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방법 논문

인간 대변 샘플을 위한 DNA 바이러스 크기 분율 메타게놈학

389 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70187

⸱

2026년 3월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

이 논문에서

요약

우리는 인간 대변 샘플로부터 고품질 바이러스 크기 분획 메타게놈(바이러스)을 생성하는 유연한 프로토콜을 제시합니다. 원래 토양 바이러스 분석을 위해 개발된 이 프로토콜은 대변 샘플에 성공적으로 적용되어 인간 장 바이러스권의 견고한 특성 분석이 가능해졌습니다.

초록

건강한 인간 바이러스 구속(마이크로바이옴의 바이러스 구성 요소)을 이해하려면 다양한 바이러스 유형에 걸친 바이러스 군집 구성을 정확히 측정해야 합니다. 토양 바이러스 군집 생태학 방법에 대한 이전 경험을 바탕으로, 여기서는 인간 대변 샘플에서 세포외 DNA 바이러스로부터 DNA를 풍부하게 추출하는 일련의 실험실 접근법을 시연합니다. 작동하는 기본 프로토콜과 각 단계에서의 편차 옵션이 제시됩니다. 일반적인 접근법은 액체 완충제(기본: 단백질 강화 인산염 완축식염수, PPBS)를 추가하여 대변 기질에서 자유 바이러스 입자를 제거하고, 원심분리로 바이러스 입자를 포함한 액체 분획을 분리하며, 여과(기본값: 0.2 μm 기공 크기)를 통해 대부분의 세포를 제거하고, 바이러스 입자 농축(기본값: 초원심분리), 바이러스 용해 전에 뉴클레아제로 자유 핵산을 제거하는 것으로 구성됩니다. 그리고 DNA 추출을 통해 시퀀싱을 합니다. 다양한 버퍼, 필터 크기, 농축 방법 등 대체 기술들도 언급되어 있습니다. 전반적으로 시퀀싱을 위한 고품질 바이러스 DNA 생성을 위한 다양한 옵션이 제공됩니다. 특정 장비와 자원에 맞춰 접근법을 맞춤화하기보다는, 프로토콜의 유연성 덕분에 표준 분자생물학 장비가 다양한 실험실 전반에 걸쳐 폭넓게 적용 가능해야 합니다.

서론

바이러스학, 즉 혼합 군집의 바이러스 크기 비율을 표적으로 하지 않은 메타게놈 시퀀싱은 비배양 바이러스의 다양성, 진화, 생태에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 20년 전 장내 바이러스 군집 분류 초기 노력 이후, 특히 해수1과 같은 환경 샘플을 위해 개발된 방법을 사용했으며, 바이러스학 접근법은 인간 미생물군내 바이러스 생태계 2 내 발견을 계속해서 가능하게 해왔습니다. 그러나 단일한 보편적 바이러스 프로토콜은 없으며, 기법의 변형은 시퀀싱 결과에 영향을 줄 수 있으며, 궁극적으로 바이러스 군집 역학 해석에 영향을 미치고 연구 간 비교를 방해합니다. 최적화된 프로토콜과 방법론적 선택이 바이러스 프로필을 형성하는 방식을 철저히 이해하는 것이 인간 바이러스권을 견고하게 특성화하는 데 필요합니다.

