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방법 논문

비염증 조건에서 마우스 pks+ 대장균에 의한 정착

370 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70204

⸱

2026년 3월 10일

 , 
1Nutrition and Microbiome Laboratory, Institut du Cancer de Montréal, Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM), 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Université de Montréal

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 비염증 조건에서 pks+ 대장 균 쥐를 정착하는 데 필요한 절차와, 대변 내 pks+ 대장균 확장의 비침습적 확립 및 평가 방법을 설명합니다.

초록

pks+ 대장균은 특히 조기 발병 CRC를 가진 젊은 환자들 사이에서 대장암(CRC) 발생에 점점 더 연관되어 있습니다. pks+ 대장균 균주는 제노톡신 콜리박틴을 생성하는데, 이는 CRC와 관련된 세포 증식 및 분화 경로에서 이중 가닥 DNA 절단과 돌연변이를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 이 글에서는 박테리아 접종체 준비부터 집락화 검증까지 비염증 조건에서 쥐의 pks+ 대장 균 정착 방법을 자세히 설명합니다. 하룻밤 잠복 후, pks+ 대장 균 대장균 NC101 을 항생제 조건 상태의 마우스에 경구 관개 를 통해 투여합니다. 대변 내 콜로넌화는 유당 발효 그람 음성 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 정량화하고 정량적 PCR 증폭을 통해 평가합니다. 이 프로토콜을 사용하면, C57BL/6 마우스에 대 장균 NC101이 성공적으로 정착된 후, 식이섬유 이눌린 보충이 pks+ 대장균의 성장을 촉진했으며, 이는 CFUs 회복 증가, 장관박테리아과(Enterobacteriaceae ) 계열 개체 증가, clbP 수치 증가로 나타난다 진. 요약하자면, 이 모델은 CRC 발달에 관여하는 주요 병리체를 표적으로 하는 예방 및 치료 치료의 연구를 가능하게 합니다.

서론

장내 미생물군집은 숙주 건강과 질병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 장내 미생물 군집 불균형, 즉 특정 잠재적 병원성 박테리아(pathobionts)의 과증식은 심혈관 질환, 염증성 장질환(IBD), 암 1 등 여러 질병 상태의 특징으로 확인됩니다. pks+ 대장균은 IBD2 및 대장암(CRC) 환자의 대장 조직 샘플에서 건강한 사람과 비교해 풍부하게 관찰되는 병원체입니다. pks+ 대장균의 종양 촉진 활성은 폴리케티드 합성효소(pks) 유전자 클러스터의 발현과 제노톡신 콜리박틴4의 생성과 연관되어 있습니다. 콜리박틴은 대장 상피세포의 핵으로 이동하여 이중 가닥 DNA 절단5와 CRC 관련 주요 경로6의 돌연변이를 형성합니다. pks+ 대장균 정착은 대장염 관련 CRC(CAC) 전임상 모델에서 종양 발생7과 종양 진행3에 기여하는 것으로 나타났습니다. 최근에는 콜리박틴에 의한 돌연변이 유발이 조기 발병 CRC 8,9와 연관되어 있습니다. 50세 미만에서 발생하는 조기 발병 CRC 발생률은 최근 수십 년간 증가해 왔으며, 현재의 CRC 발생률 감소를 되돌릴 잠재력이 있습니다9.

pks+ 대장균이 CRC 발달뿐만 아니라 숙주 건강의 다른 미생물군 매개 측면에서의 역할도 계속 밝혀지고 있습니다. 또한, 염증10, 루날철 농도11, 식이 요인12,13 등 여러 요인이 pks 유전자 발현에 영향을 미치는 것으로 밝혀져 미생물군 표적 중재의 문을 열어주고 있습니다. 여기서는 pks+ 대장균 변종 NC101(대장균 NC101)의 마우스 균주를 이용한 pks+ 대장균 장내 정착을 위한 경구 개비지를 통한 방법을 설명합니다. 다른 모델들은 구강 개막 및 직장 면봉 채취로 단일 집착된 무생균(GF) 마우스에서 대장균 NC101의 염증 및 발암에 미치는 영향을 평가했으며,3, 유전적 감수성(IL-10-/-) 대장염모델에서 3,14, 그리고 화학적 유도 대장 염증 및 장 장벽 파괴 모델에서15. 그러나 pks+ 대장균에 대한 비용 효율적인 정착은 항생제로 사전 처리된 특이적 병원체-무(SPF) 마우스에서 비염증 조건 하에서도 이루어져 정착 및 확장의 지위를 만들 수 있습니다 14,16,17. 쥐 배설물에서 pks+ E. coli를 검출하고 정량하는 다양한 방법도 제시되는데, 여기에는 clbP 유전자의 정량적 PCR(qPCR) 증폭, 장관세균과의 풍부도를 평가하는 qPCR 평가, 그리고 그람 음성 유당발효균에 특이적인 맥콘키 한천 배지에서 집락형성 단위(CFU) 회수 등이 포함됩니다. 이 방법들은 pks+ 대장균의 존재와 콜리박틴 생성 여부를 검증 목적으로 또는 미생물 표적 개입에 대한 반응에서 pks+ 대장균 확장의 차이를 평가하는 데 서로 교환하여 또는 함께 사용될 수 있습니다.

