본 연구는 16S rRNA 시퀀싱을 사용하여 건강한 대조군, 치료받지 않은 PD 환자, 피리베딜 치료를 받은 PD 환자의 장내 미생물 군집을 비교하고, 피리베딜 치료와 관련된 미생물 조성의 차이를 확인하였습니다.
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본 연구는 16S rRNA 시퀀싱을 사용하여 건강한 대조군, 치료받지 않은 PD 환자, 피리베딜 치료를 받은 PD 환자의 장내 미생물 군집을 비교하고, 피리베딜 치료와 관련된 미생물 조성의 차이를 확인하였습니다.
이 연구는 피리베딜 치료가 파킨슨병(PD) 환자의 장내 미생물군을 변화시키는지 여부를 규명하고, 피리베딜에 의해 유발된 장내 미생물군 변화와 그 잠재적 임상적 의미를 이해하는 데 이론적 참고 자료를 제공하는 것을 목표로 했습니다. 대변 샘플은 16S 리보솜 RNA(16S rRNA) 유전자 서열 분석을 통해 분석하였습니다. 피리베딜을 복용한 PD 환자(피리베딜 그룹), 피리베딜을 복용하지 않은 PD 환자(PD 그룹), 건강한 대조군(빈 그룹) 간의 비교가 이루어졌다. 공백 그룹과 비교했을 때, 포 도상구균, 로도코커스 및 기타 속의 상대적 풍부도는 PD 그룹에서 더 높았으며, 아 크로모박터 와 델프티아 의 상대적 풍부도는 낮았습니다. 더불어, 피리베딜 그룹에서 아 크로모박터, 델프티아, 스테노트로포모나스 의 상대적 풍부도가 PD 그룹에 비해 높았으나, 포 도상구균, 로도코커스 및 기타 종의 상대적 풍부도는 낮았습니다. 건강한 사람들과 비교했을 때, PD 환자의 장내 미생물군은 유의미한 변화를 보였습니다. 피리베딜을 복용하는 환자의 장내 미생물군은 치료받지 않은 환자와 유저하게 다릅니다. 이 결과는 피리베딜과 PD 환자에서 장내 미생물군 변화 간의 연관성을 시사합니다.
파킨슨병(PD) 발생률은 점차 증가하고 있으며; 그러나 그 병인과 병인기는 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 더 많은 연구들은 장내 미생물군이 파킨슨병의 발병 및 발병과 밀접한 관련이 있음을 보여주고 있습니다. He et al.1은 PD 환자의 장내 미생물 구성이 건강한 사람과 다르며, 장 병원체 증가가 PD 발병과 연관될 수 있음을 문서화했습니다. Scheperans 등2는 PD 환자의 장내 Prevotella 와 Bacteroides 의 상대적 풍비가 감소함을 확인했습니다. 그리고 이 박테리아 속들이 장 장벽 기능과 강하게 연관되어 있음을 알 수 있습니다.
장내 미생물군과 파킨슨병 간의 연관성을 조사한 여러 연구가 진행되었습니다. 연구에 따르면 디스바이오시스는 파킨슨병의 병태생리에서 중요한 역할을 할 수 있으며, 염증과 대사 장애 등 다양한 기전을 통해 운동 및 비운동 증상에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, PD 약물 치료는 장내 미생물군의 조성을 변화시키는 것으로 나타났으며, 이는 약물과 장내 미생물군 간의 복잡한 상호작용을 강조합니다.
비선택적 도파민 수용체 작용제로서 피리베딜은 파킨슨병 관리에 중요한 역할을 합니다; 도파민수용체를 자극하여 환자의 운동 증상을 개선할 수 있습니다. 그러나 임상 사용은 주로 메스꺼움, 구토, 복부 불편감 등 위장 증상으로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 이러한 부작용의 근본 기전은 아직 명확하지 않으며, 피리베딜에 의해 유도된 장내 미생물군 변화와 관련이 있는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.
