이 프로토콜은 유전자 치료를 위한 중간엽 줄기세포(MSC) 유래 세포외 소포 생체 모방제를 생산 및 정제하는 방법을 도입하는 것을 목표로 합니다. 나노소포는 MSC 유래 지질 이중층으로 제한되어 있으며, 관심 유전자를 가진 재조합 AAV를 내강에 캡슐화합니다. 이 나노소포는 생체 내 유전자 전달을 위한 향상된 벡터를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
간엽 줄기세포(MSC) 유래 세포외 소포(EV)는 치료적 응용과 재생 의학에 큰 가능성을 지니고 있습니다. EV는 알려진 모든 세포 유형에서 분비되는 나노 규모 소포로, 막 고정 단백질, 용해성 인자, 여러 RNA 종, 그리고 수용 세포의 생리와 행동을 조절하는 대사산물 등 다양한 화물을 운반합니다. MSC에서 유래하거나 조작된 EV는 치료 단백질과 RNA를 전달할 수 있지만, DNA 서열을 소포로 분류하는 효율적인 메커니즘이 부족해 EV 매개 DNA 전달은 여전히 도전적입니다. 우리 그룹과 다른 연구자들의 이전 연구들은 아데노 관련 바이러스(AAV) 함유 EVs가 표적 핵전달과 시험 관 내외 내 지속적인 유전자 발현을 가능하게 한다는 것을 입증했습니다. 그러나 생산과 분리는 낮은 수확량과 시간 소모적인 절차로 인해 제한되어 왔습니다. 여기서는 효율적인 유전자 전달을 위한 크기 정의 압출법으로 생성된 MSC 막 포위 나노소포의 개발을 보고합니다. 이 소포들은 약 200nm 직경으로, 천연 EV의 특성을 모방하면서 치료용 유전자 서열을 가진 재조합 AAV 벡터를 캡슐화합니다. 기존 AAV와 비교했을 때, 설계된 MSC 소포는 유전자 전달 효율을 개선했고, 자연 분비된 EV-AAV에 비해 시간과 비용을 절감하며 훨씬 높은 수율을 달성했습니다. 요약하자면, 우리는 EV 모방 구조와 AAV 매개 유전자 전달의 장점을 결합한 새로운 MSC 기반 막 나노소포 플랫폼을 제시합니다. 이 접근법은 전달 효율성과 생산 확장성을 높여 유전자 치료를 임상 번역으로 발전시키는 유망한 전략을 제시합니다.
서론
유전자 치료는 특정 유전자를 도입, 대체 또는 침묵시켜 정상적인 세포 기능을 회복함으로써 유전 및 후천성 질환을 치료하는 혁신적인 접근법을 제시합니다. 지난 20년간 벡터 공학과 전달 전략의 발전은 유전자 치료의 치료 영역을 크게 확장시켰습니다. 개발된 다양한 벡터 시스템 중에서, 아데노 관련 바이러스(AAV)는 유리한 안전성 프로필, 효율적인 전도, 분열 세포 및 비분열 세포 모두에서 장기 유전자 발현 덕분에 가장 성공적이고 널리 채택된 플랫폼 중 하나로 떠올랐습니다 1,2. 현재까지 여러 AAV 기반 치료제가 임상 사용 규제 승인을 받았으며, 척수성 근위축증, 망막 이영양증, 혈우병 치료제에 대한 연구를 포함해 중개 의학 분야에서 중요한 이정표를 세웠습니다. AAV 벡터의 광범위한 친대성과 낮은 면역원성 덕분에 간, 근육, 중추신경계, 눈 등 다양한 조직에 적용될 수 있게 되었습니다. 그 결과, AAV는 대사, 신경학, 심혈관 질환을 대상으로 한 전임상 및 임상 연구를 지원하는 생체 내 유전자 전달의 선도적 플랫폼이 되었습니....
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프로토콜
모든 동물 시술은 중국 주하이에 위치한 베이징사범대학교의 기관 동물 관리 및 이용 위원회에서 승인받았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 공극 크기 결정 압출 을 통한 CME-AAV의 준비 및 형성
- 재조합 AAV 벡터 생산
참고: AAV 생산 프로토콜은 이전에 발표되고 널리 사용된 절차를 따릅니다. 상세한 최적화 단계와 변형은 이전 연구들에서 기술된 바 있습니다 12,26.- 세포를 완전한 배지 HEK293T 배양하여 형질전환 당일에 세포를 70%-80% 합류도로 유지합니다.
