RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용법

요약

여기서는 RNA 관련 염색질-DNA 상호작용을 포착하여 RNA 관련 3차원 게놈 조직을 매핑하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

RNA-연합 염색질(RNA-DNA 상호작용법, RDD)은 특정 RNA에 의해 고정된 염색질 상호작용을 매핑하기 위한 표적 전략입니다. 동시에 관심 있는 RNA와 관련된 유전체 유전자좌를 식별하고, 이들 좌위 간의 장거리 DNA-DNA 접촉을 해소하여 공간적 조직과 조절 관계를 추론할 수 있게 합니다. RDD에서는 표적 RNA와 상보적인 바이오티닐화된 안티센스 프로브가 RNA-염색질 복합체를 풍부하게 하는 데 사용됩니다. 세포는 교차결합되고, 크로마틴은 단절되어 끝 복구되며, 포획된 복합체 내에서 공간적으로 인접한 DNA 조각을 연결하는 설계된 링크자를 사용하여 근접 연결이 수행됩니다. 연결 생성물은 정제되어 시퀀싱 라이브러리로 전환된 후 고처리량 시퀀싱으로 분석되어 RNA 고정 상호작용 지도를 생성합니다. RDD는 내인성 RNA뿐만 아니라 숙주 감염 미생물과 바이러스에서 유래한 외인성 RNA에도 적용 가능하며, 다양한 세포 유형과 실험 조건에 적합하다. 이 방법은 인핸서-프로모터 쌍, 장거리 조절, 조절 코딩 및 비암호화 RNA와 관련된 3차원 유전체 구조를 해부하는 데 적합한 유전자 좌위 특이적 고해상도 접촉 프로필을 제공합니다. 생화학적 농축과 근접 연결, 차세대 시퀀싱을 통합함으로써, RDD는 RNA가 어떻게 크로마틴을 조직하고 유전자 발현에 영향을 미치는지 밝히는 견고하고 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

서론

Hi-C와 ChIA-PET는 3차원(3D) 게놈 조직 연구를 혁신적으로 변화시켰으며, 이는 염색질 조각 간 공간적 근접성을 공유 공유 DNA 접합부로 변환하여 루프에서 구획 ^1,2에 이르는 규모 간의 물리적 접촉을 추론할 수 있도록 시퀀싱할 수 있게 했습니다. 단백질 외에도 수많은 RNA가 염색질 상호작용에 참여하여 증강자/억제자-프로모터 통신과 고차 염색질 조직에 영향을 미칩니다^. 그러나 단백질 고정 분석법의 발전에도 불구하고, 특정 RNA가 결합된 유전자좌 간 장거리 DNA-DNA 상호작용을 어떻게 조직하는지 직접 규명하는 것은 여전히 어렵습니다. RNA-Associated Chromatin DNA-DNA 상호작용 방법(RDD)⁴의 궁극적인 목표는 고해상도, RNA 고정 크로마틴 상호작용 지도를 생성하여 정의된 RNA 종이 어떻게 염색질과 결합하고 국소 이웃 내에서 DNA-DNA 접촉을 조율하는지 밝혀내는 것입니다. 이를 통해 증강자/억제자-프로모터 통신과 해당 RNA 중심의 고차 게놈 구조에 대한 메커니즘적 추론을 가능하게 합니다⁵. 방법론적으로 RDD는 관심 RNA에 대한 바이오티닐화 안티센스 프로브로 가교 RNA-염색질 복합체를 풍부하게 만들고, 공간적으로 인접한 DNA 조각을 연결하는 설계된 링커를 이용해 복합체 근접 결합을 수행하며, 감염된 숙주 내 외부 박테리아 또는 바이러스 RNA가 포함된 다양한 세포 유형과 조건에서 가설 기반 분석에 적합한 유좌 특이적 접촉 프로필을 생성하는 시퀀싱 라이브러리를 구축합니다. 이러한 특징들은 RDD를 기존 염색체 구성법에 대한 RNA 고정 대응 수단으로 위치시키며, 조절 분석에 적합한 해상도로 해석 가능한 접촉 정보를 제공합니다.

RDD의 근거는 기존 RNA-염색질 매핑 전략의 한계에서 비롯됩니다. ChIRP-seq와 CHART-seq와 같은 표적 포획 접근법은 단일 RNA의 유전체 전체 DNA 점유를 식별하며, 이는 점유된 유전자 ^6,7 사이의 결합을 보고하지만 물리적 DNA-DNA 접촉은 보고하지 않는 모든 DNA 패러다임을 식별합니다. GRID-seq와 MARGI를 포함한 글로벌 분석법은 모든 RNA와 모든 DNA로 확장되어 RNA-DNA 근접성을 유전체 전체에 걸쳐 기록하지만, RNA 중심 복합체 내 DNA-DNA 접촉의 명시적 해상도는 부족합니다 ^3,8. RD-SPRITE와 같은 다중화 방법은 많은 RNA와 DNA 유위 간의 고차 공동배치를 보고하며 핵 위상수학⁹의 측면을 전달하지만, 신호는 일반적으로 풍부한 RNA에 의해 지배되어 저번도 조절 RNA를 가리고 단일 RNA의 상호작용 네트워크의 표적 깊이를 제한할 수 있습니다. ChIA-PET¹⁰, PLAC-seq¹¹, HiChIP¹²와 같은 단백질 또는 마크 고정 농축 및 연결(enrichment-plus-ligation) 전략은 인자 중심 루프를 효과적으로 매핑하지만, RNA 특이적 포획 모듈 없이는 상호작용을 정의된 RNA에 고정하지 않아 RNA 고정된 DNA-DNA 차원을 해결하지 못합니다. 표적 생화학적 농축과 온-복합체 근접 연결을 통합함으로써^{, RDD}는 관심 RNA가 공존하는 염색질 조각 간의 DNA-DNA 접촉을 직접 포착하고, 저에서 중간 정도 풍부도의 RNA에 대한 민감도와 특이성을 높이며, 점유 중심(ChIRP/CHART)^6,7 및 근접 중심 글로벌 방법(GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE)³을 보완하는 고해상도 유전자 특이적 접촉 지도를 생성합니다^{. 8,9}는 단백질 인자 고정 연결 전략(ChIA-PET/PLAC-SEQ/HiChIP)과 개념적으로 유사하며, 10,11,12. 독자들은 생물학적 질문이 특정 표적 RNA와 관련된 염색질 유전자 좌위 간의 공간적 관계를 해결해야 할 때 RDD를 고려해야 합니다. 특히 그 RNA가 장거리 유전체 상호작용을 받아, 다리 역할을 하거나 전사를 조율하기 위해 장거리 유전체 상호작용을 제한하는 역할을 할 때 — 또는 RNA의 결합 집합에서 추정 조절 표적을 우선시하고, 직접적인 RNA 중심 허브와 단순한 공용 점유를 구분할 때 RDD를 고려해야 합니다. 특정 RNA의 증강자/억제자 네트워크를 구분하거나, 교란, 발달 단계 또는 감염을 넘어 RNA 고정 접촉의 재배선을 추적하는 것. 이러한 상황에서 RDD는 RNA 고정된 DNA-DNA 상호작용 정보를 엄밀한 기전 연구에 필요한 민감도, 특이성, 해상도로 전달함으로써 충족되지 않은 필요를 해결합니다.