여기서 이 프로토콜은 식이섬유 이눌린이 qPCR에 의한 pks+ 대장균 집락화 및 확장, 그리고 CFUs 회복에 미치는 영향을 평가하는 데 사용됩니다. 이눌린은 장내 유익한 비피도박테리움과 락토바실러스 종의 성장을 촉진하고, 장 항상성에 중요한 역할을 하는 단쇄 지방산 생성을 증가시키는 것으로 밝혀진 프리바이오틱입니다. 그러나 이눌린은 PKS+ 대장균과 콜리박틴 생성을 촉진하는 것으로 나타났으며, 이는 DSS 처리된 선종성 대장포종성 대장군(Apc)Min/+ CRC 모델에서 종양 발생을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 이 실험은 염증이나 장벽 손상 없이 쥐 모델에서 식이 이눌린에 반응하는 pks+ 대장균 확장을 평가합니다.

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프로토콜

모든 절차는 몬트리올 대학교 병원 센터(CRCHUM) 기관 동물 돌봄 위원회의 승인을 받은 캐나다 동물 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 7주 된 쥐를 상업 공급처에서 확보하여 실험 시작 1주일 전부터 적응시켰습니다. 이 방법의 도식적 표현은 그림 1에 제시되어 있습니다. 이 연구에 사용된 동물, 시약, 장비의 세부 사항은 재료표에 나열되어 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1: pks+ 대장균 준비 및 군집화 도식. 4일째 날: 개귀 수술 4일 전, 쥐에게 항생제를 투여합니다. D-1: 개베지(개귀) 24시간 전, 항생제를 제거하세요. pks+ 대장균 배양을 준비하여 하룻밤 부화시키세요. D0: pks+ 대장균 접종을 준비합니다. 접종 준비 후 가능한 한 빨리 경구 경구 경유를 통해 pks+ 대장균 또는 생리식염수 차량 대조제를 쥐에게 투여하세요. D7+ 쥐의 배설물을 채취하여 pks+ 대장균 정착을 검출하고 정량화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. 항생제 치료

  1. 멸균된 식수에서 암피실린, 콜리스틴, 스트렙토마이신을 희석하여 최종 농도는 암피실린 1 mg/mL, 콜리스틴은 1 mg/mL, 스트렙토마이신은 5 mg/mL로 만듭니다.
  2. 3일간 음용수에서 항생제를 자유롭 게 사용할 수 있도록 허용하세요.
  3. 항생제를 제거하고 24시간 동안 세척 기간 동안 대 장균 NC101 접종으로 멸균수를 회복하세요.
    참고: 항생제 용액은 각 실험마다 신선하게 준비해야 합니다. 항생제 용액의 적절한 섭취 여부를 모니터링해야 합니다. 필요하다면 물에 감미료를 첨가할 수 있습니다.

2. 대장균 NC101 접종구 제제 (최대 n = 12마리)

참고: 2.1-2.8단계는 무균 기법을 사용하여 수행해야 합니다.