장내 미생물군과 부작용 사이의 연관성은 최근 몇 년간 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. Hill-Burns 등은 PD 환자의 장내 미생물군을 분석하여장내 미생물군 다양성이 약물 치료 반응과 연관되어 있음을 발견했습니다. 또한, 도파민 작용제는 장 운동성과 미생물 구성에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 변화의 원인은 장내 수송 시기의 변화와 관련이 있으며, 이는 미생물의 다양성과 풍부도에 영향을 미친다. 더욱이 장내 미생물군은 약물 흡수와 대사에 영향을 미쳐 이 약물들의 효능과 부작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 파킨슨병에 흔히 사용되는 피리베딜이 장내 미생물군 구조를 조절하는지, 그리고 이러한 미생물 이동과 위장관 부작용 간의 연관성에 대한 체계적인 연구는 아직 부족합니다.
본 연구에서는 건강한 대조군, 치료받지 않은 PD 환자, 피리베딜 치료를 받은 PD 환자 간의 장내 미생물군 구조를 비교하였습니다. 우리는 피리베딜 치료가 PD 환자에서 장내 미생물 구성의 뚜렷한 변화와 연관되어 있으며, 이러한 미생물 변화가 피리베딜 관련 위장 부작용과 연관될 수 있다고 가설을 세웠습니다. 우리는 피리베딜과 관련된 특정 미생물 변이를 규명하고, 이들이 위장관 부작용과 연관될 가능성을 탐구함으로써 피리베딜 관련 부작용의 기전을 이해하는 데 이론적 기반을 제공하는 것을 목표로 했습니다.
장내 미생물군은PD-11의 병인 연구에서 중요한 방향입니다. PD 환자에서 피리베딜이 장내 미생물군에 미치는 영향을 관찰함으로써, 본 연구는 약물 관련 장내 미생물군 변화의 임상적 중요성을 명확히 하고, 피리베딜의 임상 사용 및 안전성 관리를 최적화하는 데 참고 자료를 제공합니다.
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이 연구는 안후이 중의대학 제1부속병원 윤리위원회(윤리 검토 번호: 2025AH-101, 윤리 승인일: 2025-07-02)에서 검토되었습니다.
연구 주제
안후이 중의대 제1부속병원에 PD와 건강한 대조군 환자가 등록되었습니다. 신선한 대변 샘플을 채취하여 추적 분석하였습니다. 신선한 대변 샘플을 수집하여 멸균된 EP 튜브에 넣고, 즉시 액체 질소에 급동한 후 장기 보존을 위해 −80 °C에 보관했습니다. PD 환자의 포함 기준은 다음과 같았습니다: (1) 임상적으로 진단된 PD; (2) 나이 >70세; (3) 피리베딜 그룹: 등록 후 피리베딜 단독요법을 시작했으며 이 약물에 대한 사전 노출이 없었으며; PD 그룹의 경우: 항파킨슨병 약물 치료를 받지 않았다; (4) 심각한 심장병, 간질환, 신장 질환, 암과 같은 다른 심각한 전신 질환이 없음. 등록 전에 각 참가자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 제외 기준은 다음과 같았습니다: (1) 심각한 운동 기능 장애와 같은 심각한 PD 합병증; (2) 최근 항생제 치료를 받은 경우; (3) 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군 등 연구 결과에 영향을 미칠 수 있는 다른 건강 상태의 존재; (4) 피리베딜 알레르기. 건강한 대조군(빈 그룹)은 연령이 일치하는 70세(>세)이며 신경학적 또는 주요 위장 질환 병력이 없는 사람들이었습니다.
모든 참가자는 등록 전에 규칙적인 식습관을 유지해야 했습니다. 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 식이섬유 보충제 또는 기타 영양 보충제를 받은 사람은 없었습니다. 또한, 모든 참가자는 샘플 채취 전 최소 3개월 동안 항생제 치료를 받지 않았습니다. 연구 기간 동안 표준화된 식이 중재는 시행되지 않았으나, 모든 참가자는 장내 미생물군에 대한 잠재적 혼란 효과를 최소화하기 위해 안정적인 생활 습관과 식단 유지를 지시받았습니다.