프로토콜

참고: 이 RDD 방법에서는 예시 시스템이 초 파리 S2 세포와 roX2 및 7SK ncRNA를 모두 사용합니다; 반응 시약은 표 1에, 완충 조성은 표 2에, 시약 및 기기 세부 사항은 재료 항목에 나열되어 있습니다. 그림 1 은 RDD 라이브러리 생성 프로토콜에 대한 개요를 제공합니다. 회전(F8)이 포함된 절차는 다음과 같은 매개변수를 사용합니다: F8, 20 rpm, uu20, 그리고 UU30. 2단계부터 10단계까지 사용한 모든 버퍼에는 1배의 단백질효소 억제제(PI)와 RNase 억제제(RI, 0.05 U/μL)를 새로 보조합니다.

프로브 설계 원칙: 새롭고 보고되지 않은 RNA의 경우, Stellaris 프로브 디자이너로 온라인으로 프로브를 설계한 후, 정렬 도구(예: BLAST-like 정렬)나 UCSC BLAT를 사용해 비특이적 서열을 필터링한 후, 선택된 프로브에 3′-비오티닐화를 적용합니다. 새로운 표적 RNA의 경우, 표적 RNA와 일치하는 서열을 설계하여 음성 대조군으로 사용하며, 역시 3′-바이오티닐화를 적용합니다. 품질 관리는 표적 RNA에 대한 역전사 프라이머를 설계하여 전사 검증을 수행하고, qPCR을 위한 유전체 DNA 표적 프라이머를 설계하여 오염 여부를 평가하는 것을 포함합니다; 결합 특이성을 평가하기 위해 유전체 결합 부위와 비결합 영역을 찾는 프라이머를 포함합니다. roX2 및 7SK 관련 프로브는 표 1에 제공되어 있습니다.

1. 세포 수확과 이중 가교

1. 초파리 S2 세포를 27°C에서 배양합니다. 총 약 3 x 10⁹ 셀을 수집하는 것을 목표로 합니다. 세포를 배양지에 직접 재현탁시키고, 트리판-블루 카운팅 후 각 50mL 원뿔형 원심분리관에 8 x 10⁸개의 세포를 분리합니다.
   1. 세포 2 μL과 DPBS 8 μL을 혼합하고, Trypan Blue 10 μL을 추가한 후 세포 계수를 위해 헤모사이토미터에 로드합니다.
      참고: 초파리 S2 세포를 예시로 제시합니다. 일반적으로 8 x 10⁸ 세포는 단일 50 mL 원뿔 튜브에서 약 40 mL의 배양 부피에 해당합니다. 사용자는 사용되는 세포 유형과 목표 RNA의 풍부도에 따라 배양 조건을 조절하고 세포 양을 채취할 수 있습니다.
2. 포름알데히드를 최종 농도인 1%(w/v)로 넣고 27°C에서 20분간 회전시킵니다.
   참고: 배양 온도 또는 실온(RT; 20-25°C)에서 고정을 수행하십시오. 특별한 언급이 없는 한, 믹서(F1, 12rpm)에서 회전하세요. 부착 셀의 경우, 50rpm의 궤도 셰이커를 사용하세요.
   주의: 포름알데히드는 독성이 있습니다; 훈제개를 사용하세요.
3. 845 x g 에서 5분간 RT 페릿 세포; 상정액은 적절한 화학/생물학적 폐기물에 버립니다. 8 x 10⁸ S2 세포의 세포 펠릿은 일반적으로 약 1 cm³ 크기입니다.
4. 신선하게 준비된 2 mM EGS에 펠릿을 재현탁하여 총 부피 40 mL의 DPBS로 만들고, 27 °C에서 40분간 회전시킵니다.
   참고: EGS를 DMSO에서 해산하고 DPBS로 이전하세요( 표 2 참조). DMSO의 EGS는 위험합니다.
5. 2.5 M 글리신 2mL(최종 0.125 M)를 첨가하여 소금합니다; 27°C에서 10분간 회전시킵니다.
6. 845 x g 에서 5분간 RT 페일렛; 상정액은 적절한 화학/생물학적 폐기물에 버립니다. 27°C에서 미리 예열된 DPBS 40mL와 함께 펠릿을 두 번 세척합니다.
7. 845 x g 에서 5분간 펠릿을 사용하세요. 세포 펠릿을 10mL DPBS에 재현탁하고 세포를 세세요. 가교 단계에서 세포 수는 약 30% 감소할 수 있습니다.
8. 각 50mL 튜브에 1 x 10⁹ 개의 세포를 알리코트합니다; 845 x g 에서 5분간 RT 투여; 상정액을 버리세요. 펠릿은 −80 °C에서 보관하세요.
   참고: 다음 모든 반응 단계는 하나의 RDD 라이브러리에 해당합니다.