보편적인 바이러스 프로토콜은 없지만, 바이러스 방법의 일반적인 기초는 크기나 밀도에 따라 세포외 바이러스 유사 입자(바이러스 입자)를 물리적으로 분리하고 농축하며, 바이러스 분해 전에 세포 잔해나 손상된 바이러스 캡시드에서 일부 유래한 자유 핵산을 제거하고, DNA 및/또는 RNA를 추출하여 시퀀싱하는 것입니다. 일부 바이러스 기법은 연구자들의 의도적 선택이든 의도치 않은 방법론적 한계로 특정 바이러스 유형을 선택하거나 반대하는 방식을 선택합니다. 주사기 또는 진공 여과는 미생물 세포 및 기타 이물질을 제거하는 데 자주 사용되며, 필터 크기는 회수 가능한 바이러스의 품질과 조성에 본질적으로 영향을 미칩니다. 예를 들어, 여과는 바이러스 순도5를 높일 수 있지만, 더 큰 바이러스 입자 6,7은 배제할 수 있습니다. 초원심분리, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전, 밀도 구배 초원심분리, 초음파 여과 같은 비리온 농축 방법도 순도, 처리량, 장비 비용 간의 트레이드오프가 있습니다 3,8. 여러 버퍼 화학물질이 바이러스 혼합에 효과적인 것으로 알려져 있습니다. 바이러스특성화에 큰 영향을 미치지는 않을 수 있으나, 저장 및 재현탁 완충제는 바이러스 회복과 생물정보학 분석에서 생성된 바이러스 프로필에 영향을 미칠 수 있습니다10,11. 마지막으로, 자연 샘플에서 바이러스 핵산 농도가 낮을 수 있기 때문에, 많은 연구에서 라이브러리 구축 전에 바이러스 DNA를 증폭하는 방식을 선택합니다(예: 다중 치환 증폭(MDA) 또는 서열 독립적 단일 프라이머 증폭(SISPA)). 그러나 이러한 기법들 중 일부는 상당한 편향을 초래합니다12,13. 전반적으로 많은 바이로믹스 방법이 성공적으로 바이로미를 생성할 수 있지만, 편향을 인정하고 어느 정도 표준화된 최적화된 프로토콜이 정확하고 재현 가능한 바이러스 연구를 가능하게 할 것입니다.

이 글은 인간 대변 샘플로부터 바이러스를 생성하는 유연한 워크플로우를 제시합니다. 검증된 토양 바이러스학 기법14, 15, 16을 기반으로 한 이 프로토콜은 연구자들이 자신의 장비와 연구 요구에 맞게 조정할 수 있도록 여러 단계를 포함하여 변형을 촉진합니다. 아래에 설명된 표준 토양 바이러스 기법은 토양과 냉동 대변 샘플 모두에 성공적으로 적용되어, 라이브러리 구축 전에 바이러스 DNA 증폭 단계 없이도 고품질 바이러스를 생성합니다. 프로토콜 수정 제안은 다른 연구에서 다양한 정도로 검증되었으나, 인간 대변 바이러스 서열에 미치는 구체적이고 후속 영향은 여기서 다루지 않았습니다.

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프로토콜

대변 샘플 채취를 위해 모집된 모든 대상자는 사전 동의를 제공하였습니다. 샘플 채취 프로토콜은 캘리포니아 대학교 데이비스 기관심사위원회의 승인을 받았으며, 연구들은 헬싱키 선언에 부합합니다. 이 프로토콜은 Emerson 등(2022)17에서 채택되었습니다.

