다발성 골수종 환자의 혈장에서 카필조뮐 정량을 위한 신속 LC-MS/MS 방법 개발 및 검증

Summary

이 연구는 인체 혈장 내 카필조밉을 정량화하기 위한 빠르고 민감한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 방법을 개발하고 검증하는 것을 목표로 했습니다. 완전히 검증된 이 방법은 다발성 골수종 환자에서 치료용 약물 모니터링을 지원하여 개인화된 용량 최적화를 가능하게 합니다.

Abstract

2세대 프로테아좀 억제제인 카필조밉은 치료용 약물 모니터링(TDM)이 필요합니다. 이 연구는 인체 혈장 내 카필조밉을 정량화하기 위한 민감하고 견고한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 방법을 개발하고 검증하는 것을 목표로 했습니다. 혈장 샘플은 아세토니트릴(ACN)을 이용한 단백질 침전을 이용해 처리되었습니다. 크로마토그래피 분리는 C₁₈ 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm)을 40 °C에서 유지하며, ACN과 10 mmol/L 암모늄 아세테이트를 물(80:20, v/v)로 구성한 이동상을 0.35 mL/min의 유량으로 공급했습니다. 이 방법은 2.00-1000.00 ng/mL 농도 범위에서 우수한 선형성을 보였습니다. 또한, 일중 및 일간 정확도와 카필조몹의 회복률은 84.1%에서 93.0% 사이로 관찰되었습니다. 이 검증된 LC-MS/MS 방법은 다발성 골수종 환자의 혈장 내 카필조몹 농도를 정확하고 효율적이며 민감한 방식으로 측정할 수 있게 하여 카필조뮐 기반 치료의 최적화를 지원합니다.

Introduction

다발성 골수종(MM)은 골수 내 혈질 세포의 클론 증식이 특징인 혈액학적 악성 종양입니다. 전 세계적으로 두 번째로 흔한 혈액암^{으로, 전체} 혈액암의 약 10%를 차지합니다^. 수년간 프로테아좀 억제제, 면역조절제, 단클론 항체 도입 등 약물 치료의 발전으로 치료 결과가 개선되었습니다. 그러나 상당수의 MM 환자(20%-30%)는 짧은 무진행 생존(PFS^{), 4.5} 부작용(ADR), 약물 내성, 재발 등과 같은 어려움을 계속 겪^{고 있습니다.}

보^{르테조맙은 최초의 프로테아좀 억제제7}호로, MM 치료의 지형을 완전히 변화시켰습니다. 효과에도 불구하고, 대부분의 환자들은 결국 재발하거나 불응성 질환을 겪으며, 종종 보르테조뮈브 내성과 감소한 치료 반응 및 생존율을 동반합니다 ^8,9, 치료 반응 및 생존율^{감소 10,11}. 이러한 도전 과제는 MM 치료 결과를 개선하기 위한 혁신적인 치료 접근법의 시급함을 강조합니다. FDA에서 승인한 2세대 프로테아좀 억제제인 카필조밉은 보다 안정적인 약동학 프로필을 제공하여 키모트립신 유사 활성을 지속적으로 억제하고 강력한 항골수종 효과를 제공합니다. 일반적으로 보르테조밉과 면역^{조절제 치료를} 포함한 최소 두 차례의 이전 치료 라인을 받은 MM 환자에게 적응증이 ^{적용됩니다.} 연구에 따르면 카필조뮐은 보르테조몹보다 다발성 골수종 세포에서 더 강력한 프로테아좀 억제를 달성하며, 보르테조뮈브 내성을 극복할 수 있는 능력을 가지고 있음이 밝혀졌습니다^12,13.