2. 세포 용해와 핵 투과화

1. −80 °C 냉동고에서 1 x 10⁹ S2 이중 가교 세포를 가져와. 얼음물에 30분간 녹여요.
2. 세포를 50mL DPBS에 재현탁하고, 845 x g 에서 원심분리기에서 5분간 RT로 가열한 후 상원액을 버립니다.
3. 세포 용해: 세포 펠릿을 0.1% FA 용해 완충제(Triton X-100 제외) 20mL에 재현탁합니다. RT에서 15분간 회전하세요. 현미경으로 확인; 셀 유형별로 시간을 조정하세요. 성공적인 용해는 형질막 투과와 세포질 방출로 나타난 것으로 나타났으며, 표준 광학 현미경 아래에서 핵이 뚜렷한 구조로 쉽게 보이게 됩니다(그림 2A).
4. 핵 투과: 10% SDS(마지막 1%)를 1.8mL 첨가합니다. 37°C에서 15분간 회전시킵니다. 3,200 x g 에서 원심분리기를 20분간 RT 후 상청액을 버립니다. 현미경으로 확인(그림 2B); 셀 유형별로 시간을 조정하세요. 핵은 더 어둡거나 막 베일처럼 보이거나 일부는 분리되어 있습니다. 이 과정을 해해가 완성될 때까지 반복합니다.
5. 핵 세척: 펠릿을 20 mL 0.1% FA 용해 완충제(Triton X-100 제외)에 재현탁하고, RT에서 10분간 회전시키고, 3,200 x g 에서 RT에서 20분간 원심분리하여 상원액을 버리고 핵 펠릿 크기를 표시합니다. 핵 펠릿은 나중에 사용하기 위해 −80 °C에 보관하세요.

3. 염색질 분쇄

1. 핵 펠릿을 0.1% FA 용해 버퍼 15mL(Triton X-100 포함)에 재현탁합니다. 각 14mL 둥근 바닥 시험관에 핵 현탁액 1.5mL를 분리하여 기포를 피합니다.
   1. 초음파 검사 전에 펠릿 크기를 표시하여 비교하고, 초음파 후 펠릿이 여전히 크면 반복 초음파 검사를 수행하세요.
2. 진폭 38%로 소닉메이트를 4.5분 동안 사용하며, 30초 켜기/30초 꺼짐 사이클을 사용하세요. 모든 초음파 처리된 크로마틴을 15mL 튜브에 모아 3,200 x g 에서 원심분리기에서 20분간 RT로 투여한 후, 상청액(~13 mL)을 새로운 15mL 튜브로 옮깁니다.

4. C1 비드를 이용한 프리클리어 크로마틴

1. 스트렙타비딘 C1 구슬 준비: 스트렙타비딘 C1 구슬 400 μL을 1.5 mL 튜브에 알리코트(10^{9 S2} 세포당 100 μL × 넣고, 자석에 30초간 감주한 후 상원액을 제거합니다. 0.1% FA 용해 버퍼 200 μL(Triton X-100 포함)으로 두 번 세척한 후, 0.1% FA 용해 버퍼 100 μL (Triton X-100 포함)에 재현탁합니다.
2. 크로마틴 프리클리어: 준비된 스트렙타비딘 C1 구슬 100 μL을 ~13 mL의 초음파 처리된 크로마틴 상원액이 담긴 튜브에 넣는다(3.2단계에서); RT에서 20분간 회전; 자기 랙에 1분간 올려놓고 상원액(미리 클리어된 크로마틴)을 새로운 50mL 튜브로 옮깁니다; 10 μL을 취해 −20 °C에서 보관하여 QC1을 만드세요(그림 3A).

5. RNA 프로브를 미리 승인된 크로마틴과 하이브리다이즈

1. 신선하게 준비된 하이브리다이제이션 버퍼 2부피(26 mL)를 미리 정화된 크로마틴 1부피(13 mL)에 첨가합니다; RT에서 30분씩 교대로 하세요.
2. 혼합물을 15mL 튜브 세 개로 분할 분리합니다; 각 샘플에 100 μM 비오티닐화 프로브(DNA 올리고뉴클레오타이드, 표 1)를 6 μL 첨가합니다(15 mL 튜브당 2 μL); 밤새 37°C에서 회전시키세요. 튜브 캡을 필름으로 밀봉하세요.

6. C1 구슬에 프로브 - 크로마틴 복합체를 고정

1. 차단 버퍼로 스트렙타비딘 C1 구슬을 차단하기: 신선한 스트렙타비딘 C1 구슬 400 μL을 취하고, 0.1% FA 용해 완충제 800 μL (Triton X-100 제외)로 두 번 세척; 블로킹 버퍼 400 μL를 추가하고 믹서(F8)에서 30분간 RT 상태에서 인큐베이션합니다. 자석에 10분간 올려놓고 상원액을 버립니다; 800 μL 0.1% FA 용해 버퍼(트리톤 X-100 제외)로 세 번 세척합니다. 각 세척 시에는 피펫으로 부드럽게 섞고, 최소 30초 이상 자석에 대고 상원액을 버리세요.
2. C1 비드를 400 μL 하이브리다이제이션 버퍼에 재현탁합니다.
3. 스트렙타비딘 C1 비드의 프로브-크로마틴 복합체를 고정시키기: 블로킹 버퍼 처리된 스트렙타비딘 C1 비즈를 해당 잡성 크로마틴에 추가하고 RT에서 2.5시간 회전시킵니다.
4. 고정 반응을 15 mL 튜브에서 1.5 mL 튜브로 자기 랙을 사용해 옮깁니다. 각 15mL 튜브를 자석 랙에 5분간 올려놓고; 상청액을 제거하세요. 1mL의 워시 버퍼로 비즈를 재현탁한 후 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
5. 구슬을 800 μL 워시 버퍼로 다섯 번 세척한 후 TE 버퍼로 두 번 세척합니다. 세척할 때는 버퍼를 추가하고, 믹서(F1, 12rpm)에서 37°C에서 5분간 배양한 뒤, 자석 랙에 30초간 올려놓고 상원액을 버립니다.
6. 비즈를 RT 시 1,000 μL TE 버퍼(1x PI)에 보관하세요.