  1. 라이소겐 육수(LB)를 준비하고 오토클레이브하세요.
  2. 멸균 접종 루프를 사용해 글리세롤 스톡에서 LB 한천 플레이트로 스트릭 E . coli NC101. 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
  3. 접종 루프를 이용해 LB 한천 플레이트의 단일 콜로니와 함께 배양관에 멸균 LB 육수 5mL를 접종합니다. 37°C에서 150rpm의 작업대 위 인큐베이션 셰이커에서 하룻밤 배양하세요.
  4. 배양관을 1500 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다.
  5. 상원액을 제거하고 버리되, 튜브 바닥에 흰색 침전물이 남게 되는 박테리아 펠릿은 피하세요.
  6. 박테리아 펠릿을 0.9% 멸균 식염수 5mL에 재현탁합니다.
  7. 4단계부터 6단계까지 반복해서 세척하세요.
  8. 세포 밀도계를 사용해 600 nm(OD600)에서 광학 밀도를 측정하고, 멸균 생리식염수를 사용해 OD600 을 0.625(~1 x 108 CFU/마우스)로 조정합니다.
    참고: 3단계에서 육수에 박테리아 오염이 없도록 하기 위해, 멸균된 LB 육수를 2-3mL 별도의 튜브로 하룻밤 배양하세요. 육수는 하룻밤 배양 후에도 투명하게 유지되어야 하며, 이는 박테리아 오염이 없음을 의미합니다. 시작 OD600 이 0.625 미만이라면, 4단계부터 6단계까지 반복하며 펠릿을 재현수하는 부피를 줄이세요. 대 장균 NC101의 정확한 용량을 보장하기 위해 가베지 액체를 연속적으로 희석하여 하룻밤 배양해야 합니다. 각 희석에 대한 CFU 수로 박테리아 현탁액의 초기 CFU 양을 추정하는 데 사용될 수 있습니다.

3. 대 장균 NC101의 구강 게비

  1. 박테리아 인종을 부드럽게 흔들어 박테리아가 고르게 분포하도록 하세요.
  2. 개비지 바늘을 1mL 주사기에 끼우고 0.2mL의 박테리아 접종체를 채워 공기 방울을 제거하세요.
  3. 쥐를 우리에서 꺼내고, 엄지 패드와 검지 옆면을 이용해 귀 뒤부터 어깨뼈까지 피부를 잡아 부드럽지만 단단하게 쥐의 목덜미를 잡으세요. 같은 손의 중지나 약지로 꼬리를 고정하세요.
  4. 쥐를 똑바로 세운 채 입 옆에 가비지 바늘을 꽂으세요. 개비지 바늘 끝을 입천장을 따라 식도와 위 쪽으로 미끄러지게 하며, 마우스의 머리를 부드럽게 뒤로 밀어 목을 늘려 넣습니다. 저항이 느껴지면 개비지 바늘을 제거하세요. 필요하면 마우스를 다시 묶고 다시 시도하세요.
  5. 박테리아 접종제(0.2mL)를 천천히 주입한 뒤, 삽입 각도와 같은 방향으로 바늘을 빼세요.
  6. 쥐를 다시 우리에 넣고 남은 쥐들을 처리하세요.
    참고: 박테리아 접종은 준비 후 가능한 한 빨리 투여해야 합니다. 대조군 마우스는 0.9% 멸균 생리식염수(차량)를 0.2mL 투여해야 합니다. 각 실험에서 쥐의 평균 체중을 바탕으로 적절한 길이, 게이지, 볼 직경을 결정해야 합니다. 5분 후 동물 시설을 떠나기 전에 쥐의 호흡 패턴과 활동을 확인하세요. 호흡 곤경이나 호흡 곤란이 관찰되면 승인된 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시키십시오. 구강 개비지는 훈련된 연구진에 의해서만 시행해야 합니다. 구강 개베이지를 부적절하게 시행하면 식도 천공이나 폐에 주입되는 등 심각한 합병증이나 사망에 이를 수 있습니다. 경험 많은 연구진이 시행할 경우 사망은 예상되지 않습니다. 이 실험에 사용된 쥐는 SPF 조건 하에 보관해야 합니다. 우리 간 오염을 방지하기 위해 개별 환기가 되는 우리를 사용해야 하며, 쥐는 생물학적 안전 캐비닛에서 조작해야 합니다. 각 우리를 열기 전에 손과 우리장 뚜껑 바깥쪽을 적절한 소독제(예: 가속 과산화수소)로 닦아야 합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 쥐 조작을 위한 PPE 요건에는 가운(일회용 또는 재사용 가능)과 장갑이 포함됩니다. 호스트 동물 시설에서는 추가 개인 보호 장비(PPE)를 요구할 수 있습니다. 대조 쥐를 이용한 모든 조작은 먼저 시행해야 합니다.

