유전자 전달 증진을 위한 간엽 줄기세포 막 감싸 나노소포 개발

요약

이 프로토콜은 유전자 치료를 위한 중간엽 줄기세포(MSC) 유래 세포외 소포 생체 모방제를 생산 및 정제하는 방법을 도입하는 것을 목표로 합니다. 나노소포는 MSC 유래 지질 이중층으로 제한되어 있으며, 관심 유전자를 가진 재조합 AAV를 내강에 캡슐화합니다. 이 나노소포는 생체 내 유전자 전달을 위한 향상된 벡터를 제공합니다.

초록

간엽 줄기세포(MSC) 유래 세포외 소포(EV)는 치료적 응용과 재생 의학에 큰 가능성을 지니고 있습니다. EV는 알려진 모든 세포 유형에서 분비되는 나노 규모 소포로, 막 고정 단백질, 용해성 인자, 여러 RNA 종, 그리고 수용 세포의 생리와 행동을 조절하는 대사산물 등 다양한 화물을 운반합니다. MSC에서 유래하거나 조작된 EV는 치료 단백질과 RNA를 전달할 수 있지만, DNA 서열을 소포로 분류하는 효율적인 메커니즘이 부족해 EV 매개 DNA 전달은 여전히 도전적입니다. 우리 그룹과 다른 연구자들의 이전 연구들은 아데노 관련 바이러스(AAV) 함유 EVs가 표적 핵전달과 시험 관 내외 내 지속적인 유전자 발현을 가능하게 한다는 것을 입증했습니다. 그러나 생산과 분리는 낮은 수확량과 시간 소모적인 절차로 인해 제한되어 왔습니다. 여기서는 효율적인 유전자 전달을 위한 크기 정의 압출법으로 생성된 MSC 막 포위 나노소포의 개발을 보고합니다. 이 소포들은 약 200nm 직경으로, 천연 EV의 특성을 모방하면서 치료용 유전자 서열을 가진 재조합 AAV 벡터를 캡슐화합니다. 기존 AAV와 비교했을 때, 설계된 MSC 소포는 유전자 전달 효율을 개선했고, 자연 분비된 EV-AAV에 비해 시간과 비용을 절감하며 훨씬 높은 수율을 달성했습니다. 요약하자면, 우리는 EV 모방 구조와 AAV 매개 유전자 전달의 장점을 결합한 새로운 MSC 기반 막 나노소포 플랫폼을 제시합니다. 이 접근법은 전달 효율성과 생산 확장성을 높여 유전자 치료를 임상 번역으로 발전시키는 유망한 전략을 제시합니다.

서론

유전자 치료는 특정 유전자를 도입, 대체 또는 침묵시켜 정상적인 세포 기능을 회복함으로써 유전 및 후천성 질환을 치료하는 혁신적인 접근법을 제시합니다. 지난 20년간 벡터 공학과 전달 전략의 발전은 유전자 치료의 치료 영역을 크게 확장시켰습니다. 개발된 다양한 벡터 시스템 중에서, 아데노 관련 바이러스(AAV)는 유리한 안전성 프로필, 효율적인 전도, 분열 세포 및 비분열 세포 모두에서 장기 유전자 발현 덕분에 가장 성공적이고 널리 채택된 플랫폼 중 하나로 떠올랐습니다 ^1,2. 현재까지 여러 AAV 기반 치료제가 임상 사용 규제 승인을 받았으며, 척수성 근위축증, 망막 이영양증, 혈우병 치료제에 대한 연구를 포함해 중개 의학 분야에서 중요한 이정표를 세웠^습니다. AAV 벡터의 광범위한 친대성과 낮은 면역원성 덕분에 간, 근육, 중추신경계^{, 눈 등} 다양한 조직에 적용될 수 있게 되었습니다. 그 결과, AAV는 대사, 신경학, 심혈관 질환을 대상으로 한 전임상 및 임상 연구를 지원하는 생체 내 유전자 전달의 선도적 플랫폼이 되었습니다.