7. 변성 아이오도아세틸-PEG2-비오틴(IPB)으로 C1 비드 내 비점 차단

1. 4.8 mg의 IPB를 400 μL IPB 워시 버퍼에 용해; RT에서 15분간 회전하세요.
2. β-ME 용액: 312 μL H₂O에 β-ME 1 μL 첨가; 혼합해서 RT에서 15분간 돌려보세요.
3. 변성 IPB: 400 μL IPB에 β-ME 용액 44 μL을 첨가; 혼합해서 RT에서 15분간 돌려보세요.
4. C1 비드 차단: 프로브-크로마틴 복합체와 결합된 C1 비즈에 변성 IPB 220 μL을 첨가합니다(1,000 μL TE에서); RT에서 15분간 회전하세요.
5. C1 비즈는 TE로 다섯 번 세탁하세요. 버퍼를 추가하고, 믹서(F8)에서 5분간 RT 상태로 인큐베이팅한 후, 자석 선반에 30초간 올려놓고 상원액을 버리세요.

8. 염색질 끝 수리 (비즈에서)

1. C1 비드의 크로마틴에 693 μL의 엔드 리페어 믹스를 첨가하고 잘 섞습니다; 그 다음 7 μL T4 DNA 중합효소를 첨가합니다.
2. 열믹서(800rpm)에서 12°C에서 30분간 배양; 그 후 믹서기(F8)에서 16°C에서 15분간 가열합니다.
3. 구슬을 800 μL 얼음 차갑게 세척한 ChIA-PET 버퍼로 세 번 세척한 후 TE 버퍼로 한 번 세척합니다. 각 세척 시에는 피펫으로 부드럽게 섞고, 최소 30초 이상 자석에 대고 상원액을 버리세요.

9. 크로마틴 A-테일링 (비즈 위)

1. C1 비드의 크로마틴에 693 μL A-테일링 혼합물을 첨가하고 잘 섞은 후, 7 μL Klenow 조각(3'-5' 엑소-)을 추가합니다.
2. 믹서기(F1, 12rpm)에서 37°C에서 50분간 인큐베이팅하세요. 구슬을 800 μL 얼음 차갑게 차가운 ChIA-PET 버퍼로 세 번 세척한 후 용출 버퍼로 한 번 세척합니다.

10. 염색질 근접 연결(구슬에 적용)

1. C1 비드의 크로마틴에 1,390 μL 근접 연결 혼합물을 첨가합니다. RT에서 믹서(F8)에서 5분간 인큐베이팅하세요.
2. 그 다음 10 μL T4 DNA 리게아제를 추가합니다. 믹서(F8)를 RT에서 5분간 회전시킨 후, RT에서 F1(12rpm)으로 50분간 전환한 뒤, 밤새 16°C를 유지하세요.
3. 구슬을 800 μL 얼음 차가운 ChIA-PET 버퍼로 세 번 세척한 후 TE 버퍼로 두 번 세척합니다.

11. C1 구슬에서 근접 결합 염색질 DNA를 방출

1. C1 비드의 크로마틴에 LC ChIP 용출 버퍼 480 μL을 첨가하고 잘 섞은 후, 20 mg/mL 단백질효소 K 20 μL 추가하여 가교 제거를 위해 사용합니다.
2. 65°C에서 열믹서(950rpm)에서 하룻밤 배양하세요.

12. 근접 연결 DNA 정제 (페놀: 클로로포름: IAA 시약 사용)

1. 고밀도 위상 고정관을 13,500 x g 에서 2분간 RT 상태로 돌립니다. 고밀도 위상 고정관에 500 μL의 분리 가교 생성물을 추가합니다.
2. 500 μL 페놀:클로로포름:IAA(5mL 피펫 팁 사용)를 고밀도 위상 고정관에 추가합니다. 손으로 부드럽게 섞으세요.
   주의: 연기구 내에서 작업하세요.
3. 원심분리기를 13,500 x g 에서 RT에서 6분간 돌립니다. 원심분리 중에는 3M 아세테이트 나트륨(pH 5.5)을 바닥에 52 μL 첨가하여 1.5mL 튜브를 준비합니다. 캡에 1μL 글리코겐과 파란색 염료를 넣어 놓으세요. 이 시점에서 튜브를 섞거나 닫지 마세요.
4. 고밀도 위상 고정관에서 준비된 1.5mL 관으로 상청액을 빠르게 옮깁니다.
5. 1.5mL 튜브에 얼음 냉각 이소프로판올 520 μL을 추가합니다. 부드럽게 섞은 후 -80°C에 하룻밤 두세요.
6. 튜브를 -80°C에서 꺼내고 RT(~10분)에서 해동합니다. 13,500 x g 에서 4 °C에서 ~1시간 동안 원심분리하여 DNA를 침전시킵니다. 튜브 바닥에는 파란색 펠릿이 있습니다.
7. DNA 펠릿을 75% 에탄올로 세척하고 상환액을 조심스럽게 제거하세요. 75% 얼음 냉각 에탄올 800 μL 주를 추가하고, 13,500 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 제거합니다. 에탄올 세척을 한 번 반복하세요.
   주의: 원심분리 직후 상원액을 즉시 제거하세요: 먼저 1mL 팁으로, 그 다음 100 μL 팁으로 제거하세요. 따뜻한 튜브는 파란 펠릿을 떨어뜨릴 수 있습니다.
8. 마지막 에탄올 세척 후에는 13,500 x g 온도에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 바닥에 남아 있는 에탄올을 수집한 후 남은 에탄올을 조심스럽게 제거합니다.
9. DNA 펠릿을 진공청소기(보통 1분 30분에서 2분)에서 건조시킵니다. DNA 펠릿을 10 μL 용출 완충제에 재현탁한 후 RT 환경에서 약 2시간 배양합니다. 핵산 정량기를 사용해 DNA를 정량하고 자동 모세관 전기영동 시스템(그림 3B-C)으로 품질을 평가합니다.