연구 그룹
이 연구 코호트는 세 그룹으로 나뉘었습니다: PD 그룹(n = 10): 항파킨슨병 약물을 복용하지 않은 파킨슨병 환자로부터 채취한 대변 샘플. 피리베딜 그룹(n=10): 파킨슨병 환자로부터 피리베딜(50mg, 하루 2회) 연속 치료 후 대변 샘플을 채취함. 공백 대조군(n=5): 건강한 개인으로부터 채취한 대변 샘플.
16S 리보솜 RNA 시퀀싱
시퀀싱 은다른 연구들에서 보고된 바와 같이 시퀀싱 플랫폼에서 수행되었습니다. 간단히 말해, 총 미생물 DNA는 도데실 황산나트륨(SDS) 방법을 사용하여 대변 표본에서 분리되었습니다. 추출된 DNA의 완전성은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 검증되었고, DNA 농도와 순도는 분광광도계로 측정되었습니다. 박테리아 16S rRNA 유전자의 과가변 영역 V3-V4는 퇴전 프라이머 341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')와 806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')과 중합효소 연쇄반응(PCR) 열사이클러를 사용해 유전체 DNA로부터 증폭하였다. 박테리아 16S rRNA 유전자의 증폭은 다음과 같은 열 조건에서 수행되었습니다: 94 °C에서 2분간 초기 전변성 단계, 이어서 94 °C 변성으로 30초, 55 °C 어닐링 30초, 72 °C 신장 30초로 이루어진 28회 사이클이 이어졌습니다. 마지막 연장은 72°C에서 10분간 진행되었고, 이후 반응은 4°C로 유지되었다. PCR 혼합물에는 2× PCR 마스터 믹스 25 μL, 전방향 프라이머(10 μM) 2 μL, 역방향 프라이머(10 μM) 2 μL, 템플릿 DNA 10 ng, 그리고 마지막으로 ddH2O에서 최대 50 μL로 구성되어 있습니다. PCR 반응은 3회로 수행되었습니다. PCR 혼합물에는 2× PCR 마스터 믹스 25 μL, 전방 프라이머(10 μM) 2 μL, 역방향 프라이머(10 μM) 2 μL, 템플릿 DNA 10 ng, 그리고 마지막으로 ddH2O에서 최대 50 μL까지 포함됩니다. PCR 반응은 3회로 수행되었습니다. PCR 제품은 2% 아가로스 젤에서 추출하여 젤 추출 키트로 정제하였습니다. MGI V2용 Universal Plus DNA 라이브러리 준비 키트가 라이브러리 구축에 사용되었습니다: (1) 스플린터 링크; (2) 자기 비드 스크리닝을 사용해 자기 연속 조인트 세그먼트를 제거; (3) PCR 증폭을 통한 라이브러리 템플릿 풍부화; (4) PCR 산물을 회수하는 자기 구슬; (5) PCR 산물의 고리화. 라이브러리 검증 후 시위서 분석이 수행되었습니다.
품질 검사 지점: 검사 지점 1 (샘플 채취): 샘플은 채취 직후 즉시 급동하여 −80°C에서 보관되었습니다. 녹거나 오염된 흔적이 보이는 샘플은 모두 폐기되었습니다. 검문소 2 (DNA 추출): 허용 순도: A260/A280 = 1.8–2.0, A260/A230 ≥1.8; 1% 아가로스 겔에 단일 고분자량 밴드를 사용해 무결성을 검증했습니다. 체크포인트 3(PCR 증폭): 2% 아가로스 겔에서 ~460bp 단일 밴드가 성공한 증폭을 나타냅니다(프라이머 341F/806R, V3-V4 영역); 없거나 특이적이지 않으면 어닐링 온도나 주형 농도를 조정하세요. 라이브러리 준비를 위해 회수 농도≥0.5 ng/μl가 필요했습니다. 체크포인트 4 (라이브러리 준비 및 시퀀싱): 시퀀싱 시설이 표준 검증 프로토콜에 따라 수행; 추가적인 자체 체크포인트(예: 바이오분석기 크기 조정)는 적용되지 않았습니다.