놀라운 임상적 성공에도 불구하고, AAV 기반 유전자 치료는 여전히 광범위한 적용을 제한하는 여러 내재적 도전에 직면해 있습니다. 주요 제약 요인 중 하나는 AAV 캡시드의 제한된 유전체 패키징 용량(~4.7 kb)으로, 이는 큰 유전자나 다중 치료 유전자 전달에 제한을 준다 ^5,6. 또한 AAV 매개체의 생물 분포와 세포 친성은 주로 혈청형에 의해 결정되며, 각 매개체는 특정 조직에 대한 뚜렷한 친화성을 보입니다. 조직 표적 및 전도 효율을 높이기 위해 광범위한 캡시드 공학과 펩타이드 표현 전략이 사용되었음에도 불구하고, 다양한 생물학적 맥락에서 정밀하고 예측 가능한 친대성을 달성하는 것은 여전히 중요한 난관이다⁷. 또 다른 중요한 한계는 인간 집단 내에서 자연 AAV 혈청형에 대한 기존 중화 항체(NAbs)의 유병률입니다. NAbs의 낮은 역가도 벡터 전개 효율을 크게 저하시켜 환자 적합성을 제한하고 반복 투여를 복잡하게 만들 수 있습니다 ^8,9. 합리적인 캡시드 재설계, 면역억제 요법, 일시적 혈장 교환 등 다양한 전략이 항체 매개 중^{화를 완화}하기 위해 연구^되었으나, 이러한 접근법들은 부분적이거나 일시적인 완화만을 제공합니다. 이러한 한계는 임상 환경에서 AAV 매개 유전자 전달의 전반적인 치료 효능과 재현성을 감소시킵니다.

최근 몇 년간, 세포외 소포 외 AAV(EV-AAV)가 기존 AAV의 여러 주요 한계를 극복할 잠재력을 가진 대체 벡터로 탐구되고 ^{있습니다.} 벡터 포장 과정에서 일부 AAV 입자가 소포 수송 경로를 통해 분비되어 세포외 소포에 갇힐 수 있습니다. 이 과정은 바이러스 배출을 촉진하고 막 결합을 촉진하는 AAV 암호화 막 관련 보조 단백질(MAAP)과 관련된 것으로 여겨집니다^16,17. 결과적으로 생성된 EV-AAV 입자는 기존의 AAV에 비해 전도 효율이 개선되고 중화 항체에 대한 저항성이 향상되었는데, 이는 주로 세포 흡수를 촉진하고 항체 인식으로부터 부분적으로 차폐하는 소포막 덕분이다¹⁸. 하지만 이러한 장점에도 불구하고 EV-AAV 생산은 여전히 비효율적입니다. 일반적으로 벡터 게놈 중 약 0.5%-12%만이 EV 관련 AAV로 배양 배지에 분비되며, 대부분은 세포 내에 남아 있거나 자유 AAV로 존재합니다^12,13. 따라서 충분한 벡터 수율을 얻기 위해서는 대규모 생산이 필요합니다. 더불어, EV-AAV 생성은 주로 HEK293T 생산자 세포를 사용하여 입증되었으며, 이 세포의 EV는 빠른 간 정리, 짧은 순환 반감기, 그리고 잠재적인 생물학적 안전성 문제를 보일 수 있습니다. 이러한 한계는 보다 효율적이고 맞춤화 가능한 막 포폐 전략의 필요성을 강조하며, 본 연구에서 제시된 세포막 포위 AAV(CME-AAV) 플랫폼의 개발을 촉진합니다.

간엽 줄기세포(MSC)와 그 EVs는 재생 가능성과 면역 회피 특성에 대해 광범위하게 연구되어 왔습니다. 세포나 자연 분비 EV를 기반으로 한 치료법을 넘어, 최근 연구들은 MSC 막으로 덮인 나노입자를 이용한 약물 전달 향상을 위한 대안적 접근법을 입증했습니다^{19, 20, 21}. MSC 막 코팅은 능동적 표적 기능을 부여하고, 면역 클리어를 줄이며, 순환 시간을 연장하는데, 이 효과는 MSC 유래 막의 내재적 분자 조성 때문인 것으로 보인다^22,23. 이 개념을 바탕으로 MSC 유래 막 재료를 이용해 세포막 포위 AAV(CME-AAV) 나노소포를 유전자 전달에 사용하였습니다. 이를 위해 정제된 MSC 막 조각을 재조합 AAV 입자와 혼합하여 통제된 압출 공정에 적용하였는데, 이 기술은 원래 리포좀 제조를 위해 확립된 기술이다^24,25. 크기 정의 압출을 통해 막 구성 요소들이 자발적으로 조립되어 나노스케일 소포로 형성되어 AAV 입자를 캡슐화합니다. 생성된 CME-AAV는 밀도 구배 기반 원심분리를 통해 자유 캡슐화되지 않은 AAV에서 추가로 정제되었습니다. 이 전략은 막 외피 기반 AAV 벡터의 효율적이고 재현 가능한 준비를 가능하게 하며, 기존 AAV에 비해 전도 효율이 현저히 향상되고 EV-AAV와 유사한 중화 항체 저항성을 유지합니다. 서로 다른 형질전환유전자를 대체함으로써 CME-AAV 플랫폼은 다양한 유전 및 후천성 질환 치료에 폭넓은 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 중국 주하이에 위치한 베이징사범대학교의 기관 동물 관리 및 이용 위원회에서 승인받았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 공극 크기 결정 압출 을 통한 CME-AAV의 준비 및 형성