1. 재료 준비

  1. 단백질 강화 인산염 완충 식염수(PPBS, 10x PBS, 1% K-시트레이트, 150 mM MgSO4, 2% 소 혈청 알부민(BSA))을 준비합니다18.
    참고: 바이러스 프로토콜에서 일반적으로 사용되는 다른 완충제로는 식염수 마그네슘(SM)19 와 수정된 칼륨-시트레이트 프라임(AKC') 버퍼11이 있습니다.
    1. 10mL 10x PBS, 10g K-시트레이트, 18.05g 무수 MgSO4 를 1L 오토클레이버 가능한 유리병에 넣고 초순수한 실험실 물로 1L까지 채웁니다. pH를 6.5로 조절하세요(일반적으로 6 M HCl의 약 50 μL 또는 2 M HCl의 약 100 μL 필요). 1.1.2단계에서 사용할 수 있도록 병 안에 교반봉을 남겨두세요.
    2. 버퍼와 빈 1L 오토클레이브용 유리병 하나를 넣어 병을 오토클레이브하세요. 오토클레이빙 후 버퍼가 실온으로 식으면 자기 교반판에 올려 병에 20g BSA를 천천히 직접 넣습니다. 한 번에 약 5g씩 추가합니다(거품을 피하려면 용액을 과도하게 자극하지 않도록 천천히 저어주고 점차 증가시킵니다).
    3. 완충 전체 부피를 무균 0.22 μm 진공 필터를 통해 1.1.2단계의 빈 오토클레이브 1L 병에 필터링합니다. 버퍼는 사용 전까지 4 °C에서 보관하세요.
      참고: PPBS 버퍼는 약 3개월 동안 4°C에서 보관할 수 있지만, 영하 이상으로 보관할 경우 장기적으로 안정적이지 않습니다.
  2. 초심분리기 튜브를 준비해.
    참고: 이 프로토콜은 초원심분리를 사용하여 바이러스를 농축합니다. 기타 일반적인 접근법으로는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전, 밀도 구배 초원심분리(예: 세슘 클로라이드 구배), 그리고 초여과가 있습니다.
    1. 초원심분리기 튜브를 세척할 때, 먼저 초순수한 실험실 물로 튜브를 문질러 세척하세요. 그 다음 튜브를 초순도의 실험실 물로 헹구세요.
    2. 튜브에 1M NaOH를 채우고 최소 1시간 이상 담가두세요(하룻밤 불림도 가능합니다). 플라스틱/고무 초심분리기 캡과 오 링을 1M NaOH에 담가 청소하세요.
      참고: 금속 나사 상단 캡을 NaOH에 담그지 마세요.
    3. 불린 후에는 초순도의 실험실 물로 세 번 헹궈낸 뒤, 뉴클레아제가 없는 분자생물학 등급의 물로 한 번 세척합니다. 튜브를 뒤집어 부드럽게 두드리거나 하룻밤 완전히 말리도록 하여 말리세요. 각 초원심분리관에 샘플 식별자를 붙이세요.
  3. 초원심분리기 로터를 냉장고나 냉장실에 하룻밤 두어 4°C에서 미리 냉각하세요.