안전 및 폐기물 처리: 모든 샘플 취급 시 장갑과 실험복을 착용하였습니다. 작업면은 70% 에탄올로 청소되었습니다. 모든 오염된 소모품(팁, 튜브, 젤)은 생물학적 폐기물로 폐기되기 전에 121°C, 20분 오토클레이빙되었습니다.
생물정보학
16S rRNA 유전자의 원시 시퀀싱 리드는 먼저 탈다중화되어, fastp(버전 0.20.0)를 이용한 고품질 필터링을 거쳐 FLASH(버전 1.2.11)를 통해 표준화된 선별 기준에 따라 조립되었습니다. 간단히 말하면: (i) 50bp 슬라이딩 윈도우 내에서 평균 품질 점수가 20 이하로 떨어졌을 때 생시 300 bp 시퀀스가 절단되었습니다. 길이가 50 bp 미만이거나 염기가 모호한 리드는 제거되었고; (ii) 서열 조립은 10 bp를 초과하는 중첩 구간에만 수행되었으며, 겹치는 영역의 최대 불일치 비율은 0.2로 설정되었다. 조립되지 않은 쌍 없는 리드는 제거되었고; (iii) 개별 샘플은 바코드와 프라이머 서열을 기준으로 분할되어 이후 방향 조정을 수행했습니다. 바코드 매칭은 정확한 정렬로 수행되었고, 프라이머 매칭은 최대 2개의 뉴클레오타이드 불일치를 허용했습니다. 16S rRNA 리드는 Quantitative Insights into Microbial Ecology(QIIME) 파이프라인(버전 1.8.0)을 사용하여 분석되었습니다17. 태그 시퀀스는 FLASH(버전 1.2.11)18을 사용하여 페어드 엔드 리드에 추가되었습니다. 절단은 최소 길이 200 bp, 평균 품질 25의 UPARSE(버전 7.0.1090)를 사용하여 수행되었으며, 97% 컷오프에서 클러스터링하여 운영 분류 단위(OTU)를 생성했습니다19. 대표적인 OTU 리드는 RDP 분류기 2.2를 통해 분류되었으며, 신뢰 한계는 ≥0.6이었습니다. 태그 및 읽기 풍부도는 USEARCH 글로벌20을 사용한 비교를 통해 결정되었습니다. 키메라 서열의 식별은 UCHIME (v4.2.40)21을 이용한 Gold 데이터베이스와의 비교를 기반으로 하였다. 이후 Bray–Curtis 불일치를 기반으로 희소 데이터셋에 대해 주좌표 분석(PCoA)이 수행되었으며, 군집 시 시퀀스 유사도 임계값을 97%로 설정하였습니다. 대표적인 OTU와 해당 분류학적 프로필은 R 소프트웨어(버전 3.1.1)를 사용해 추가로 분석되었습니다. 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe) 알고리즘은 선형 판별 분석(LDA) 효과 크기를 기반으로 하며, OTU 수준에서 유의미한 차등 생물 표지자를 선별하는 데 적용되었습니다. 이 방법은 먼저 그룹 간 일관된 차이가 있는 특징(다중 그룹 비교를 위한 Kruskal-Wallis 검정 사용)을 확인한 후, LDA를 사용해 각 차등 풍부한 특징의 효과 크기를 추정함으로써 통계적 유의성과 생물학적 관련성을 모두 강조합니다. LDA 점수 >2.0은 유의미하게 증가한 개체 수로 정의됩니다22.
