본 프로토콜은 공간 전사체 데이터 분석을 위한 재현 가능한 워크플로우를 제시하며, 공개 데이터 획득 및 Seurat 기반의 품질 관리부터 통합, 공간적 특징 검출, 세포 유형 디콘볼루션(deconvolution), 관심 영역 주석 달기, 그리고 세포 간 통신 분석에 이르기까지의 과정을 안내하며, 투명한 실행을 지원하는 실질적인 체크포인트를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
공간 전사체학(Spatial transcriptomics, ST)은 조직 절편 내 mRNA 분자의 2차원적 공간 문맥을 유지하면서 전유전체 수준의 유전자 발현을 프로파일링하여, 조직 구조 및 미세환경 관련 생물학 연구를 가능하게 합니다. 그러나 데이터 가져오기, 품질 관리, 통합, 디콘볼루션(deconvolution), 공간 통계 및 시각화 과정에서 종종 여러 소프트웨어 환경과 재현 가능한 파라미터 선택이 필요하기 때문에 ST 분석은 여전히 까다로운 과제로 남아 있습니다. 본 프로토콜은 R을 이용한 공개 ST 데이터셋의 실용적인 계산 워크플로우를 제시하며, 데이터 획득 및 소프트웨어 설정부터 시작하여 Seurat 기반의 데이터 로딩, 품질 관리, 정규화, 다중 샘플 통합, 클러스터링 및 공간 가변 유전자 분석으로 이어집니다. 이후 워크플로우는 참조 가이드형 SPOTlight 분석 및 비지도 학습 기반 STdeconvolve 토픽 모델링을 포함한 상호 보완적인 디콘볼루션 전략을 적용하며, 이어서 Giotto 기반의 공간적 세포 간 통신 분석과 맞춤형 Python Dash 애플리케이션을 이용한 인터랙티브 관심 영역(ROI) 선택을 수행합니다. 스크립트 기반 실행, 명시적인 파라미터 근거, 예상 결과 및 문제 해결 체크포인트를 강조함으로써, 본 프로토콜은 데이터셋 및 플랫폼별 파라미터 평가 후 표준 어레이 기반 ST 데이터셋 및 관련 플랫폼에 적용 가능한 유연한 프레임워크를 제공합니다.
서론
공간 전사체학(Spatial transcriptomics, ST)은 조직 절편 내 메신저 RNA(mRNA) 분자의 공간적 좌표를 유지하면서 게놈 전반의 유전자 발현을 측정하는 혁신적인 기술군입니다. ST 방법에는 위치 바코드가 지정된 어레이를 사용하는 시퀀싱 기반 접근법과 온전한 조직 미세환경 내에서 전사 신호를 매핑하는 in situ 이미징 접근법이 포함됩니다1,2. ST는 공간적 맥락을 보존함으로써, 조직 해리 후에는 완전히 분석할 수 없는 조직 구조, 세포 인접 조직 구성, 세포 간 통신 및 미세환경 관련 생물학적 과정의 분석을 가능하게 합니다3.
공공 ST 데이터 저장소의 급격한 성장은 2차 분석 및 방법론 개발에 전례 없는 기회를 제공해 왔습니다3. CROST 데이터베이스와 같은 리소스는 다양한 종과 기술 플랫폼에 걸쳐 수백 개의 공간 분해 전사체 데이터셋을 큐레이션하며, STOmicsDB와 같은 전문 컬렉션은 Stereo-seq와 같은 특정 방법론에 집중합니다4,
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프로토콜
본 프로토콜에서 분석된 모든 생물학적 데이터 세트는 공개적으로 이용 가능하며 엄격히 시연 목적으로만 사용되었습니다. 구체적인 데이터 액세션 번호와 소스 저장소는 관련 단계에 제공됩니다. 원본 데이터 세트는 각 소스 연구에 적용 가능한 기관 윤리 지침에 따라 원본 연구자에 의해 생성되었습니다. 필요한 모든 소프트웨어 및 R-패키지 버전을 확인하려면 재료 표를 참조하십시오.
하드웨어 요구 사항: 이 워크플로에 필요한 계산 메모리는 분석하는 샘플 및 스폿 수에 따라 달라집니다. 일반적인 공간 전사체 데이터셋(예: 최대 3개 샘플에 대해 샘플당 약 3,000개 스폿)의 경우, 최소 16 GB의 RAM을 갖춘 표준 워크스테이션이면 파이프라인을 실행하기에 충분합니다. 하지만 최적의 성능과 안정성을 보장하기 위해, 특히 SCTransform 정규화 및 디컨볼루션 중 행렬 분해와 같이 메모리 집약적인 계산 단계에서는 32 GB 이상의 RAM을 사용할 것을 강력히 권장합니다.