1. 재조합 AAV 벡터 생산
   참고: AAV 생산 프로토콜은 이전에 발표되고 널리 사용된 절차를 따릅니다. 상세한 최적화 단계와 변형은 이전 연구들에서 기술된 바 있습니다 ^12,26.
   1. 세포를 완전한 배지 HEK293T 배양하여 형질전환 당일에 세포를 70%-80% 합류도로 유지합니다.
   2. (i) 관심 형도유전자를 운반하는 AAV 전달 벡터, (ii) 원하는 혈청형에 대응하는 AAV rep/cap 유전자, (iii) 아데노바이러스 보조 기능을 암호화하는 세 가지 플라스미드를 준비합니다.
   3. 표준 실험실 관행에 따라 확립된 형질전환법(예: 인산칼슘 또는 폴리머 기반 형질염)을 사용하여 세 플라스미드와 HEK293T세포를 공동 트랜스펙트합니다.
   4. 형질전환 세포를 48-72시간 배양하여 AAV 조립 및 축적을 가능하게 합니다.
   5. 세포와 배양지를 수집하고, 반복적인 동결-해동 사이클 또는 동등한 세포 용해 방법으로 AAV 입자를 방출합니다.
   6. 용해액을 저속으로 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고 AAV 입자가 포함된 상청액을 수집합니다.
   7. 밀도 구배 초원심분리 또는 다른 확립된 정제 방법을 사용하여 AAV 입자를 정제합니다.
   8. 정제된 AAV 벡터를 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 교환하고, −80 °C에서 저장하여 사용 전까지 보관합니다.
2. MSC 막 분획의 준비
   참고: 인간 중간엽 줄기세포(MSC)는 기관 지침을 준수하여 분리되었습니다. 세포들은 확립된 조건이나 실험실에서 수정된 프로토콜 하에 배양 및 증식되었습니다. MSC 정체는 CD73, CD90, CD105와 같은 표현형 표지자의 발현을 유세포분석을 통해 확인할 수 있습니다. MSC의 다능성은 시험관 내에서 골아세포, 연골세포, 지방세포로 분화하는 능력으로 검증됩니다. 세포가 70%에서 90% 정도 합합에 도달하면 수집 준비가 완료됩니다. 다음 절차들은 반드시 멸균 환경에서 시행되어야 하는 것은 아닙니다.
   1. 배양지를 제거하고 세포 스크레이퍼를 사용해 배양 접시에서 MSC를 분리하세요.
   2. 분리된 세포를 PBS가 담긴 원뿔형 튜브에 모아 300 × g에서 4°C에서 5 분간 원 심분리하여 세포에 펠릿을 넣습니다.
   3. 셀을 PBS로 두 번 세척하고, 매번 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
   4. 최종 세포 펠릿을 PBS에 재현탁시키고 프로테아제 억제제 혼합물을 보완합니다.
   5. 세포 현탁을 세 번의 동결-해동 사이클에 가해 원형질막을 파괴하고 조잡한 세포 용해액을 생성한다.
   6. 용해액을 피펫으로 완전히 피펫화하여 균질 처리한 후, 1,000 × g 에서 4 °C에서 20분간 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다.
   7. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 18,000 × g 의 원심분리기를 4 °C에서 1시간 동안 투여하여 막 분획을 알렛으로 만듭니다.
   8. 상청액을 버리고 생성된 막 펠릿을 PBS에 재현탁합니다. 이 현탁은 조잡한 MSC 막 분획을 나타내며 AAV 캡슐화에 사용됩니다.
   9. 막 현탁액을 20G에서 27G의 바늘이 장착된 주사기를 차례적으로 통과시켜 균질화합니다.
   10. BCA 분석을 사용하여 균질화된 막 현탁액의 단백질 농도를 측정합니다. 현탁액을 −80 °C에서 분리하여 보관하거나, 다음 단계로 바로 진행하세요. 해동 사이클마다 27G 주사기로 막 현탁액을 다시 균질화합니다.
3. 압출 을 통한 CME-AAV 형성
   1. 준비된 막 현탁액을 AAV와 혼합하여 AAV 1× 10^{10개의 10} 게놈 복사본(g.c.)당 150 μg 막 단백질을 혼합합니다. 혼합물을 37°C에서 30분간 부드럽게 흔들며 부양하세요.
   2. 멤브레인-AAV 혼합물을 400nm 폴리카보네이트(PC) 멤브레인이 장착된 미니 익스트루더에 적재합니다. 샘플을 익스트루더에 20회 통과시켜 막-AAV 캡슐화를 촉진합니다.
   3. 400nm PC 막을 200nm 막으로 교체하고 압출 과정을 20번 반복하여 소포 크기 이질성을 더욱 줄입니다.
   4. 가공된 혼합물을 모으세요. 더 많은 양이 필요하다면 여러 배치의 압출 배치를 풀어주세요. 결과적으로 현탁액에는 CME-AAVs와 함께 캡슐화되지 않은 AAV와 빈 막 소포가 포함되어 있습니다. 즉시 CME-AAV 정화로 진행하세요.