2. 바이러스 정화 및 농축

  1. 대변을 무균, DNase, RNase, DNA 없는 50mL 원뿔관 안에 무게를 재세요.
    참고: 사용되는 대변의 양은 사용 가능한 샘플 재료의 양에 따라 달라질 수 있습니다. 여기서는 2g의 변을 사용했습니다. 사용하지 않은 샘플 재료를 냉동 보관해야 한다면, 향후 동결-해동 사이클을 최소화하기 위해 샘플 전체를 얼리쿼트하는 것을 고려하세요.
  2. 대변이 들어 있는 원뿔 튜브(원뿔형 #1)에 8mL의 PPBS 완충제를 직접 첨가합니다. 소용돌이로 완전히 재현지됩니다.
  3. 튜브를 300RPM에서 4°C로 10분간 흔들어 주세요.
    참고: 필요 시 흔드는 것은 상온에서 가능하지만 권장 온도는 4°C입니다.
  4. 원심분리기 샘플을 원뿔형 #1에서 4,000 x g , 4 °C에서 10분간 채취.
    참고: 가능하다면 스윙 버킷 로터를 사용해 수직 밀도 분리를 원활하게 하여 다음 단계를 쉽게 진행하세요.
  5. 상청액을 조심스럽게 새로운 멸균 50 mL 원뿔형 원뿔(원뿔형 #2)에 옮기고 4 °C에서 보관합니다(이 상청액에는 비리온이 포함되어 있습니다). 펠릿이 들어 있는 원뿔형 튜브(원뿔형 #1)는 2.6단계에서 다시 사용되므로 버리지 마세요.
  6. 2.2-2.5 단계를 두 번 더 반복하며(원뿔형 #1의 샘플이 버퍼와 함께 총 3회 재현탁, 3회 흔들기, 3회 원심분리를 거치도록 하면) 그리고 상원액을 원뿔형 #2로 계속 모으세요.
    참고: 세 라운드 동안 총 상상정액 ~24mL가 쌓여야 합니다.
  7. 50mL 원뿔형 튜브에 축적된 상원액(원뿔형 #2)을 4 °C에서 10,000 x g에서 8분간 원심분리합니다.
  8. 두 번째 원심분리 과정을 수행합니다. 먼저, 원뿔형 #2의 상청액을 새로운 50mL 원뿔형 튜브(원뿔형 #3)에 옮깁니다. 원심분리기 원뿔형 #3을 10,000 x g, 4 °C에서 8분간 돌립니다.
  9. 주사기 여과를 사용해 원뿔형 #3에서 상청액을 순차적으로 걸러내며, 튜브 하단 또는 근처의 펠릿은 피합니다. 멸균 5.0 μm 폴리에테르설폰(PES) 주사기 필터를 사용한 후, 멸균 0.20 μm PES 주사기 필터를 사용해 초원심분리기 튜브에 직접 넣습니다.
    참고: 5.0 μm 필터로 사전 필터링하는 목적은 0.20 μm 필터의 막힘을 줄이는 데 있습니다. 주사기 필터가 막히면 폐기하고 교체해야 할 수도 있습니다. 여과는 5 μm 필터를 0.20 μm 필터 위에 쌓아 단일 주사기에 부착한 후 초원심분리기 튜브에 직접 넣어 한 단계로 수행할 수 있습니다. PES 막이 선호되는데, 이는 다른 막 재료가 바이러스 세포를 더 오래 유지하거나 더 빨리 막힐 수 있기 때문입니다(예: 폴리비닐리덴 플루오라이드, PVDF). 0.45 μm도 또 다른 일반적인 필터 크기입니다.
  10. 모든 초원심분리관의 질량과 샘플 내용물을 확인하고, 질량에 따라 초원심분리기 내 튜브를 짝지어 넣으세요. 필요하다면 각 쌍의 가벼운 튜브에 PPBS를 추가하여 무게를 평형화합니다(쌍 튜브의 경우 0.05g 오차 범위 내).
  11. 112,000 x g 초원심분리기, 4 °C 진공 상태에서 2시간 25분 동안 가열합니다.
    참고: 사용되는 로터에 따라 회전 시간은 다르며(퇴적계수 = 58에 따라) 달라집니다. 여기서 사용되는 로터에 대해서는 재료표 를 참고하세요. 초원심분리기에서 튜브를 분리하기 전에, 바이러스 펠릿의 위치를 파악하기 위해 로터 내 각 튜브의 방향을 확인하세요. 때때로 초원심분리 후에는 바이러스 펠릿이 보이지 않을 때가 있으므로, 다음 단계에서 상청액을 제거할 때 각별한 주의가 필요합니다.

3. 바이러스 펠릿 재현탁 및 DNase 처리

  1. 상청액은 디캔팅이나 피펫으로 제거하며, 펠릿이 약할 수 있으니 신경 써야 합니다(펠릿에는 농축된 비리온이 포함되어 있습니다).
    참고: 2.11단계에서 언급했듯이, 펠릿이 보이거나 보이지 않을 수도 있지만, '구멍 구멍 크기'의 갈색 또는 노란색 펠릿이 자주 보입니다.
  2. 샘플을 DNase로 처리하세요.
    참고: DNase 처리를 하지 않기로 결정할 경우, 4단계로 진행하여 "DNase 처리가 이루어지지 않은 경우"를 따라가세요. DNase 처리 수행에 관한 논의를 참조하십시오.
    1. 펠릿을 100 μL 무핵효소 분자생물학 등급 물에 재현탁하여 라벨이 붙은 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 넣습니다.
    2. 각 처리할 샘플마다 10 μL DNase 반응 버퍼와 10 μL DNase를 추가하여 DNase 처리 마스터 믹스를 만듭니다. 피펫으로 완전히 섞으세요.
      참고: 3.2.3단계에서 피펫팅 중 발생할 수 있는 부피 손실을 고려할 수 있도록 추가 반응을 위해 충분한 DNase 처리 마스터 믹스를 준비하세요.
    3. 재현탁된 바이러스에 DNase 처리 마스터 믹스 20 μL을 첨가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞으세요. 37°C에서 30분간 배큐하세요.
    4. 뉴클레아제를 비활성화하기 위해 10 μL DNase 차단액을 첨가합니다. 잠시 소용돌이.