생물학적 매트릭스에서 약물 농도를 정량화하는 가장 널리 사용되는 방법으로는 고성능 액체 크로마토그래피-자외선 검출(HPLC-UV), 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법(LC-MS/MS)¹⁴이 있습니다. HPLC-UV는 조작 간편성과 낮은 비용을 제공하지만, 상대적으로 낮은 감도와 선택성으로 인해 활용 가능성이 제한됩니다. 따라서 특히 저농도나 복잡한 생물학적 행렬 내에서 표적 분석물의 정확한 정량화는 여전히^{도전적입니다.} ELISA는 높은 민감도를 보입니다. 그러나 이 적용은 긴 개발 과정, 고품질 항체 의존, 그리고 샘플 내 구조적으로 유사한 화합물과의 교차 반응성 등 여러 가지 한계에 직면해 있습니다. 이 요인들이 결합되어 분석^{법 16}의 특이성을 저하시킵니다. 반면, LC-MS/MS는 탁월한 선택성, 우수한 민감도, 빠른 분석 처리량을 제공합니다. 이러한 장점은 치료용 약물 모니터링(TDM) 및 약물동학 연구의 금표준 방법론으로 자리매김합니다¹⁷. 카필조몹은 광범위한 혈장 단백질 결합, 낮은 생체 내 안정성, 좁은 치료 지수를 가지고 있습니다. LC-MS/MS 기술은 표적 화합물의 신속한 정량 분석을 수행하고, 매트릭스 효과를 효과적으로 줄이며, 정밀한 임상 약물 투여를 위한 과학적 기반을 제공합니다.

카필조뮐의 약물 노출 수준은 치료 효과와 ADR과 밀접한 관련이 있습니다^18,19. 카필조몹은 용량 의존적 특성이²⁰이며, 체내 용량이 증가함에 따라 노출 수준이 긍정적으로 증가하여 치료 효과에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 한 연구에 따르면 MM 치료에서 카필조몹의 완전 반응률(CR)은 28%, 매우 좋은 부분 반응률(VGPR)은 73%, 전체 반응률(ORR)은 93%였다²¹. 또한, 대조군과 비교했을 때 카필조뮐 치료 환자의 심장독성 발생률이 유의하게 증가한 반면, 말초 신경병증에는 유의한 변화가 없었습니다. 또 다른 연구에서는 MM 치료에서 카필조몹의 효능과 안전성을 언급하며, 카필조몹이 치료 효과를 향상시키면서 심장독성 위험을 높일 수 있음을 확인했다²². 따라서 카필조뮈브의 효능과 ADR은 노출 수준과 관련이 있습니다. 현재까지 엄격한 생물분석 검증 기준(예: FDA 지침)을 충족하는 인혈장 내 카필조뮐 정량에 대한 검증된 LC-MS/MS 방법은 거의 보고되지 않았습니다. 기존 연구들은 주로 동물 모델이나 기타 생물학적 행렬에 초점을 ^{맞추고 있으며,} 이는 MM 환자에서 TDM에 대한 임상적으로 적용 가능한 분석의 공백을 부각시킨다.

따라서 MM 환자의 카필조뮐 농도를 빠르고 정밀하며 민감한 검사법으로 확립하여 치료적 효용성과 안전성 프로필을 최적화할 필요가 시급합니다. 이 연구에서 우리는 인간 혈장 내 카필조밉을 3분 이내에 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있는 LC-MS/MS 방법을 개발하고 검증했으며, 뛰어난 민감도와 재현성을 입증하였습니다. MM 환자의 카필조몹 TDM을 위해 개발된 이 방법은 용량 최적화와 노출-반응 평가를 지원합니다. 사용자는 약물이 혈장에서 불안정성을 가지고 있음을 인지해야 합니다; 정확한 정량화를 위해서는 채혈 후 4시간 이내에 샘플 처리가 필요합니다.

Protocol

이 연구 프로토콜은 해군의과대학 제2병원(상하이창정병원) 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 연구에 등록된 모든 환자가 사전 동의서에 서명했습니다.

1. LC-MS/MS 계측

1. 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC) 시스템을 전기분무 이온화(ESI) 소스가 장착된 삼중 쿼드러폴 질량분석기와 결합하여 방법 개발과 시료 분석을 수행합니다.
2. UHPLC 시스템을 온라인 디가스 장치, 바이너리 펌프, 오토샘플러, 컬럼 오븐으로 구성하세요.
3. 기기 제조사의 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 처리를 수행합니다.

2. 액체 크로마토그래피 조건

1. ZORBAX-SB C₁₈ 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm)을 사용하여 크로마토그래피 분리를 달성하세요.
2. 컬럼 온도를 40 °C로 유지하세요.
3. 20% 10 mmol/L 암모늄 아세테이트와 80% ACN으로 구성된 이동상으로 등스크라틱 용출을 수행합니다.
4. 유량을 0.35 mL/min으로 설정하세요.
5. 이러한 조건에서 분석물과 내부 표준(IS) 모두에 대해 대칭적인 피크 형태와 적절한 보존 시간을 보장하세요.
   참고: Carfilzomib-d8은 추출 회수, 크로마토그래피 거동, 이온화 효율이 유사한 구조적 유사성을 이유로 IS로 선정되었습니다.
6. 총 재생 시간을 3.0분으로 설정하세요.