2. 밀도 구배 원심분리를 통한 CME-AAV 정제

참고: 이 단계는 아이오딕사놀 기반 밀도 구배 초원심분리를 사용하여 캡슐화되지 않은 AAVs, 단백질 집합체, 잔류 핵산에서 순수 CME-AAV를 분리하는 과정을 설명합니다. 이 단계에서 얻은 정제된 CME-AAV는 시험관 내 및 생체 내 연구 모두에 적합합니다. 모든 시술은 멸균 조직 배양 후드 하에서 시행하는 것이 권장됩니다.

1. 아이오딕사놀 구배 제제
   1. 40% 및 25% 아이오딕사놀 용액을 10× PBS와 멸균 탈이온수로 희석하여 최종 농도인 1× PBS로 만듭니다.
   2. 13.2 mL 열린 상단 얇은 벽 초투명 튜브에서, 아래쪽에서 40% 아이오딕사놀 1 mL와 25% 아이오딕사놀 3 mL를 밑에 깔아 불연속적인 밀도 구배를 신중하게 설정합니다.
   3. 1.14단계에서 얻은 CME-AAV 함유액 7mL를 부드럽게 구배 상단에 덮어줍니다. 튜브를 균형 있게 배치한 후 스윙 버킷 초원심분리기 로터에 넣으세요.
2. 초원심분리 및 CME-AAV 분획 수집
   1. 150,000 g × 4°C에서 3시간 동안 빠른 가속과 느린 감속(각각 9단계와 1단계)을 원심분리합니다.
   2. 기울기를 방해하지 않고 로터에서 튜브를 조심스럽게 제거하세요. 튜브의 위에서 아래까지 1mL 분획을 라벨이 붙은 1.5 mL 마이크로 원심분리관(F1-F11)에 모으세요. 모든 분수는 얼음 보관하세요.
   3. 정제된 CME-AAV를 포함한 F7과 F8 분획을 식별하여 새로운 개방형 초원심분리관에 모으세요. PBS를 총 11mL에 첨가하고 1mL 피펫으로 부드럽게 섞으세요.
3. CME-AAV의 세척 및 회수
   1. 150,0×00 g 에서 4 °C에서 빠른 가속과 빠른 감속(두 설정 모두 9단계)을 사용하여 3시간 동안 원심분리하여 모은 분획을 다시 원심분리합니다.
   2. 상청액을 조심스럽게 버리고 CME-AAV 펠릿을 원하는 농도에 따라 50-200 μL 무균 PBS에 재현탁하세요.
   3. 필요에 따라 알리코트를 넣고 −80°C에서 보관하여 추가 사용 후까지 보관합니다.

3. 투과 전자현미경(TEM)을 이용한 CME-AAV의 특성 분석

참고: 투과 전자현미경(TEM)은 CME-AAV 입자의 형태, 크기 및 막 구조를 시각화하는 데 사용됩니다. 이 절차는 세포외 소포에 사용되는 것과 유사한 표준 음성 염색 프로토콜을 따릅니다. 모든 단계는 별도 언급이 없는 한 실온에서 수행됩니다.