13. 근접 연결 DNA Tn5 표지화

1. Tn5 태그먼트 시험: 표 1에 따라 총 반응 부피 50 μL를 준비합니다. 얼음 위의 PCR 튜브에 QC1 DNA 50 ng, ddH₂O, 4x Tagmentation 버퍼 12.5 μL을 순차적으로 첨가합니다. 마지막으로 필요한 양의 Tn5 효소를 추가하세요. 각 첨가 후 10번에서 20번 피펫으로 위아래로 조심스럽게 섞으면서 거품을 피하세요. 필요하면 튜브를 잠시 돌려 내려가세요.
   참고: 조심스럽게 섞고 기포를 피하는 것이 태그먼트에 매우 중요합니다. 또한, Tn5 양은 원하는 조각 분포(주로 200 bp-1 kb)를 달성하기 위해 경험적으로 최적화되어야 하며, 사용자는 Tn5 입력을 조정하여 크기 범위를 조정할 수 있습니다.
2. 태그멘테이션 반응: 55°C에서 뚜껑을 70°C로 설정한 PCR 기기에서 10분간 인큐베이션한 후 4°C에서 유지합니다.
3. Tn5 방출 및 DNA 정제: 태그가 부착된 DNA에 50 μL ChIP 용출 완충제와 1 μL 단백질효소 K를 첨가하여 최종 SDS 농도를 0.5%로 만듭니다. 65°C, 900rpm에서 30분간 혼합 및 부양하세요. DNA 정제 키트로 DNA를 정제하고 자동 모세관 전기영동 시스템을 사용해 DNA를 정량합니다(그림 3D).
   참고: 이 단계에서 DNA 조각은 주로 200 bp에서 1 kb 사이여야 합니다. Tn5 효소와 DNA 비율은 경험적으로 최적화되어야 합니다.
4. Tn5 표지화 스케일업: Tn5 테스트 결과를 바탕으로, 동일한 조건에서 근접 연결 DNA에 대한 반응을 확장합니다. 표지 부착 후 PCR 기기에서 샘플을 꺼내 얼음 위에 올려놓습니다. 잠시 회전 후 RT에서 2분간 배양한 후 10% SDS (w/v; 최종 SDS 농도: 1%)을 5.5 μL 첨가합니다. 기포를 피하며 피펫팅으로 10번에서 20번 위아래로 움직이며 혼합하고, 잠시 아래로 돌리세요. PCR 기기에서 37°C에서 최소 15분간 샘플을 배양합니다. 태그가 부착된 DNA는 -20°C에서 며칠간 저장할 수 있습니다.

14. M280 비즈 차단

1. 20 μL M280 비드를 1x B&W 버퍼 200 μL로 두 번 세척하세요. 세척할 때는 버퍼를 추가하고, 피펫으로 비드를 재현수한 뒤, 잠시 회전시키고, 자석에 30초간 감싼 후 상청액을 제거하세요.
2. 블로킹 버퍼를 이용한 비드 블로킹: M280 비즈를 100 μL 블로킹 버퍼에 재현탁; 믹서(F8)를 RT에서 45분간 회전시키세요.
3. 비드 세척: 잠시 회전시키고 자석에 10분간 감싼 후 블로킹 버퍼를 버립니다. 200 μL 2x B&W 버퍼로 비즈를 두 번 세척하세요.
4. 유전체 DNA를 이용한 구슬 차단: 100 μL 2x B&W 버퍼에 비드를 재현탁하고, 절단된 유전체 DNA 100 μL(~500 ng, 300-500 bp)을 추가한 뒤 잘 섞은 후 믹서(F8)에서 RT 온도로 30분간 회전시킵니다.
5. 유전체 DNA 혼합물을 버리고 200 μL 1x B&W 버퍼로 두 번 세척합니다.

15. M280 구슬에 결합된 DNA 고정

1. 결합된 DNA를 M280 구슬에 결합: 1개의 B&W 버퍼 버리기. 모든 조각화된 결합된 DNA를 M280 비즈에 넣고, 혼합한 후 RT 믹서(F8)에서 45분간 회전시킵니다.
2. 잠시 회전시키고 자석을 붙인 후 상청액을 버립니다. 37 °C에서 500 μL 미리 예열된 워시 버퍼로 5번 세척 구슬을 다섯 번 닦아내고; 한 번은 1x B&W의 500 μL 사용; 한 번은 200 μL 1x 흑백 1개를 사용해 마그넷에 1분간 놓고, 튜브 바닥에서 부드럽게 섞은 후 상청액을 버립니다. 비드에 30 μL의 용출 버퍼를 첨가하세요(혼합하지 마세요).
   1. 세척할 때는 버퍼를 추가하고, 믹서(F8)에서 5분간 배양한 뒤, 자석에 30초를 올린 후 상원액을 버리세요. 결합된 DNA가 결합된 구슬은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

16. M280 구슬에 부착된 DNA 증폭

1. DNA 라이브러리 준비 키트에 따라 PCR 반응을 준비합니다. PCR 튜브를 PCR 기계로 옮기고 프로그램을 설정하세요.
   참고: PCR 증폭 주기는 최종 라이브러리 품질에 매우 중요합니다; 사이클 수를 늘리면 라이브러리 복잡도가 줄어듭니다. 사이클 수를 경험적으로 최적화하며, 일반적으로 15 사이클을 넘지 않도록 하세요.
2. 자기 구슬을 이용해 PCR 산물을 정제합니다(그림 3E). 크기 선택: (0.8-0.61) 자기 비드를 사용해 RDD 라이브러리의 두 배 크기 선택을 수행합니다.
   1. 최종 DNA 라이브러리는 주로 250배지에서 600 bp 사이여야 합니다(그림 3F). 염기서열 분석을 위해 핵산 정량기로 라이브러리 DNA 10-30 ng를 측정하세요.
3. 시퀀싱: 일루미늄 시퀀싱 대상 2개의 150 bp. 시퀀싱 깊이는 RNA 발현, 결합 부위 밀도, 그리고 전체 게놈 패턴에 따라 달라집니다. 여기서 roX2 는 ~23M 리드, 7SK 는 ~8M 리드에 포화되므로 후자는 더 적은 깊이가 필요합니다. 종별로 시작한 후, 추가 깊이에 대해 중복성을 평가합니다: 초 파리의 경우 ~5M, 인간/쥐의 경우 ~20M, QC 기준으로 조정합니다.