통계적 방법
통계 분석은 SPSS를 사용하여 수행되었습니다. 정규 분포 데이터는 일방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석되었습니다. 정규분포를 따르지 않는 데이터는 윌콕슨 랭크합 검정을 사용해 분석하였습니다. 모든 정량적 데이터는 정규분포에 부합하는 매개변수에 대한 평균 ± 표준오차(SE)로 표현되었고, 비정규분포 데이터는 중간값으로 표현되었습니다. p 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
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피리베딜 치료와 관련된 미생물 다양성 차이
DNA 추출 품질 관리 결과(농도 범위, 순도)는 보충 표 1에 제공되어 있습니다. PCR 증폭 품질 관리(밴드 크기, 회복 농도)는 보충 표 2에 나와 있습니다. 시퀀싱 품질 관리 지표(읽기 개수, 깊이, 커버리지)는 보충 표 3에 자세히 설명되어 있습니다. ACE, Chao1, InvSimpson, Shannon, Simpson 지수를 사용하여 대변 샘플 내 장내 미생물군을 분석하였습니다. ACE 및 Chao1 지수 결과는 블랭크 그룹과 PD 그룹 간에 장내 미생물군 다양성에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다. 그러나 InvSimpson, Shannon, Simpson 지수 결과는 빈 그룹의 장내 미생물 다양성이 PD 그룹보다 유의하게 낮았음을 나타냈다(
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파킨슨병은 전 세계적으로 두 번째로 흔한 신경퇴행성 질환으로, 알츠하이머병23에 이어 두 번째로 흔합니다. 1970년 이후 피리베딜은 도파민 수용체 작용제로서 PD24 치료에 널리 사용되고 있습니다. 하지만 임상 실무에서는 피리베딜이 메스꺼움, 구토, 위장 불편함과 같은 부작용을 일으킬 수 있습니다. 점점 더 많은 연구가 파킨슨병의 발달과 도파민 수용체 작용제를 이용한 치료 개입이 장내 미생물 군집 프로필을 재구성할 수 있음을 입증하고 있습니다.
성공적인 미생물군 분석은 여러 중요한 단계에 달려 있습니다: 박테리아 과증식을 막기 위해 대변 샘플을 30분 이내로 즉시 냉동; SDS 방법을 이용한 일관된 DNA 추출; 엄격한 PCR 품질 관리(2% 아가로스 겔에서 단일 ~460 bp 밴드 검사); 그리고 DNA 순도 검증(A260/A280...
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저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 말합니다.
이 연구는 안후이성 학술 지도자 예비 후보 지원금 프로젝트(번호 2022H287), 안후이성 위생 및 건강 우수 인재 프로젝트(번호 ahsjhmypygc20230074), 안후이성 전통 중의학 유전 및 혁신 과학 연구 프로젝트(2025CCCX017), 안후이 중의학대학 기초-임상 통합 특별 프로젝트(JCLCA2025009)의 지원을 받았습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | 강웨이 | CW0690 | |
| 아가로스 | (일반) | 해당 없음 | 분자 생물학 등급 |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (제공되지 않음) | |
| 벤치톱 고속 냉동 원심분리기 | 후난 코세이 | GTR116C | |
| DNA 추출 시약(SDS, 페놀, 클로로포름, 에탄올) | (일반) | 해당 없음 | |
| DNBSEQ-G99 PE300 시퀀싱 플랫폼 | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| 겔 전기영동 장치 | 베이징 리우이 | DYY-8C | |
| 겔 이미징 시스템 | 상하이 자펭 | JP-2880 | |
| LEfSe 소프트웨어 | (오픈 소스) | 온라인 버전 | |
| 나노드롭 분광 광도계 | 항저우 하이페 | Aurora-900 | |
| PCR 기계 | 항저우 랑지 | A200 | |
| 피리베딜 | 서비에 | 6094078 | |
| 프라이머: 341F 및 806R (합성) | (맞춤형 합성) | 해당 없음 | |
| QIIME 소프트웨어 | (오픈 소스) | http://qiime.org | 버전 1.8.0 |
| 퀀터스 형광 분광기 | 프로메가 | E6150 | |
| 쿼빗 4.0 형광 분광기 | 인비트로겐 | Q33226 | |
| SDS(소듐 도데실 설페이트) | (일반) | 해당 없음 | |
| UPARSE 소프트웨어 | (오픈 소스) | http://drive5.com/uparse | 버전 7.0.1090 |
| VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI V2 | 바자임 | NDM627-01 |