4. 바이러스 핵산 추출

  1. 재료표에 나열된 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA 추출을 수행하세요.
    참고: 제조사 설명서를 두 가지 수정하세요. 1) 키트 절차 1단계 후, 버퍼 CD1에 있는 비드튜브를 65°C에서 10분간 가열한 후 제조사 지침에 따라 추출을 진행합니다. 2) DNA 용출 단계(키트 절차 16단계) 중에는 C6를 추가한 후 실온에서 5분간 배양합니다.
    1. DNase 처리가 이루어진 경우: 누클레아제가 비활성화된 후(3.2.4단계에서), 전체 부피를 DNA 추출 입력으로 사용하세요(즉, DNA 추출 키트 1단계에서 이 부피를 800 μL CD1이 담긴 비드 튜브에 추가). 용액을 남기지 않도록 주의하세요(이 용액에는 바이러스가 포함되어 있습니다).
    2. DNase 처리가 이루어지지 않은 경우: Step 3.1의 펠릿이 담긴 초원심분리관에 뉴클레아제 무분자 등급의 물 100 μL을 추가합니다. 펠릿을 부드럽게 긁어내고 다시 현탁하세요. 재현탁된 펠릿을 DNA 추출의 입력 요소로 사용하세요.

5. DNA 정량

  1. 추출된 DNA를 선택한 형광 기반 방법으로 정량합니다.
    참고: 바이러스 DNA 수율은 흡수도 기반 정량화에 충분히 높지 않은 경우가 드물며; 하지만 이 방법은 여전히 화학 오염물질을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  2. 단기 저장을 위해서는 정량 후 DNA를 -20 °C에 저장하세요. 장기 보관을 위해서는 -80°C에서 보관하세요. DNA는 이제 라이브러리 준비와 서열 분석 준비가 완료되었습니다. 여기서 사용되는 도서관 준비 키트와 시퀀싱 플랫폼에 대해서는 자료표 를 참고하시기 바랍니다.

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결과

이 프로토콜을 단일 냉동 대변 샘플(바이로메는 기술적 삼중으로 처리함)과 두 개의 토양 샘플에 적용한 탐색적 연구에서, 다양한 샘플 유형에서 고품질 바이롬을 생산하는 데 효과가 있음을 입증했습니다. 품질 필터링된 시퀀싱 데이터와 이 프로토콜에서 생성된 신규 조립 조직을 사용하여, 오픈 소스 바이러스 식별 도구20을 사용해 추정되는 바이러스 서열을 확인했습니다. 확인된 바이러스 컨티그에 매핑된 리드를 각 샘플의 바이러스 상대적 풍부도를 추정하는 데 사용되었습니다. 대변 바이러스 서열은 바이러스 서열에 풍부해졌으며, 바이러스 리드는 전체 시퀀싱된 전체 리드의 평균 74%를 차지한 반면, 동일한 샘플에서 생성된 전체 메타게놈에서는 4%에 불과했습니다(그림 1A). 또한, 대변 샘플에서 높은 신뢰도의 바이러스 게놈이 생성되었습니다(

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토론

이 프로토콜은 비교적 간단하고 유연한 바이러스 생성 방법을 제시합니다. 토양14, 15, 16, 21에서 입증되었으며, 인간 대변 샘플에도 성공적으로 적용되고 있습니다. 이 프로토콜은 세포 외 온전한 DNA 바이러스를 가장 잘 회수하며, 의도적으로 세포 내 바이러스나 프로파지(오염 세포에서 일부 회수될 수 있음), 매우 큰 DNA 바이러스, 또는 RNA 바이러스를 복원하도록 설계되지 않았습니다. 이 그룹을 조사하고자 할 경우 쌍 세포 분획이나 벌크 메타게놈을 생성하는 것이 유용할 수 있습니다. 그 기반은 단순하며, 프로토콜은 우리에게 성공한 표준 워크플로우를 제시하지만, 핵심 요소들은 개인의 필요와 연구 질문에 따라 유연합니다. 필터 크기, ...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