결과

이 프로토콜은 RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용을 검출하는 RDD 방법을 개략적으로 설명합니다. 작업 과정은 바이오티닐화 프로브를 이용한 RNA-염색질 복합체의 생화학적 농축으로 시작되며, 이어서 공간적으로 인접한 DNA 조각을 연결하는 근접 연결(proxity ligation)을 진행합니다. 시퀀싱 라이브러리를 구축한 후에는 고처리량 시퀀싱이 수행됩니다.

RDD 데이터의 생물정보학적 분석은 ChIA-PIPE^{플랫폼 13}에 의해 간소화됩니다. 이 분석 파이프라인의 핵심 단계로는 원시 리드에서 시퀀싱 링커 제거, 쌍 말단 리드를 참조 게놈에 매핑, 고유하게 매핑된 리드 쌍 필터링, PCR 중복 제거, 프로브 좌표에 따른 표적 RNA 부위에 상호작용 할당 등이 포함됩니다. 일반적으로 시퀀싱된 리드의 약 50%는 링커와 품질 필터링 후 성공적으로 유지됩니다. 유효한 상호작용 사건들을 집계하여 좌위 특이적 접촉 지도를 생성하여 RNA 유도 염색질 구조의 상세한 프로파일을 제공했습니다. RDD 데이터에 대해서는 세 가지 ChIA-PIPE 조정을 구현했습니다: 기본 ChIA-PET 링커("ACGCGATGTACTCTCTGACT")를 RDD 링크 대신 사용했습니다("ACGCGATGGCTACTCTGACT"); 루프 클러스터링은 기본 500 bp 외에 50 bp 단축된 PET 확장과 함께 수행되어 RNA 상호작용 부위의 위치 정밀도를 높였습니다; RNA 농축 커버리지는 deepTools(bamCoverage v3.5.1)를 사용하여 1 bp 빈 크기를 사용하여 계산했습니다. 이러한 수정은 링커 구성, 더 세밀한 클러스터링을 위한 PET 확장 감소, 그리고 RDD 라이브러리용 고해상도 커버리지 적응 ChIA-PIPE를 제공합니다.

그림 4는 두 가지 비암호화 RNA의 대표적인 RDD 결과를 보여줍니다: roX2¹⁴(그림 4A,C; 녹색)는 초파리에서 X염색체 구조와 유전자 발현을 조절하는 용량 보상 복합체 RNA이며, 7SK¹⁵(그림 4B,D; 보라색)는 고도로 보존된 소형 핵 RNA로, 다세포에서 P-TEFb 활성을 조절하여 전사 신장을 조절합니다. RDD에 의해 검출된 RNA 결합 및 염색질 상호작용은 RNAPII ChIA-PET 데이터(파란 호)와 함께 시각화되어, RNA 관련 루프와 프로모터(P), 증강자(E), 전사 시작 또는 종료 부위(TSS/TES) 같은 주요 조절 요소 간의 구조적 관계를 강조합니다. 집계된 데이터에서 두드러진 상호작용 피크는 roX2와 7SK가 중요한 증강자-프로모터 또는 장거리 크로마틴 접촉을 매개한다는 모델을 뒷받침합니다.

다차원 분석은 RDD 고정 상호작용과 Hi-C 유전체 전체 염색질 구조 지도(하단 패널 빨간 열지도) 및 후생유전체 마크(H3K27ac, H3K27me3), 초기 전사(RNA-seq), RNAPII ChIA-PET 데이터(그림 4C,D)와 통합하여 이루어집니다. 이 영역들에서는 위상학적 연관 도메인(TAD)이 명확하게 시각화되며, RNA 유도 염색질 루프가 종종 TAD 경계에 위치하거나 여러 TAD를 아우르는 경우가 많습니다. 히스톤 변형 및 전사 데이터를 추가로 주석하면 활성 염색질 영역과 비활성 염색질 영역을 구별할 수 있습니다. 주요 RNA 중심 조절 허브는 그림 안에 동그라미 쳐져 있습니다.

서로 다른 ncRNA마다 뚜렷한 패턴이 나타납니다. roX2 는 TES 영역에 결합하고 TSS에 루프를 형성하는 것이 특징이며, TAD 경계에 자주 국소화되어 여러 TAD를 교차할 수 있는 장거리 접촉을 형성합니다. 반면, 7SK 는 주로 인핸서에 결합하며, 일반적으로 TAD 경계를 넘지 않고 인접 프로모터와 단거리 루프를 형성합니다.

종합적으로 이 결과들은 RDD가 RNA 특이적 3D 염색질 해부에 있어 신뢰할 수 있고 고해상도의 방법임을 확인시켜 줍니다. 이 접근법은 다양한 생물학적 환경에서 유전체 구조와 유전자 발현에서 조절 RNA의 공간적 역할을 직접 조사할 수 있게 합니다.