1. 샘플 준비 및 고정
   1. 2단계에서 얻은 정제된 CME-AAV 현탁액을 약 1 ×^{10 9-1} × 10¹⁰ 입자/mL 농도로 희석하여 PBS에 넣습니다.
   2. 샘플을 같은 부피로 신선하게 준비한 4% 파라포름알데히드(최종 농도 2%)를 추가하고 상온에서 30분간 배양하여 고정합니다.
   3. Formvar/탄소 코팅 구리 격자(200메쉬)를 파라핀 필름 위에 탄소 면이 위로 올려놓습니다.
   4. 고정된 CME-AAV 현탁액 10 μL 피펫을 그리드에 옮기고 상온에서 30분간 흡착할 수 있도록 합니다. 흡착 중에는 건조를 피하세요.
   5. 필터 페이퍼로 격자 가장자리의 과잉 액체를 중앙에 닿지 않고 부드럽게 제거하세요.
2. 세척 및 고정 후
   1. 그리드를 샘플 면이 아래쪽으로 향하게 하여 50 μL PBS 방울 위에 2분간 떠서 세척합니다. 두 번 반복하세요.
   2. 격자를 50 μL 떨어진 1% 글루타알데히드 방울 위에 5분간 옮겨 막 구조를 안정화합니다.
   3. 격자를 순차적으로 5번 세척하여 완충염을 제거하세요. 마지막 세척 후에는 부드럽게 물려 두세요.
3. 음성 염색
   1. 그리드를 2% 수용성 우라닐 아세테이트 50 μL 방울 위에 1분간 올려 음 염색을 만듭니다.
   2. 과잉 얼룩을 필터 페이퍼로 격자 가장자리를 살짝 만지고 실온에서 완전히 자연 건조시키세요.
4. 영상
   1. 200kV에서 작동하는 투과 전자현미경을 사용해 착색된 그리드를 조사합니다.
   2. CME-AAV의 형태와 막의 완전성을 평가하기 위해 30,000×에서 120,000× 배율로 대표적인 이미지를 촬영합니다.
   3. 선택적으로 TEM 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 입자 직경을 측정하여 소포 크기와 NTA 결과의 일치를 확인할 수 있습니다.
      참고: 샘플 농도 - 중간 정도의 입자 밀도를 얻기 위해 CME-AAV 농도를 조정하세요; 과도하게 농축된 샘플은 입자 겹침을 일으키고, 과도하게 희석된 샘플은 검출 가능한 소포가 거의 없습니다. 아티팩트 방지 - 세척이 불완전하면 소금 결정이 남아 입자 시각화를 흐릴 수 있습니다. 염색 시 격자가 수분을 유지하여 막 붕괴를 방지하세요. 대체 염색 - 방사성 취급 제한이 적용될 경우 인산화(PTA, 1%-2%, pH 7.0)가 우라닐 아세테이트의 대체제로 사용될 수 있습니다. 보관 - 준비된 그리드는 상온에서 먼지 없는 용기에 며칠간 보관할 수 있으나, 최상의 대비를 위해 즉시 관찰하는 것이 권장됩니다.

4. qPCR을 이용한 CME-AAV의 정량

참고: 이 단계는 CME-AAV 게놈 복사본(g.c./μL)을 정량화하는 qPCR 기반 방법을 설명합니다. 프로토콜은 CME-AAV에 특화된 샘플 준비와 데이터 보고를 강조합니다. qPCR 설치 및 사이클링의 다른 모든 측면은 표준 실험실 절차와 선택한 qPCR 키트에 대한 제조사 지침을 따라야 합니다.

1. 샘플 및 표준 제제
   1. 정제된 CME-AAV 알리코트를 얼음 위에 녹이고 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 소용돌이를 피하세요.
   2. 뉴클레아제가 없는 탈이온수 또는 TE 버퍼를 사용하여 순차적으로 10배 희석하여 AAV 표준 희석액을 1× 10⁶에서 1 × 10³³ g.c./μL로 준비합니다. 단기 사용을 위해 신선하거나 알리코트(알리코트)로 준비하여 −20 °C에서 보관하세요.
   3. 다음 대조군을 준비하세요: 무템플릿 대조군(NTC; 물), 음성 대조군(PBS 또는 빈 행렬), 그리고 양성 대조군(알려진 농도의 AAV 샘플)이 가능하다면 가능합니다.
   4. 제조사의 지침에 따라 선택한 화학 성분(염료 또는 프로브 기반)에 따라 qPCR 마스터 믹스를 얼음에서 준비하세요.
2. qPCR 사이클링 및 데이터 분석
   1. qPCR 마스터 믹스 제조사에서 권장하는 사이클링 매개변수에 따라 qPCR을 돌리세요.
   2. 표준 곡선을 C_t (y축)와 log₁₀(표준 농도(g.c./μL 단위)(x축)을 그려 생성합니다. 기울기(m)와 y-절개(b)를 얻기 위해 선형 회귀를 적합한다.
   3. 회귀 방정식을 사용하여 각 샘플 복제에 대한 CME-AAV 게놈 농도를 계산합니다:
      또는
      