IRB 프로토콜과 윤리 기준에 따라 대변 샘플을 수집하고 제공해 주신 션 아담스, 트리나 노츠, 모하메드 R. 알리 박사(캘리포니아 대학교 데이비스 의과대학)에게 감사드립니다. 대변 샘플 분석에 협력해 주신 매튜 R. 올름 박사(콜로라도 대학교 볼더 캠퍼스)께 감사드립니다. 이 연구는 NIH 공통기금(인간 바이러스 프로그램)의 지원을 받았으며, 수여 # U01DE034198. LSH는 또한 미국 에너지부(DOE), 과학국, 생물 및 환경 연구국(BER), 유전체 과학 프로그램(DE-SC0023127 수상 번호 DE-(JBE 보조금, PI 시드니 글래스먼 보조금)의 부분 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 혈청 알부민(BSA) DNase 및 프로테아제 없는 분말피셔 바이오리시약BP9706100PPBS 레시피 (Step 1.1)
DNeasy PowerSoil Pro 키트치아겐47016DNA 추출 키트 (4.1단계)
KAPA DNA HyperPrep 라이브러리 키트로슈해당 없음이 키트로 생성된 라이브러리는 Illumina NovaSeq 6000 플랫폼(2 x 150 bp)을 사용하여 시퀀싱되었습니다.
황산마그네슘(MgSO4), 무수성, 그리고 99.5%시그마-올드리치M7506PPBS 레시피 (Step 1.1)
인산염 완충식염수(PBS), 10배, pH 7.4, RNase 무첨가인비트로젠AM9624PPBS 레시피 (Step 1.1)
폴리에테르설폰(PES) 막 주사기 필터, 멸균, 28 mm, 0.2 & mu; m코닝431229주사기 여과용 (2.9단계)
폴리프로필렌 원뿔 원심분리관, 멸균, 50 mL올림푸스 플라스틱스28-108
시트산칼륨 모노하이드레이트 (결정성/인증)피셔 케미컬P222PPBS 레시피 (Step 1.1)
Qubit  분석관인비트로젠Q32856DNA 정량화(5.1단계)
큐비트 4 형광도계인비트로젠Q33238DNA 정량화(5.1단계)
큐비트 dsDNA 정량 분석 키트인비트로젠Q32850DNA 정량화(5.1단계)
RQ1 RNase-Free DNase프로메가PR-M6101반응 버퍼, DNase, 차단액 포함
Supor 친수성 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 주사기 필터, 멸균, 32mm, 5.00 및 마이크로; m 시티바 (이전 명칭: 팔 랩)28150-956주사기 여과용 (2.9단계)
초원심분리기 로터: 50.2 Ti 고정각 로터, 50,000 rpm, 302,000 x g, 12 x 39 m벡먼 쿨터337901또한 벡맨 쿨터 타입 70 Ti 고정 각도 티타늄 로터(카테고리 337922)도 사용합니다. 70 Ti를 사용할 경우 3시간 동안 원심분리기를 사용하세요.
초원심분리관: 26.3 mL 폴리카보네이트 병 캡 조립체, 25 x 89mm벡먼 쿨터355618Type 50.2 Ti (Cat. 337901) 및 Type 70 Ti (Cat. 337922) 벡만 쿨터 로터와 호환
초원심분리기: 벡만 인스트루먼트 옵티마 LE-80K 바닥 초원심분리기벡먼 쿨터365668또한 Beckman Coulter L8-70M 냉장 초심심분리기(Cat. 344196)도 사용합니다

참고문헌

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  12. Roux, S., et al. Towards quantitative viromics for both double-stranded and single-stranded DNA viruses. PeerJ. 4, e2777(2016).
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  14. ter Horst, A. M., et al. Minnesota peat viromes reveal terrestrial and aquatic niche partitioning for local and global viral populations (vol 9, 233, 2021). Microbiome. 9 (1), (2021).
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