4. 대변 샘플 채취

  1. 3.3단계에서 설명한 대로 쥐의 목덜미를 긁어 1.5mL 마이크로 원심분리관에 넣어 각 쥐의 배설물 펠릿을 채취합니다. 쥐는 즉시 배설을 해야 합니다. 또는 쥐를 깨끗하고 빈 우리에 넣고 최대 30분간 기다리며 배신이 일어나도록 하세요.
  2. 샘플을 액체 질소에 넣어 급동합니다. 샘플은 추가 분석이 있을 때까지 -80 °C에 보관하세요.
    참고: 실험 시작 전에 대변에서 clbA 검출 또는 실시간 PCR로 clbP 를 정량하여 쥐가 pks+ 대장 균에 감염되지 않았는지 확인해야 합니다. 1주일 이상 정착을 유지하기 위해서는 실험 조건에 따라 항생제 사전 투여 없이 재발하는 세균 개벗기(단계 2.1-3.6)가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜을 처음 도입할 때는 대변 내 대 장 균 NC101의 CFU 회수 또는 실시간 PCR을 통해 최소 주 1회 이상 투여 빈도를 최적화해야 합니다.

5. 배설물 박테리아 DNA 추출

  1. 제조사의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용해 채취한 대변 샘플에서 박테리아 DNA를 추출하세요.
  2. 분광광도계를 사용해 DNA 농도를 측정하고 DNA 농도를 5 ng/μL로 조절합니다.

6. clbA 및 대장균 16S 유전자 검출을 통한 집락화 확인

  1. 제조사의 지침에 따라 적절한 마스터 믹스와 PCR 기기를 사용하여 clbA 및 대 장균 16S 리보솜 RNA(rRNA) 유전자를 PCR로 동시에 증폭합니다(보충표 1).
  2. 이전에기술한 대로 한혈 겔 전기영동을 통해 대장균 NC101 집락 마우스에서 clbA와 E. coli 16S 유전자를 시각화합니다. 비집집 쥐는 clbA 밴드가 없어야 합니다.

7. CFU 회수를 통한 대장균 NC101의 정량화

참고: 7.1-7.7단계를 무균 기법으로 수행하세요.

  1. 빈 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 무게를 재고 보세요.
  2. 대변 약 20mg을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 넣고, 샘플이 포함된 튜브의 무게를 기록합니다.
  3. 각 튜브에 0.9% 멸균 생리식염수 200 μL을 추가합니다.
  4. 실온에서 변이 부드러워질 때까지 10-15분을 기다린 후, 각 관을 최대 속도로 5분간 소용돌이로 돌려 균일한 현탁액을 만듭니다. 소화되지 않은 음식 입자가 보일 수 있습니다.
  5. 각 현탁액 100 μL을 맥콘키 한천 플레이트에 옮기고, L자형 스프레더를 사용해 균질액을 고르게 펴 퍼뜨립니다.
  6. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 부양하세요.
  7. 분홍색 군락의 수를 세고 각 배설 펠릿의 무게와 도금된 부피로 정규화하세요.
    참고: 맥콘키 한천은 그람 음성 박테리아를 선택합니다. 또한, 유당을 발효시킬 수 있는 박테리아(예: 대장균)는 분홍색 군락을 형성하고, 발효하지 못하는 박테리아는 무색 또는 노란색 군락을 형성합니다. 이 프로토콜에서는 분홍색 군집만 포함되어야 합니다. 집락 수가 너무 높아 셀 수 없을 경우, 0.9% 멸균 생리식염수를 사용해 초기 동질체를 연속적으로 희석할 수 있습니다. 샘플당 콜로니 수를 계산할 때 희석 계수를 고려하세요.
    펠릿 무게 = 펠릿 샘플이 포함된 마이크로 원심분리관 무게 - 빈 마이크로 원심분리기 튜브의 무게.

8. clbP 유전자의 정량화

  1. 적절한 마스터 믹스와 기기를 사용하여 제조사 지침에 따라 실시간 PCR을 위해 clbP 및 보편 16S rRNA 유전자(보충표 1)를 증폭하여 실시간 PCR을 수행합니다.

9. 장세균과(Enterobacteriaceae) 정량화

  1. 적절한 마스터 믹스와 장비를 사용하여 실시간 PCR을 위해 정량적 PCR을 통해 장세균과 와 보편 16S RNA 유전자를 증폭합니다.