그림 1: RDD 라이브러리 생성 워크플로우의 도식. RDD 라이브러리 생성의 중심 워크플로우 단계가 순서대로 제시되며, 이에 대응하는 도식 일러스트가 함께 제공됩니다. 이 절차는 이중 가교 결합과 크로마틴 표지화로 시작되며, 이어서 비오틴 변형 RNA 프로브와의 하이브리다이제이션과 스트렙타비딘에 의한 고정 처리가 진행됩니다. 이후 단계로는 A-테일링, 비오틴 변형 링크와의 근접 연결, 라이브러리 구축이 포함됩니다. DNA 연결(ligation) 후 정제, Tn5 매개 단편화, 비오틴 농축, 라이브러리 증폭이 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 세포 용해 및 핵 투과에 대한 시각적 품질 관리 기준을 보여주는 초파리 S2 세포의 대표적인 현미경 이미지. (A) 성공적인 세포 용해는 원형질의 투과와 세포질 방출이 특징이며, 핵이 쉽게 보이도록 합니다. (B) 핵 투과가 성공적임을 나타내는 것은 세포 부기, 원형질막의 부분 박리, 그리고 온전하고 명확하게 보이는 핵으로 나타난다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 3: 크로마틴 준비물의 전기영동도 분석. 모세관 전기영동 시스템 스크린샷, 다양한 염색질 샘플을 프로파일링하는 전기영동도. (A) 약 1000에서 3000 bp 사이의 크기로 분편화된 크로마틴(초음파 처리)을 나타내며, 이는 성공적인 분열을 나타냅니다. (B) RNA와 관련된 염색질(RNA-associated + unbound probes)을 나타내며, 화살표가 표시한 것처럼 작은 봉크가 비결합 프로브를 나타냅니다. (C) RNA 연관 크로마틴을 나타내며, 농도 범위는 1000에서 3000 bp 사이로, RNA-단백질 복합체를 반영합니다. (D) Tn5로 태그된 염색질을 나타내며, 태그먼트 효율을 나타내는 범위를 보여줍니다. (E) 증폭 후 시퀀싱 라이브러리의 분열 크기 분포를 표시하며, 약 180-1000 bp에 걸쳐 있습니다. (F) 크기 선택 후 시퀀싱 라이브러리의 분열 크기 분포를 보여주며, 주로 ~250-600 bp 범위에 농축된 조각들입니다. 각 샘플마다 RFU(상대 형광 단위) 값이 표시되어 크로마틴 완전성과 크기를 효과적으로 정량화합니다. 보라색 봉우리가 마커를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: ncRNA 관련 염색질 상호작용에 대한 RDD의 대표적 결과. (A-B) ncRNA roX2(녹색)와 7SK (보라색) 결합의 유전체 위치와 해당 원격 염색질 상호작용 루프를 표시합니다. RNAPII ChIA-PET(파란색) 데이터는 이 ncRNA와 유전자 발현 사이에 명확한 조절 관계를 보여주며, 상호작용 강도를 나타내는 피크가 있습니다. 약어: TSS = 전사 시작 부위; TES = 전사 말단 부위; P = 프로모터; E = 강화제. (C-D) ncRNA roX2와 7SK 관련 염색질 루프 및 TADs(빨강)의 관계, 그리고 활성 및 비활성 염색질 상태 및 유전자 발현 수준 차이를 고차원적으로 보여줍니다. 원은 TAD 간 중요한 상호작용이 있는 지역을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: RDD 반응 시약. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: RDD 버퍼 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 과정의 핵심 단계
염색질 내 RNA 프로브의 양과 이에 대응하는 RNA 수준을 추정하는 것이 매우 중요합니다. 과도한 프로브는 고정 단계에서 스트렙타비딘 부위를 점유하지 못하게 하여 표적 RNA 상호작용의 포획을 방해할 수 있습니다. 또한 스트렙타비딘을 과도하게 첨가하면 물질이 낭비되며, 빈 부위를 효과적으로 차단하기 위해 더 많은 변성 IBP가 필요합니다. 차단이 부족하면 이후 근접 연결의 효율성에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 특히 근접 연결체 링커는 비오틴 변형도 포함하고 있기 때문입니다. 차단이 적절하지 않으면 링커의 일부가 스트렙타비딘 구슬에 직접 결합하여 결과가 복잡해질 수 있습니다. 더불어, 링커와 크로마틴의 비율을 신중하게 추정해야 하며, 너무 많은 링커는 염색질 DNA 양 끝에 태그를 부여하여 효과적인 근접 연결을 방해할 수 있습니다.

기법의 변형
본 연구에서는 roX2 ncRNA를 가진 초파리 S2 세포를 사용하여 RDD 방법을 설명합니다. 시약 부피는 세포 유형과 ncRNA 발현 수준에 따라 조정되어야 하며; ncRNA 발현이 높으면 세포 양을 줄이거나 RNA 프로브 농도를 높이는 방법이 있습니다. 이 프로토콜은 비드에 크로마틴을 고정시키지만, 대안으로는 현장 근접 연결(in situ proxity ligation)을 수행한 후 RNA 프로브로 농축하는 방법이 있습니다.

특이성, 대조군, 품질 관리
우리는 이전에 RDD를 기술하고 검증했으며, 여러 RNA에 대해 병렬 RDD를 수행하여 강한 특이성을 보였습니다; 독자들은 이전 저작 ^4,16을 참고할 수 있습니다. RDD는 프로브 의존적이고 유좌 특이적 농축이 필요하며, 이는 재현 가능하고 가능하면 직교적으로 검증되어야 합니다. 진정한 상호작용은 세 가지 기준을 충족합니다: 프로브 표적 유적좌와 인접 비결합 영역에서의 농축; 탐침 의존성(음성 대조군에서 부재 또는 현저히 감소); 생물학적 복제 간 재현성과 독립적 검증(예: RT-qPCR)을 포함합니다. 안티센스 프로브는 Stellaris로 설계되었고, BLAST/BLAT로 오프타겟을 제거했으며, 3'-비오틴으로 주문되었고, RT와 qPCR(DNA 오염 검사 및 부위 대 비부위 농축 포함)으로 검증되었습니다. 우리는 세 가지 대조군을 권장합니다 — 무탐침, 스크램블/비표적, 그리고 관련 없는 RNA 또는 비결합 영역 프로브로, 표적 및 대조군 샘플 간의 qPCR 또는 시퀀싱 커버리지를 비교하여 특이성을 평가하고, 접힘 풍부화 및 배경을 보고합니다. 저품도 RNA의 경우, 탐침 밀도를 높이고(오프타겟 제약 내에서), 시퀀싱 깊이를 높이며, 직교 검증을 수행합니다.

방법 문제 해결
포획된 RNA-염색질 상호작용이 현저히 낮을 경우, 링크 및 염색질 양을 조정하여 근접 연결의 효율성을 최적화해야 할 수 있습니다. 또한, 자동 모세관 전기영동파를 통해 결합되지 않은 탐침의 높은 피크가 관찰되었습니다. 결과는 너무 많은 프로브가 추가되었음을 보여주며, 이는 사용량을 줄여 해결할 수 있습니다.

방법의 한계
RDD 방법의 주요 장점은 특정 RNA 관련 염색질 상호작용을 포착하는 효율성으로, 각 실험이 한 번에 한 가지 특정 RNA에만 집중할 수 있다는 점입니다. 더불어, 근접 연결은 쌍별 상호작용을 감지하도록 설계되어 다부위 상호작용을 동시에 평가할 수 없습니다.