- (i) 관심 형도유전자를 운반하는 AAV 전달 벡터, (ii) 원하는 혈청형에 대응하는 AAV rep/cap 유전자, (iii) 아데노바이러스 보조 기능을 암호화하는 세 가지 플라스미드를 준비합니다.
- 표준 실험실 관행에 따라 확립된 형질전환법(예: 인산칼슘 또는 폴리머 기반 형질염)을 사용하여 세 플라스미드와 HEK293T세포를 공동 트랜스펙트합니다.
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결과
본 연구에 사용된 MSC는 관련 윤리 지침에 따른 프로토콜에 따라 인간 탯줄 조직에서 분리되었습니다. MSC 막 분획은 설명된 프로토콜에 따라 준비되었습니다. AAV9. EGFP는 이전에 보고된12,26 12,26 HEK293T 세포에서 일시적 이중 플라스미드 트랜스펙션 시스템을 사용하여 자체 생산되었습니다. CME-AAV 제조, 막 준비, AAV9를 위한 것입니다. EGFP는 프로토콜에 명시된 대로 1× 10¹° 바이러스 게놈당 막 단백질 150 μg 비율로 공동 배큐팅되었습니다. 혼합물의 1밀리리터를 400nm 폴리카보네이트 다공성 막이 장착된 미니 익스트루더에 넣어 20회 압출한 후, 200nm 멤브레인을 20회 더 통과시켰습니다. 이 과정에서 MSC 막 포위가 형성된 AAV9가 생성되었습니다. EGFP (CME-AAV9. EGFP).
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토론
CME-AAV 프로토콜의 핵심 단계
이 프로토콜은 MSC 막 포위 AAV를 생성하는 방법을 설명하며, 성공적인 CME-AAV 형성을 위해 여러 단계가 중요합니다. 첫째, 세포막의 신중한 전처리가 필수적입니다. 이 단계의 목표는 핵 DNA, 세포질 단백질, 세포 내 소기관으로부터 오염을 최소화하면서 압출에 적합한 막 조각을 얻는 것입니다. 또한, 막 조각의 크기는 압출 효율을 결정하는 주요 요인입니다. 너무 큰 조각은 폴리카보네이트 압출막을 막을 수 있으며, 과도하게 파괴된 막 재료는 압출 유발 변형 하에서 안정적인 나노소포로 재조립하는 데 비효율적일 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 원심력이 증가하는 순차적인 원심분리 단계를 사용하여 비막 성분을 제거하고, 이어서 주사기 기반의 균질화를 통해 적절하고 재현 가능한 크기 분포의 막 조각을 생성합니다.
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공개 사항
다오핀 우 박사는 광둥 헝친 유나이티드 라이프 사이언스 유한회사의 직원입니다. 이 회사는 이 연구에 자금을 지원하지 않았으며, 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 원고 준비, 출판 결정에 관여하지 않았습니다. 나머지 저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
이 연구는 광둥성 과학기술프로그램(2023B0303010002)과 광둥기초응용연구재단(2025A1515011134), BNU 문리학부 교차 학제간 연구 프로젝트(12900-311324240581)의 지원을 받아 YL에 지원받았습니다. 이 연구는 베이징사범대학교 과학기술계측서비스센터에서 제공한 계측 및 기술 전문성의 지원으로 더욱 지원되었습니다.
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재료
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| 형광 현미경 | Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Formvar/탄소 코팅 구리 그리드 200 메시 | Millipore-Sigma | TEM-FCF400CU | |
| 글루타르알데히드 | Millipore-Sigma | 354400 | |
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| Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix | Yeasen Biotechnology | 11205ES08 | |
| 고 포도당 Dulbecco의 수정된 이글의 배지 | Hyclone | SH30243 | |
| 고속 원심분리기 | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Hoechst 33342 | Beyotime | C1022 | |
| NTA 기기 | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| 초원심분리기용 개방형 얇은 벽 초투명 튜브 | Beckman Coulter | 344059 | |
| OptiPrep 이오딱솔 | Millipore-Sigma | D1556 | |
| 파라포름알데히드 4% | Beyotime | P0099 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
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| Whatman Nuclepore 폴리카보네이트 멤브레인 필터 (200 nm) | Cytiva | 10417004 | |
| Whatman Nuclepore 폴리카보네이트 멤브레인 필터 (400 nm) | Cytiva | 10417104 |
참고문헌
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
- Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 21....
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재인쇄 및 허가