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결과

PCR 및 겔 전기영동을 통해 종말 내 대변에서 clbA 와 E. coli 16S 유전자를 증폭하고 시각화한 결과, 대장 균 NC101 집락 쥐에서는 두 유전자가 모두 관찰되었으나, 대조군 쥐에서는 대장 균 16S 유전자만 관찰되어 대 장균 NC101이 존재하지 않음을 확인했습니다(그림 2B).

예상대로 이눌린 보충 식단을 받은15, 대장균 NC101 집락 쥐는 1주일 후 MacConkey 한천에서 배양된 배설 균질체에서 더 높은 CFU 회복률, clbP 유전자 수치(그림 2D), 장...

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토론

콜리박틴을 생성하는 pks+ 대장균의 친암 효과는 최근 조기 발병 CRC9의 증가와 '서양식' 식단12의 채택과 연관되어 있으며, 이는 앞으로 수십 년간 CRC 추세를 계속 형성할 요인들입니다. 대부분의 pks+ 대장균 집락화 모델은 대장염 관련 암의 맥락에서 제시되며, 이는 비염증 상태에서 pks+ 대장균을 특성화하는 것을 허용하지 않습니다. 이 프로토콜은 쥐에서 pks+ 대장균 정착 방법을 설명하며, CRC 발달 및 치료 내성에 관여하는 병원체와 관련된 숙주-미생물군 상호작용을 연구하고, 이 박테리아의 유해 영향을 완화하는 표적 미생물군 변형 치료 전략 탐구를 가능하게 합니다20,21.

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 캐나다 보건연구소(CIHR, Grant CSV-198232)의 보조금으로 지원받았습니다. CRCHUM의 동물 시설에 감사드립니다. 피규어는 BioRender.com 을 사용해 만들어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 멸균 생리식염수백스터JF7634
10% 이눌린 맞춤 식단테클라드TD.240286대표 결과
50 ppm FeS04 (무섬유질) 맞춤 식단테클라드TD.120515대표 결과
8-12주 된 암컷 B6 쥐찰스 리버 연구소C57BL/6대표 결과 
암피실린 나트륨 소금  와이센트 주식회사400-110 XG
벤치탑 원심분리기피셔 사이언티픽75004381
셀 밀도 측정기바이오크롬80-2116-30
배양관, 13mL사르스테트62.515.006
ECNC101해당 없음해당 없음노스캐롤라이나 대학교 채플힐 캠퍼스의 크리스천 조빈 박사가 기증했으며;
개비지 바늘, 38mm x 22 G하버드 어플라어터스 캐나다34-024더 이상 구할 수 없습니다 - 잠재적인 대안은 Instech Labs (FTP-22-38)에서 구할 수 있습니다.
인큐베이터 궤도 셰이커VWR980153
접종 루프피셔 사이언티픽22-363-595
L자형 스프레더피셔 사이언티픽14-665-230
용입성 육수 및 nbsp;와이센트 주식회사800-060 LG파우더 35g과 물 1L을 넣으세요. 사용 전에 오토클레이브를 하세요.
용화원 육수 아가와 nbsp;와이센트 주식회사800-011 LG파우더 35g과 물 1L을 넣으세요. 사용 전에 오토클레이브를 하세요.
맥콘키 한천벡턴 디킨슨2113871L 물에 맥콘키 가루 50g을 넣으세요. 사용 전에 오토클레이브를 사용하세요. 
미생물 DNA 추출 키트치아겐47016
미생물 인큐베이터피셔 사이언티픽150152633
마이크로 원심분리관 1.5mL  얼티던트 사이언티픽73-M150-C
PCR 로터 - 유전자 스트립 튜브  얼티던트 사이언티픽73-V100-RG
페트리 접시사르스테트82.1472.001
실시간 PCR SYBR 그린 마스터 믹스ThermoFisher A25742
실시간 PCR 열 사이클러코벳 연구RG-3000A
스크류 캡 튜브, 15mL사르스테트62.554.502
나트륨 콜리스타임그에 프레제니우스 카비C309306
스트렙토마이신 황산염 소금밀리포어 시그마S9137
투버쿨린 슬립 튜브, 1mL벡턴 디킨슨309659
소용돌이피셔 사이언티픽12-812

참고문헌

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