      여기서 C는 μL당 유전체 복사본입니다.
   4. 평균 기술적 복제 결과와 최종 CME-AAV 농도는 g.c./μL로 보고됩니다.
      참고: qPCR 준비 중 열 변성은 포위막과 AAV 캡시드 모두를 파괴하므로 별도의 DNA 추출이 필요하지 않습니다. 열분해 전에 샘플에 대해 DNase 처리를 하지 마십시오; DNase는 캡시드/막이 파괴되면, 샘플이 DNase를 비활성화하는 온도에 도달하기 전에 AAV 게놈에 접근하여 분해할 수 있습니다. 표준은 가능한 경우 일치해야 합니다: 잘 특성화된 AAV 표준에서 표준 곡선을 준비하세요. 샘플이나 표준이 유전체 구성(단가선 AAV와 자가상보/이중 가닥 AAV)이 다르다면, 보고된 값을 적절히 조정하세요. 프라이머/프로브 설계: 프라이머는 보존된 AAV 서열을 표적으로 삼을 수 있습니다; 예를 들어, CMV 프로모터(형질전환유전자 상류)를 표적으로 하는 프라이머가 흔히 사용됩니다.

5. CME-AAV 입자 프로파일의 정량화

1. 나노입자 추적 분석(NTA), 가율 저항 펄스 감지(TRPS) 또는 유사한 입자 분석 기법을 사용하여 CME-AAV 제제의 크기 분포와 입자 농도를 결정합니다.
2. CME-AAV 샘플을 얼음 위에서 정제한 후 피펫팅으로 부드럽게 균질화하여 분석합니다. 표준 실험실 관행과 제조사의 선택 기기 지침에 따라 측정을 수행하며, 이는 이전에 발표된 프로토콜^{12, 27, 28, 29}에 명시되어 있습니다.

6. CME-AAV 매개 유전자 전달의 시험관 내 분석

참고: 이 단계는 배양된 세포에서 CME-AAV 매개 유전자 전달 및 형질전환유전자 발현을 평가하는 절차를 설명합니다. 이 분석은 HEK293T 세포와 CME-AAV9를 사용하여 입증되었습니다. EGFP이지만, 다른 세포 유형이나 리포터 구조체에도 적응할 수 있습니다. 일반적인(비막 외피) AAV9. EGFP는 양성 대조군으로, PBS 또는 빈 AAV 입자는 음성 대조군으로 사용됩니다.

1. 세포 준비
   1. 표준 조건(DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 포함)에서 37°C, 5% CO₂에서 세포를 배양HEK293T합니다.
   2. 세포를 48웰 또는 96웰 플레이트에 파종하여 전이 시점(일반적으로 파종 후 24시간 시점)에 약 70%의 합류율을 달성합니다. 시딩 밀도는 웰 크기에 따라 조절하세요(예: 48웰 플레이트의 경우 10⁴ 셀당 ~5 ×, 96웰 플레이트의 경우 10⁴ 셀당 ~1 ×).
   3. 벡터를 추가하기 전에 세포가 부착되고 평형을 맞춘 후 24시간 동안 기다려야 합니다.
2. 벡터 적용
   1. CME-AAV9 준비하세요. EGFP와 AAV9. 멸균 PBS에서 작동하는 EGFP 솔루션. 일반적인 바이러스 용량: 48웰당 5× 10⁸ g.c. (프로모터 강도, 표적 유전자 및 실험 목적에 따라 조정).
   2. 각 웰마다 동일한 유전체 복사본(g.c.)을 CME-AAV9 수에 추가합니다. EGFP나 AAV9 중 하나 하세요. EGFP는 배양지에 직접 전달됩니다.
   3. PBS 또는 빈 AAV 입자가 동등한 부피를 가진 음성 대조 우물을 포함하세요.
   4. 플레이트를 부드럽게 돌려 균일하게 분포한 후 인큐베이터로 돌려주세요.
   5. 프로모터 활성과 형질전환 발현 반응 역학에 따라 24-72시간 동안 인큐베이션을 계속하세요. HEK293T 세포에서 CMV 유도 EGFP의 경우, 강한 형광이 일반적으로 48시간 이내에 관찰됩니다.
3. 영상 및 생세포 분석
   1. 영상 촬영 준비가 되면 배양지를 부드럽게 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척하여 결합하지 않은 입자를 제거합니다. 세포를 이탈시키는 것을 피하세요.
   2. 제조사 지침에 따라 Hoechst 33342(생세포 호환)로 염색 세포 핵을 검사합니다. 생세포에는 DAPI를 사용하지 마세요.
   3. 적절한 필터가 장착된 역형 형광 현미경을 사용하여 라이브 셀 형광 영상을 수행합니다(예: EGFP의 경우 여기 488 nm/방출 513 nm; Hoechst의 경우 여기 350 nm/방출 460 nm).
   4. 전도 효율 정량화에는 10× 또는 20× 대물을, 필요하다면 고해상도 세포 위치 파악을 위해 63× 대물렌즈를 사용하세요.
   5. 동일한 영상 매개변수(노출 시간, 게인, 조리개 등)를 사용하여 웰당 최소 다섯 개의 시야각(예: 네 모서리와 한 개의 중앙)을 획득하세요.
   6. 정량적 분석을 위해 모든 이미지를 RAW와 그레이스케일 형식으로 저장하세요.
4. 정량적 이미지 분석
   1. 이미지를 ImageJ(FIJI) 또는 이에 상응하는 소프트웨어로 엽니다.
   2. 각 필드별로 EGFP 채널과 Hoechst 채널의 평균 형광 강도를 측정합니다.
   3. 형광 신호가 없는 영역을 선택하고 픽셀 값을 평균하여 배경 강도를 결정합니다.
   4. 각 채널에 대한 보정 강도를 계산하기:
      _{제가 정정했어요} = 제_말은, -_{I 배경}
   5. 각 필드에 대해 정규화된 강도를 다음과 같이 계산합니다:
      