1. 데이터 획득 및 디렉토리 구조 준비
- 공공 공간 전사체 데이터셋(예: 2021년 3월 26일 제출, 2022년 3월 6일 최종 업데이트된 GEO acc....
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결과
워크플로우 구현 및 데이터 통합을 통한 주요 조직 특성 분석
마우스 결장 공간 전사체 데이터에 계산 워크플로우를 적용하여 분석 단계별 예상 결과물을 예시하였다. 워크플로우 도식(그림 1)에 나타낸 바와 같이, 파이프라인은 데이터 획득 및 품질 관리로 시작되었으며, 여기서 공간 특성 플롯을 통해 조직 경계를 정의하였다(그림 2A,B). 이후 해석 가능한 생물학적 변이를 보존하면서 기술적인 배치 효과를 줄이기 위해 Seurat의 앵커 기반 통합 워크플로우를 사용하였다. UMAP 시각화를 통해 통합 후의 샘플 정렬 및 공간 클러스터링 패턴을 확인하였다(그림 2C,D). 차원 축소 및 후속 클러스터링을 안내하기 위해 누적 분산을 기반으로 .......
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토론
본 프로토콜은 분석적 깊이와 실질적인 접근성 사이의 균형을 맞춘 공간 전사체 데이터 분석을 위한 종합적인 계산 워크플로우를 제공합니다. 단계별 접근 방식을 통해 초기 데이터 획득부터 고급 공간 분석에 이르는 전체 분석 파이프라인을 연구자에게 안내하며, 중요한 결정 지점과 잠재적인 오류 가능성을 강조합니다.
프로토콜의 여러 단계는 후속 결과에 미치는 영향으로 인해 특별한 주의가 필요합니다. 지나치게 엄격한 필터링은 생물학적으로 유의미한 스팟을 제거할 수 있고, 반대로 완만한 임계값은 기술적 노이즈를 유발할 수 있으므로, 품질 관리 및 필터링 임계값은 특정 조직 유형과 기술 플랫폼에 맞게 세심하게 조정해야 합니다. 정규화 방법의 선택은 후속 클러스터링 및 차등 발현 결과에 상당한 영향을 미칩니다. 예를 들어, 본 파이프라인은 표준 로그 정규화 대신 SCTransform을 사용하는데, 이는 SCTransform이 단일 세포 및 공간 워크플로우에서 시퀀싱 깊이 및 기타 기술적 효과와 관.......
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공개 사항
저자들은 상충되는 재정적 이해관계가 없음을 밝힙니다.
감사의 글
저자들은 Seurat, Giotto 및 SPOTlight 패키지의 개발자와 관리자들의 지원과 문서화에 감사를 표합니다. 또한 공공 데이터 저장소의 기여와 데이터 세트를 관대하게 공유해 준 연구자들에게도 깊은 감사를 드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ggplot2 | Posit Software, PBC | v4.0.0(CRAN) | 고급 데이터 시각화 |
| Giotto | Dries Lab | v4.2.2 (GitHub) | 공간 네트워크 및 세포-세포 간 통신 분석 |
| patchwork | Thomas Lin Pedersen | v1.3.2 (CRAN) | 플롯 구성 및 배치 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.4.3 | 핵심 실행 환경 (macOS aarch64) |
| scater | Davis McCarthy et al. | v1.34.1 (Bioconductor) | 단일 세포 품질 관리 및 시각화 |
| scran | Aaron Lun et al. | v1.34.0 (Bioconductor) | 단일 세포 분산 모델링 및 마커 검출 |
| Select Spatial Spots (사용자 정의 Python 도구) | LeafLight | v1.0.0 (GitHub) | 대화형 공간 관심 영역(ROI) 선택 (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots) |
| Seurat | Satija Lab | v5.3.0 (CRAN) | 공간 데이터 전처리, 통합 및 클러스터링 |
| SeuratObject | Satija Lab | v5.2.0 (CRAN) | 단일 세포 및 공간 데이터를 위한 데이터 구조 |
| SingleCellExperiment | Bioconductor Core Team | v1.28.1 (Bioconductor) | scRNA-seq를 위한 표준화된 데이터 컨테이너 |
| SPOTlight | Marc Elosua-Bayes et al. | v1.10.0 (Bioconductor) | 참조 가이드 기반 공간 디컨볼루션 |
| Stdeconvolve | Jean Fan Lab | v1.3.2 (Bioconductor) | 비지도 잠재 토픽 모델링 |
| tidyverse | Posit Software, PBC | v2.0.0 (CRAN) | 핵심 데이터 조작 및 포맷팅 스위트 |
참고문헌
- Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.
- Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
- Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
- Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcri....
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재인쇄 및 허가