3. 질량분석법 조건

1. 질량분석기를 음 ESI 모드로 작동시켜.
2. 모세관 전압을 -6000V로 설정하세요.
3. 질소를 네뷸라이저와 건조 가스 모두로 사용하세요.
4. 충돌 가스로 0.2 MPa 압력의 고순도 질소를 사용하세요.
5. 네뷸라이저 압력을 20 psi로 유지하세요.
6. 건조 가스를 400 °C로 가열하고 분당 10L의 유량으로 공급합니다.
7. 시스 가스 온도를 350 °C, 유량 12 L/min로 설정하세요.
8. 다중 반응 모니터링(MRM) 모드에서 데이터를 획득하세요.
9. 카르필조뮐(그림 1A)과 IS(그림 1B)의 생성물 이온 스펙트럼을 획득하여 이들의 단편화 패턴을 설명하세요.
10. MS2 스캔 모드를 사용해 부모 이온을 식별하세요.
11. MS2 SIM 모드를 사용해 프래그멘터의 전압을 최적화하세요.
12. Product Ion 모드를 사용하여 최적의 충돌 에너지(CE)를 결정하세요.
13. 카필조뮈브와 IS에 대한 최적화된 질량분석법 매개변수를 자세히 설명합니다(표 1).

4. 교정 및 품질 관리 시료

1. 카필조밉 2.0mg을 2mL 용량 플라스크에 정확히 무게를 재고 2mL 메탄올(MeOH)에 녹여 정확히 1.0 mg/mL 용액을 준비합니다.
   주의: MEOH는 가연성이며 독성이 있습니다. 수술할 때는 증기 흡입이나 피부 접촉을 방지하기 위해 후드에서 시행해야 합니다. 장갑과 눈/얼굴 보호구를 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
2. 기존 용액은 -80 °C에서 보관하세요.
3. 10% MeOH와 함께 스톡 용액을 연속 희석하여 100.0 μg/mL, 10.0 μg/mL, 1.0 μg/mL의 농도를 달성하여 작동 용액을 생성합니다.
4. 작동 용액을 빈 플라즈마에 스파이크하여 보정 표준을 설정하세요.
5. 스파이크된 혈장을 빈 플라즈마와 1:9(v/v) 비율로 희석하여 최종 농도는 2.0, 5.0, 50.0, 200.0, 500.0, 750.0, 1000.0 ng/mL를 얻습니다.
6. 동일한 방법으로 5.0 ng/mL(저농도), 200.0 ng/mL(배지), 750.0 ng/mL(고농도)에서 독립적으로 품질 관리(QC) 샘플을 준비합니다.

5. 샘플 준비

1. 혈장 샘플(100 μL)은 4% 인산 용액 20 μL을 첨가하여 전처리합니다.
   주의: 인산은 부식성이 있습니다. 피부와 눈 접촉을 방지하기 위해 장갑, 안전 고글, 실험복을 착용하세요. 접촉 시 즉시 많은 양의 물로 헹구세요.
2. 표준 실험실용 소용돌이 믹서를 사용하여 최대 속도로 2분간 샘플을 소용돌이 혼합하는 것.
3. 200 μL ACN을 200 μL 첨가하여 200.0 ng/mL 농도의 IS 용액을 포함하도록 하여 혼합물²⁵에 추가합니다.
   주의: ACN은 가연성, 휘발성 및 독성이 있습니다. 모든 작업은 연기 후드에서 수행되어야 하며, 열원과 불꽃으로부터 분리되어야 합니다. 장갑과 눈/얼굴 보호구를 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
4. 다시 혼합물을 보텍스로 만들었다.
5. 혼합물을 12,500 ×g 온도에서 4°C²⁵에서 10분간 원심분리합니다.
6. 상청액 100 μL을 채취하세요.
7. 100 μL 상청액을 100 μL 물과 혼합합니다.
8. 생성된 용액을 유리 인서트가 장착된 HPLC 바이알로 옮깁니다.
9. 최종 용액 10 μL을 LC-MS/MS 시스템에 주입하여 분석합니다.