   6. 각 우물당 최소 다섯 개 필드의 평균 정규화된 강도를 보고하고, 세 개의 독립적인 생물학적 복제 간 평균 ± SD를 보고합니다.
      참고: CME-AAV는 동일한 유전체 복사본을 적용할 때 기존 AAV에 비해 형광 강도가 증가하는 경향이 나타나며, 이는 세포 흡수 개선 및/또는 중화 항체로부터의 보호 효과를 반영합니다. 최적의 전도체 효율은 CME-AAV 제제 품질, 세포 유형, 프로모터 강도, 바이러스 역가에 따라 달라집니다. 약한 신호가 관찰되면 유전체 복사 입력을 늘리고, qPCR로 벡터 무결성을 확인하며, 현미경 보정을 검증합니다. 실험적 필요에 따라 다른 형광 리포터(예: mCherry, mNeonGreen, tdTomato)나 루시퍼레이스 구성체도 사용될 수 있습니다. 1차 또는 비부착 세포를 다룰 때는 시딩과 영상 조건을 조정하세요(예: 폴리-L-라이신 코팅 또는 챔버 슬라이드 사용).

7. 마우스 모델에서 매개 유전자 전달 - CME-AAV 평가

참고: 이 단계는 마우스 모델을 사용하여 생 체 내에서 CME-AAV 매개 유전자 전달을 평가하는 내용을 설명합니다.

1. 동물 조리
   1. C57BL/6 같은 야생형 마우스를 사용하세요. 모든 동물 시술이 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받고 관련 규정에 따라 수행되도록 하십시오.
   2. 실험 간 최적의 일관성을 위해 4-6주 된 쥐를 선별하였습니다.
   3. 주사 전에 동물을 표준 사육 조건 내에서 유지하며, 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하세요.
2. 벡터 준비 및 투여
   1. 연구 목적과 목표 조직에 따라 AAV 혈청형을 선택하세요. 본 연구에서는 AAV9와 CME-AAV9가 사용되었습니다.
   2. 비침습적 영상 촬영을 위해 루시퍼레이스 리포터 유전자(예: CME-AAV9.루시페라제)를 암호화하는 바이러스 벡터를 준비합니다.
   3. 바이러스 벡터를 멸균 식염수에 희석하여 각 마우스당 50 μL당 1× 10¹° 게놈 복사본(g.c.)의 최종 농도로 만듭니다.
   4. 주사 전에 온열 패드나 따뜻한 물로 꼬리를 부드럽게 데워 정맥을 확장하세요.
   5. 31G 인슐린 주사기에 50 μL의 바이러스 현탁액을 주입한 후 측측 꼬리정맥에 천천히 주입하여 누출과 정맥 파열을 최소화합니다.
   6. 주사 후에는 쥐를 다시 우리로 돌려보내고 완전히 회복될 때까지 관찰하세요.
3. 생체 내 생물발광 영상
   1. 투여 후 2주 후, 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 이소플루란으로 쥐를 마취하고 D-루시페린(150 μg/g 체중; 시그마) 복강 내 PBS에서 투여됩니다.
   2. 마취된 쥐를 생물발광 영상 시스템에 넣습니다.
   3. 주입 후 2분마다 발광 이미지를 획득하여 신호가 정체에 도달할 때까지 확인하세요.
   4. 적절한 소프트웨어를 사용해 생물발광을 정량화하세요. 발광 영역 주변에 관심 영역(ROI)을 정의하고 각 동물의 총 광자 플럭스(광자/초)를 계산하세요.
   5. AAV9.luc 처리군과 PBS 주입군을 각각 양성 및 음성 대조군으로 포함하여 비교를 위함.
4. 체외 영상
   참고: 이 단계는 선택 사항입니다.
   1. 생체 영상 촬영 직후 쥐를 안락사시키고 간, 심장, 비장, 신장, 뇌 등 주요 장기를 채취합니다.
   2. 동일한 영상 매개변수 하에 동일한 IVIS 시스템을 사용하여 조직 특이적 루시퍼라제 발현을 측정합니다.
      참고: 실험 목표에 따라 근육 주사, 뇌 주사, 복막 내 주사와 같은 대체 투여 경로가 채택될 수 있습니다. 생물발광 강도는 유전자 전달 효율성과 조직 생물 분포를 모두 반영합니다. CME-AAV 매개 루시퍼라제는 세포를 흡수하는 막 매개 엔도사이토시스 때문에 일반적으로 자유 AAV에 비해 더 일찍 시작되고 최고 발현이 증가하는 경우가 많습니다. 정확한 비교를 위해 샘플별로 루시페린 용량, 타이밍, 영상 설정을 일관되게 유지하세요. 설명된 바이러스 용량(마우스당 1× 10¹° g.c.)은 일반적으로 주입 후 2-4주 이내에 감지 가능한 신호를 제공하지만, 벡터나 동물 모델에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.

