
  4. 심마비 바늘을 상행 대동맥에 놓고, 대동맥판 위, 대동맥궁 아래에 위치시킵니다.
  5. 1L 심마취 용액을 바늘에 꽂아 연결하세요.
  6. 왼쪽 심방, 하대정맥, 상대정맥을 환기하세요.
  7. 아치 근위부에 대동맥 교차 클램프를 부착하세요.
  8. 관상동맥을 통해 약 75-80 mmHg의 압력으로 심마비를 시작하세요. 인라인 게이지를 사용해 압력을 모니터링하세요.
  9. 해부학적 무결성을 유지하면서 심장을 채취하세요.
  10. 미리 차가운 식염수를 수확한 심장 위에 부어 표면을 빠르게 식힙니다.
  11. 심장을 차가운 심마비 용액이 담긴 그릇에 넣으세요.
  12. 심장 꼭대기에 심근 온도 탐침을 삽입하고, 심마비 용액 그릇에 체온계를 넣어 체온을 측정하세요.
  13. 대동맥을 폐동맥(PA)에서 분리하세요.
  14. 대동맥에 리브가 있는 캐뉼라를 실크 타이와 지퍼 타이로 고정하되, 표시된 부분이 좌심실(LV) 위치와 일치하는지 확인합니다.
  15. 쿨러를 세인트 토마스 용액으로 60-70% 용량으로 채운 후, 심장과 그릇의 용액을 쿨러로 옮겨 완전히 채워 최대한 침입을 극대화하세요.
  16. 최종 용액과 조직 온도를 측정하고 기록하세요.
  17. 리브 캐뉼라를 미리 정의된 표시에 실리콘 튜브로 쿨러 뚜껑에 부착하세요. 리브 캐뉼라와 실리콘 튜브의 표시가 정렬되어 쿨러가 닫혔을 때 LV가 뚜껑에 대해 일정한 방향을 유지하도록 하여 모든 스캔에서 LV의 재현 가능한 위치를 보장합니다(그림 1A).
  18. MR 데이터 수집 중 최적의 MR 필드 균질성과 좋은 신호 대 잡음비를 보장하기 위해 기관을 디에어(Deair)합니다.
  19. 쿨러 뚜껑을 고정해 LV 정렬을 확인하세요.
  20. 얼음찜질팩과 쿨러를 운송 가방에 넣으세요.