6. 특이성 평가

1. 카르필조밉과 IS의 반응을 6개의 서로 다른 배치인 빈혈장, IS가 첨가된 혈장, 정량한계(LLOQ) 샘플, 진짜 혈장 샘플에서 비교하여 특이성을 평가합니다.
2. 분석물의 LLOQ 응답이 15% 미만이고 IS 응답의 5% 미만일 경우 간섭을 허용 가능하다고 간주합니다.

7. 선형성 평가

1. 선형성 기준을 세 세트의 다른 날(최소 이틀)에 분석하여 선형성을 평가합니다.
2. 가중 선형 최소 제곱 회귀 모델을 사용하여 최소 6가지 보정 표준을 기반으로 보정 곡선을 생성합니다.
3. 가장 낮은 농도 표준액을 LLOQ로 정의합니다.
4. 각 표준의 역계산 농도는 명목 값의 ± 15% 이내여야 하며, LLOQ의 허용 오차는 ± 20%로 해야 합니다.

8. 정밀도 및 정확성 결정

1. 세 가지 농도 수준에서 QC 샘플 5회 복제와 최소 2일간 다른 날의 LLOQ 샘플을 분석하여 일중 및 일간 정밀도와 정확성을 결정합니다.
2. 정밀도를 상대 표준편차(RSD%)로 표현하며, QC 샘플은 ≤ 15%, LLOQ는 ≤ 20%여야 합니다.
3. 정확도를 상대 오차(RE%)로 표현하며, QC 샘플은 15% 이내± 20% 이내, LLOQ는 20% ± 있어야 합니다.

9. 회복 및 매트릭스 효과 결정

1. 추출 전 혈장에 스파이크된 카필조밉의 피크 면적과 같은 농도로 추출된 매트릭스에 스파이크된 카필조밉의 피크 면적을 비교하여 회수를 결정합니다.
2. 추출된 매트릭스에 스파이크된 카필조밉의 피크 면적과 같은 농도에서 깨끗한 용액에서 카필조밉의 피크 면적을 비교하여 매트릭스 효과를 평가합니다.
3. 매트릭스 효과 계수의 RSD%가 15% 미만일 경우 공백 플라즈마 매트릭스가 분석물 신호에 일관된 영향을 미치는지 표시하세요.

10. 이월 평가

1. 최고 보정 표준 직후 빈 샘플을 주입하여 이전 주입에서 남은 잔류 분석물 신호를 검출하여 캐리오버를 평가합니다.
2. 빈 샘플에서 카필조뮈브의 반응이 LLOQ의 20% 미만이고 IS 반응의 5% 미만일 경우 이승 허용 가능하다고 간주합니다.

11. 희석 효과 평가

1. 정량 상한선(ULOQ)을 초과하는 스파이크된 플라즈마 샘플을 블랭크 플라즈마로 희석하여 농도를 보정 범위 내에 맞추어 희석 효과를 평가합니다.
2. 측정된 농도와 명목 농도를 비교해 보세요.

12. 안정성 평가

1. 서로 다른 저장 조건에서 세 가지 농도 수준의 QC 샘플을 분석하여 안정성을 평가합니다.
2. QC 샘플은 실온에 보관하고 6시간 후에 분석하세요.
3. 처리된 샘플을 오토샘플러에 저장하고 0, 2, 4, 6시간으로 분석합니다.
4. 품질 관리 샘플을 −20 °C와 실온에서 번갈아 저장하여 세 번의 동결-해동 사이클을 거친 후 분석합니다.
5. QC 샘플을 −80°C에서 2개월간 보관한 후 분석합니다.
6. 측정된 농도를 명목 값과 비교하여 편차가 ±15% (RE%) 이내인지 확인한다.

13. 환자 등록 및 샘플 수집

1. 모든 환자로부터 서면 동의서를 받으세요.
2. MM 환자를 등록시키고 카필조뮈브로 치료하세요.
3. 약물 투여 직후 혈액 샘플을 채취하세요(30분 동안 정맥 주입).
4. EDTA-3K 튜브에서 채취한 혈액 샘플을 4500 ×g 4 °C에서 10분간 원심분리하여 혈장 샘플을 얻습니다.