방법의 중요성
RDD 방법은 RNA 결합 부위를 밝혀내는 것뿐만 아니라 해당 부위 간의 상호작용 관계를 명확히 하여 염색질 구조에 대한 이해를 높입니다.

RDD의 실용적 용도와 미래 가능성
RDD는 내인성 숙주 RNA와 바이러스 또는 기타 미생물의 외인성 RNA를 포함한 다양한 염색질 관련 RNA에 적합하며, 다양한 연구 분야에서 폭넓은 적용 가능성을 보여줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 M EDTA	인비트로젠	AM9260G
1 M 마그네슘 아세테이트	시그마-올드리치	63052-100ML
1 M 트리스-HCl pH 7.0	인비트로젠	AM9851
1 M 트리스-HCl pH 8.0	인비트로젠	AM9856
1.5mL 튜브	에펜도르프	30108051
10 mM dATP	인비트로젠	18252015
10% SDS (무게/볼륨)	인비트로젠	AM9822
10번과 10번; A-테일링 버퍼	NEB	B7002S
10번과 10번; 엔드 리페어 버퍼	NEB	B6002S
10번과 10번; T4 DNA 리게아제 완충제	NEB	B0202S
10번과 10번; TBE 버퍼	인비트로젠	AM9863
14mL 둥근 바닥 시험관	코닝	352057
2× PCR 마스터 믹스	NEB	M0541
20번, SSC 버퍼	인비트로젠	AM9770
200-μ L PCR 튜브	상곤 바이오텍	F611541-0010
250mL 정사각형 PET 저장 병	코닝	431531
2-머캅토에탄올 (β-ME)	시그마-올드리치	M6250-100mL	! 주의 & 베타; 나는, 독성이 있다; 항상 연기통에서 사용하세요.
2-mL 튜브	에펜도르프	22431048
3 M 아세테이트 나트륨 pH 5.5	인비트로젠	AM9740
5 남자 NaCl	인비트로젠	AM9759
5 M 아세테이트 칼륨	시그마-올드리치	95843-100ML-F
500mL 정사각형 PET 저장 병	코닝	431532
분석 균형	사르토리우스	BP211D
자동 셀 카운터	카운터스타	IC1000
자동 모세관 전기영동 시스템	생검	C100100
비오티닐화 프로브	제네위즈		표 1
블로킹 파우더	인비트로젠	T2015
브리지 링커 올리고	제네위즈		표 1
CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽	51033549
디메틸 설폭사이드 (DMSO)	시그마-올드리치	D2650-100mL
일루미늄용 DNA 라이브러리 준비 키트 V2	바지임	TD501
DNA 정제 키트	자이모	D4013
둘벡코 인산염 완충 식염수 (DPBS) (1×)	깁코	14190250
EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일	로슈	11836170001
EGS (에틸렌 글리콜 비스[succiniMidylsuccinate])	써모 사이언티픽	21565
용출 버퍼	치아겐	19086
에틸 알코올, 순수	시그마-올드리치	E7023-500mL
포름알데히드 용액	시그마-올드리치	47608-250mL-F	! 주의: 포름알데히드는 독성이 있습니다; 항상 연기통에서 사용하세요.
포름아마이드	인비트로젠	AM9342
젤 이미징 시스템	타논	3500R
글리신	인비트로젠	50046-1kg
청색 염료가 들어간 글리코겐	인비트로젠	AM9516
고감도 탄환	생검	C105105
고밀도 위상 고정관 (1.5 mL)	치아겐	129046
고감도 dsDNA 형광측정 분석 키트	인비트로젠	Q32851
일루미늄용 인덱스 키트 V2	바지임	TD202
아이오도아세틸-PEG2-비오틴 (IPB)	써모 사이언티픽	21334
이소프로필 알코올	시그마-올드리치	I9030	! 주의: 이소프로필 알코올은 독성이 있습니다; 항상 연기통에서 사용하세요.
킬로 베이스 탄환	생검	C105106
클레노우 단편 (3'→ 5' 엑소-)	NEB	M0212L
자기 비즈	벡맨	A63881
자기 분리 선반 및 nbsp; 15mL 튜브에 대해	인비트로젠	12301D
자기 분리 선반 및 nbsp; 2mL 튜브의 경우	인비트로젠	12321D
PCR 튜브용 자기 분리 랙	NEB	S1515S
미생물 인큐베이터	써모 사이언티픽	IMH180
현미경	니콘	이클립스 TS2
믹서	엘미	RM-2L
N,N-디메틸포름아마이드 (DMF)	시그마-올드리치	227056-100ML	! 주의: DMF는 독성이 있습니다; 항상 연기통에서 사용하세요.
비냉장 마이크로 원심분리기	에펜도르프	5405000204
뉴클레아제 없는 물 (DEPC 처리 미완료, 1000 mL)	인비트로젠	AM9932
뉴클레아제 없는 물 (DEPC 처리되지 않음, 50 mL)	인비트로젠	AM9937
핵산 정량기	인비트로젠	Q33226
궤도 셰이커	크리스탈	SYC-2102
페놀:클로로포름:IAA	솔라비오	P1012-100mL
단백질분해효소 K 용액	인비트로젠	AM2548
냉장 원심분리기	에펜도르프	22628180
냉장 인큐베이터	써모 사이언티픽	IMP180
냉장 마이크로 원심분리기	에펜도르프	5404F1621754
냉장고	하이얼	DW-25L262
RNase 억제제	암비온	AM2696
RNase 프리 15mL 튜브	인비트로젠	AM12500
RNase 프리 50 mL 튜브	인비트로젠	AM12502
소닉케이터	소닉스 & 재료	VCX130
스트렙타비딘 코팅 자기 구슬 C1	인비트로젠	65001
스트렙타비딘 코팅 자기 구슬 M-280	인비트로젠	11205D
T4 DNA 리아제	NEB	M0202S
T4 DNA 중합효소	NEB	M0203S
TE 버퍼 pH 8.0	인비트로젠	AM9849
열 사이클러	바이오-래드	1851148
열믹서	에펜도르프	5382000023
트리톤 X-100	아크로스 오가닉스	327371000-100mL
초저온 냉동고	써모 사이언티픽	995
진공 집축기	토미	MV-100