3. 분광 프로토콜

  1. 이 프로토콜은 3T MR 스캐너에 최적화되어 있습니다. MR 스캐너는 4kW 광대역 고주파 증폭기와 수신기를 포함한 다중 핵 분광 옵션을 갖추고 있으며, 표준 공급업체 제공 인 코일(P140)도 포함되어 있습니다. 31P코일은 직경 14cm의 단일 루프 송수신 코일로, 튜닝 및 매칭을 위한 두 개의 로드가 있습니다.
  2. 이송 전에 MRI 시설 직원에게 알리고 스캔 가능 여부를 확인하세요.
  3. 다음 외부 치수의 스티로폼 상자를 준비하세요: 길이 33.5cm, 너비 28cm(긴 가장자리), 너비 23cm(짧은 가장자리), 두께 4cm. 상자 한쪽에 3.3cm 폭의 틈을 만들어 31P코일을 심장 옆에 배치할 수 있게 합니다(그림 1B).
  4. 쿨러를 코일 중심축 옆에 매달린 하트를 삽입하여 저중심 위치를 목표로 합니다(그림 1C). 높이 25.4cm, 너비 11.4cm의 쿨러를 준비하세요. 실리콘 튜브는 눈꺼풀 안쪽 표면에서 7cm 거리, 심장 장착 지점에 고정되어 있습니다(그림 1D).
  5. 쿨러 주변 틈에 얼음찜질을 넣고, 쿨러와 코일 사이에 공간을 만들지 않도록 주의한 후, 스캔 시 안정성을 보장하기 위해 박스 뚜껑을 테이프로 감아주세요(그림 1E).
  6. 레이저 가이드와 중심 정렬 랜드마크를 사용해 쿨러를 자석 등중심선에 맞춰 최적의 B0 균질성을 보장합니다(그림 1F).
  7. 31P코일을 스캔 커넥터에 꽂고 튜닝 및 매칭 로드를 코일에 부착하세요(그림 1F).
  8. 3면면 로컬라이저 스카우트 이미지를 획득하여 코일 위치와 31P 코일과의 최적 LV 근접성을 확인한다(그림 2).
  9. LV 위치가 잘못되면 쿨러 뚜껑을 돌리고 정찰 검사를 다시 실행하세요.
  10. 고스펙트럼 품질에 필요한 관심 영역 전역에 균일한 자기장을 보장하기 위해 국소화된 2차 시밍16에 대한 정적 장 B0-맵을 획득합니다:
    1. B0-맵을 획득한 후, "Shimtool"16 이 해당 맵을 로드한 상태로 자동으로 발사됩니다(그림 3).
    2. 모든 슬라이스에서 심장 근육을 따라 윤곽을 드러내는 다각형의 클릭 포인트들(그림 3A).
    3. "Shimtool"은 제약 최소제곱 적합을 수행하여 국소화된 공명 주파수와 1차(x, y, z), 2차(xy, xz, yz, x2-y 2, z2-(x2+y2)/2) 심 필드 보정을 결정합니다(그림 3C). 이 보정 용어를 스캐너에 업로드하고 다음 스캔에 적용하세요.
  11. 31P MRS 획득 전에 코일의 튜닝 로드를 돌려 라디오 주파수 코일의 최적 튜닝을 보장하고 임피던스를 MR 시스템에 맞추어 신호 전송 효율을 극대화하고 라디오 주파수 시스템 내 반사를 최소화합니다(그림 4).
  12. 초기 비국소화 31PMR 스펙트럼(반복 시간 [TR]: 10초, 플립 앵글 = 90°, 단열 B1-비민감 회전-4(BIR-4) 펄스를 사용; 에코 시간 [TE] = 0.1 ms; 대역폭=3000 Hz; 1024 스펙트럼 포인트, 5 평균)를 획득하여 PCr과 γ-ATP 피크 사이 중심의 공명 주파수를 결정합니다. 총 획득 시간: 50초.
  13. 그 후 3.12 계산을 바탕으로 오프셋 주파수를 조정한 후 완전히 이완된 비국소화 31P MR 스펙트럼을 획득합니다(TR: 16초, 반립각 = 90°, 단열 BIR-4 펄스를 사용; TE = 0.1 ms; 대역폭 = 3000 Hz; 512개의 스펙트럴 포인트, 평균 20개). 총 획득 시간: 5분 20초.
  14. 스캔 후에는 체액과 심근 온도를 측정합니다; 목표물과의 편차가 ≤1 °C로 되도록 보장합니다.
  15. 다음 예정된 스캔 때까지 인큐베이터에 원하는 온도로 심장을 보관하세요.

4. 데이터 분석

  1. 완전히 이완된 31P MRS 데이터를 .로 내보내세요. SDAT 데이터 파일을 처리하기 위해 그래픽 사용자 인터페이스로 로드합니다(그림 5A)17.
  2. 먼저 15Hz 로렌츠 필터(그림 5B)를 사용해 스펙트럼을 아포다이즈하고, 0차 및 1차 위상 이동을 적용한 후 PCr 피크 중심에서 주파수를 0백만분의 1(ppm)로 설정합니다(그림 5C).
  3. 표 1에 나열된 지식값을 사용하여 AMARES 함수18을 사용하여 스펙트럼을 적합시킵니다.
  4. 다음 창(그림 6)에서 적절한 적합성을 위해 분석 결과를 검토하며, 각 피크가 올바르게 식별되었는지(개별 성분)와 분석 후 잔류 신호가 최소화되었는지 확인하세요(잔류).
  5. 분광적 피크 진폭을 바탕으로 심근 대사체 비율 PCr/ATP 및 PCr/Pi를 계산합니다(그림 7). γ-ATP 공명은 ATP의 척도로 사용됩니다.
  6. 조정 후 Pi와 PCr 간의 화학 이동을 바탕으로 세포 내 pH를 계산하여 온도조건 14를 반영합니다.
    참고: 프로토콜은 각 MRI 스캔 후 일시정지할 수 있습니다(3.15단계). 온도 조절이 항상 유지되도록 하세요.