Results

LC-MS/MS 최적화

카필조뮈브 검출을 최적화하기 위해, 분석물의 반응 값을 양성 및 음의 이온화 모드 모두에서 비교하였습니다. 음의 이온화 모드는 양의 이온화 모드보다 카르필조밉에 대한 반응이 더 높았으며, 따라서 후속 분석에 사용되었습니다. 우리는 C₈,_{C 18}, T3-C₁₈ 컬럼의 성능을 비교하여 최적의 컬럼을 선택했습니다. C₁₈ 컬럼은 카필조몹에서 가장 우수한 피크 형태와 반응을 제공했습니다. 용출 구배 최적화를 통해 카필조몹의 유지 시간이 6.0분에서 3.0분으로 단축되었습니다. 초기 실험은 MeOH를 유기상으로, 수산화암모늄 수용액을 수용상으로 사용하여 비대칭 피크 형태를 만들었으나 상당한 꼬리 현상을 보였습니다. 이후 유기상으로 ACN을, 수용상으로 10 mmol/L 암모늄 아세테이트를 사용하여 ...

Discussion

기존의 HPLC-UV 및 ELISA 방법과 달리, LC-MS/MS는 뛰어난 선택성, 감도, 속도를 제공하여 이전 기법들의 한계를 효과적으로 해결합니다. 이러한 장점은 복잡한 생체행렬에서 약물 분석, 특히 TDM 및 약동학 연구에서 약물 분석의 금본위로 자리매김하는 데 기여합니다¹⁷. 우리는 인간 혈장 내 카필조밉을 정량하는 LC-MS/MS 방법을 개발하고 검증했습니다. 이 방법의 주요 실용적 장점은 샘플 준비가 간단하다는 점입니다. 이 과정은 ACN의 두 배 부피를 이용한 단일 단백질 침전 단계와 그 후 희석 단계만 포함합니다. 이 간소화된 워크플로우는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 추출 절차를 없애줍니다.

방법 개발에서 C₁₈ 컬럼은 알킬 사슬이 길고 소수성이 높아 카필조밉의 보존력이 더 강한 반면, C₈ 컬럼은 보존이 약해 분리 및 감...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아세토니트릴 (ACN)	머크 컴퍼니 (독일 다름슈타트)	34888	LC-MS 등급
아세트산 암모늄	머크 컴퍼니 (독일 다름슈타트)	9689	분석 순도: ≥ 99.0%
분석 균형	사르토리우스 (독일))		정밀도: 0.01 mg
해석 칼럼	애질런트 테크놀로지스 (미국)		애질런트 조르백스 SB-C18, 2.1 & 배 100mm, 3.5 및 마이크로; m
카필조몹	상하이 위안예 바이오테크놀로지 (상하이, 중국)	868540-17-4	표준 샘플을 분석하세요, 순도> 99%
카필조몹-d8	상하이 위안예 바이오테크놀로지 (상하이, 중국)		표준 샘플을 분석하고, 순도는 98%>
데이터 수집 소프트웨어	애질런트 테크놀로지스 (미국)		애질런트 매스헌터 데이터 처리 소프트웨어 (버전 6.0)
데이터 분석 소프트웨어	애질런트 테크놀로지스 (미국)		애질런트 매스헌터 정량 분석 소프트웨어 (버전 10.1)
증류수	선전 왓슨스 증류수 주식회사(선전, 중국)	LC-MS 등급
HPLC 바이알 및 인서트	상하이 타이탄 테크놀로지 유한회사(상하이, 중국))		-
액체 크로마토그래피 시스템	애질런트 테크놀로지스 (미국)		애질런트 1200 시리즈에는 바이너리 펌프, 온라인 디가스 펌프, 자동 샘플러, 컬럼 온도 박스가 포함되어 있습니다.
메탄올 (MeOH)	머크 컴퍼니 (독일 다름슈타트)	1.06035	LC-MS 등급
마이크로피펫	에펜도르프 (독일)		여러 측정 범위(예: 10 및 마이크로; L, 100 및 마이크로; L, 200 및 마이크로; L, 1000 및 마이크로; L)
사무실 및 통계 소프트웨어	-		마이크로소프트 오피스 365; 그래프패드 프리즘 9.5
인산	머크 컴퍼니 (독일 다름슈타트)	49685	분석 순도, 85 중위%
냉장 원심분리기	에펜도르프 (독일)		4°로 원심분리한 샘플의 경우; C
삼중 쿼드러폴 질량분석기	애질런트 테크놀로지스 (미국)	G6475AA	Agilent 1200 시리즈, 전기분무 이온화원(ESI) 장착
보텍스 믹서	Labnet  (미국)	S0200	조절 속도