결과

본 연구에 사용된 MSC는 관련 윤리 지침에 따른 프로토콜에 따라 인간 탯줄 조직에서 분리되었습니다. MSC 막 분획은 설명된 프로토콜에 따라 준비되었습니다. AAV9. EGFP는 이전에 보고된^{12,26 12,26} HEK293T 세포에서 일시적 이중 플라스미드 트랜스펙션 시스템을 사용하여 자체 생산되었습니다. CME-AAV 제조, 막 준비, AAV9를 위한 것입니다. EGFP는 프로토콜에 명시된 대로 1× 10¹° 바이러스 게놈당 막 단백질 150 μg 비율로 공동 배큐팅되었습니다. 혼합물의 1밀리리터를 400nm 폴리카보네이트 다공성 막이 장착된 미니 익스트루더에 넣어 20회 압출한 후, 200nm 멤브레인을 20회 더 통과시켰습니다. 이 과정에서 MSC 막 포위가 형성된 AAV9가 생성되었습니다. EGFP (CME-AAV9. EGFP).

토론

CME-AAV 프로토콜의 핵심 단계

이 프로토콜은 MSC 막 포위 AAV를 생성하는 방법을 설명하며, 성공적인 CME-AAV 형성을 위해 여러 단계가 중요합니다. 첫째, 세포막의 신중한 전처리가 필수적입니다. 이 단계의 목표는 핵 DNA, 세포질 단백질, 세포 내 소기관으로부터 오염을 최소화하면서 압출에 적합한 막 조각을 얻는 것입니다. 또한, 막 조각의 크기는 압출 효율을 결정하는 주요 요인입니다. 너무 큰 조각은 폴리카보네이트 압출막을 막을 수 있으며, 과도하게 파괴된 막 재료는 압출 유발 변형 하에서 안정적인 나노소포로 재조립하는 데 비효율적일 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 원심력이 증가하는 순차적인 원심분리 단계를 사용하여 비막 성분을 제거하고, 이어서 주사기 기반의 균질화를 통해 적절하고 재현 가능한 크기 분포의 막 조각을 생성합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
발광 이미징 시스템	PerkinElmer	IVIS Spectrum 광학 이미징 시스템 (Lumina III)
D-루시페린 칼륨염	Yeasen Biotechnology	40902ES03
태아 소 혈청	Yeasen Biotechnology	40130ES76
형광 현미경	Zeiss	Axio Observer 7
Formvar/탄소 코팅 구리 그리드 200 메시	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
글루타르알데히드	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
고 포도당 Dulbecco의 수정된 이글의 배지	Hyclone	SH30243
고속 원심분리기	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
NTA 기기	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
초원심분리기용 개방형 얇은 벽 초투명 튜브	Beckman Coulter	344059
OptiPrep 이오딱솔	Millipore-Sigma	D1556
파라포름알데히드 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
페니실린-스트렙토마이신	Millipore-Sigma	V900929
qPCR 기기	Applied Biosystems	QS6 실시간 PCR 시스템
고속 원심분리기용 로터	Beckman Coulter	JA-25.50
초원심분리기용 SW 41 Ti 스윙 버킷 로터	Beckman Coulter	331362
투시 전자 현미경	JEOL	JEM-2100F
초원심분리기	Beckman Coulter	Optima XE-100
우라닐 아세테이트	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Whatman Nuclepore 폴리카보네이트 멤브레인 필터 (200 nm)	Cytiva	10417004
Whatman Nuclepore 폴리카보네이트 멤브레인 필터 (400 nm)	Cytiva	10417104