5. 방정식

  1. 앞서 설명한 대로, 세포 내 pH(pHi)를 계산하세요19:
    방정식 1
    여기서 T는 온도(°C), δ0 은 PCr과 Pi 공명 간 관측된 화학적 이동 차이(ppm)입니다.

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결과

국소화된 2차 시밍16 은 관심 영역 전반에 걸쳐 보다 균일한 B0 자기장을 만들었으며, 이는 각 시점에서 표준편차가 감소하는 것으로 나타났습니다(0 h: 14.0 Hz에서 4.0 Hz; 4 h: 17.5에서 3.2 Hz; 8 h: 16.0에서 3.2 Hz). 이로 인해 각 시점에서 우수한 스펙트럼 품질이 달성되었습니다(그림 7). 체 외 냉장 보관 중 심근 대사 변화는 고에너지 인산염 저장의 급격한 고갈과 점진적인 세포 내 산성화를 나타냅니다. 모든 측정 매개변수인 PCr/ATP, PCr/Pi, 세포 내 pH 모두에서 가장 급격한 감소는 정적 냉장 후 첫 4시간 이내에 발생하며, 이는 초기 보존 기간 동안 대사 취약성이 높아졌음을 반영합니다. 이 단계 이후에는 추가 악화가 점진적으로 진행되어 8시점에 에너지 저장량이 최소한에 가까워지고 현저한 산증이 관찰됩니다(

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토론

이 원고는 심장 보존 중 심근 에너지의 연속 평가를 위한 수술 준비와 31P MRS 획득 및 분석 프로토콜을 설명합니다. 31P MRS는 다양한 냉장 저장 온도에서 주요 심장 대사산물을 연속적이고 비파괴적으로 평가할 수 있게 하여 심근 조직의 대사 생존성에 대한 새로운 통찰을 제공합니다. 이 31PMRS 프로토콜은 비교적 빠르며, 최소한의 스캐너 시간으로 조직 온도 변화가 나타나기 전에 심장 에너지 상태를 평가할 수 있습니다. 이 접근법은 다른 대형 동물 모델에도 적용 가능하며, 관류 이식 후 에너지 대사를 목표로 하는 체외 내 플랫폼이나 중재로 확장될 수 있습니다.

이 프로토콜의 핵심 단계는 수확 및 스캔 후 구간 모두에서 정확한 체온 모니터링을 포함하며, 심근 체온을 엄격한 한도 내에서 유지하는 것이 대사 생존 능력을 유지하고 MR 결과를 재...

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공개 사항

우리는 이해 충돌이 없습니다.

감사의 글

존스 홉킨스 심장외과 및 방사선학과 팀이 이 연구를 성공적으로 수행할 수 있도록 감사드립니다. 이 연구는 미국 흉부외과학회(AATS)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인큐베이터벤치마크 사이언티픽 H2265-HCMyTemp 65HC 가열 냉각 인큐베이터
단열 쿨러게토레이UPC 052000047097게토레이 단열 스포츠 음료 쿨러
jMRUI 버전 7.0자바www.jmrui.eu데이터 분석을 위한 그래픽 사용자 인터페이스
심근 온도 탐침드로열81-030415DeRoyal 400 시리즈 심근 체온 탐침 (15mm)
자기공명 스캐너필립스https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imaging아치에바 3T, 필립스 헬스케어
단일 루프 인 코일필립스 헬스케어 https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140, 필립스 헬스케어

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