방법 논문

수정된 Hulth 절차를 이용한 무릎 골관절염의 마우스 모델을 구축하는 외과적 방법

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DOI:

10.3791/70379

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2026년 5월 15일

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 수정된 Hulth 모델의 정교한 수술 단계를 개괄하며, 실험적 골관절염을 유도하는 표준화되고 재현 가능한 방법을 제공합니다.

초록

무릎 골관절염(KOA)은 관절 연골 퇴행, 연골하 뼈 재형성, 골 형성, 그리고 가장 흔한 골관절염 유형인 신경염을 특징으로 하는 만성 퇴행성 관절 질환입니다.

이 프로토콜은 수정된 Hulth 절차를 사용하여 무릎 골관절염의 마우스 모델을 구축하는 외과적 방법을 제시합니다. 내측 반월상 연골 불안정화(DMM) 및 전방 십자인대 절단(ACLT)과 같은 주사 유도 또는 기존 외과 모델과 비교할 때, 수정된 훌스 모델은 질병 발병을 조기에 유도하고 더 심각한 관절 염증을 유발합니다. 내측 측부 인대, 내측 반월상월판, 전방 십자인대를 횡단하여 무릎 관절의 기계적 정렬을 방해하여 골관절 진행을 촉진합니다. 이 모델은 특히 급성 OA 병리를 연구하고 잠재적 치료 중재를 평가하는 데 적합합니다. 관절염의 심각도를 평가하기 위해 소동물 초음파와 관절 강의 3차원(3D) 재건을 결합하여 관절 부피를 정량화하고 활막 액체 축적을 평가하였습니다. 또한, 연골 파괴를 평가하기 위해 골관절염 연구학회(OARSI)의 점수 산정을 위해 조직학적 절편의 사프라닌-O/빠른 녹색 염색이 수행되었습니다.

서론

무릎 골관절염(OA)은 무릎 주변의 통증, 뻣뻣함, 운동 범위 제한, 근력 약화가 특징인 흔하고 만성적이며 퇴행성 관절 질환입니다. 여성에게서 남성보다 더 많이 발생한다. 충분히 조절되지 않으면 OA는 점진적인 신체 능력 상실, 수면 장애, 만성 피로, 그리고 궁극적인 장애로 이어질 수 있습니다. 전 세계 인구가 고령화됨에 따라 무릎 골관절염 발생률은 계속 증가하고 있으며, 이는 전 세계 의료 시스템과 경제에 상당한 도전 과제를 제기하고 있습니다 1,2.

병태생리학적으로 연골 손실은 골관절 전체와 관절 주변 조직의 구조적·기능적 장애를 동반합니다. 질병 기전을 밝히고 치료 개입을 평가하기 위해, 인간 OA의 주요 측면을 재현하는 다양한 동물 모델이 개발되었습니다. 이 중 수술로 유도된 모델이 가장 자주 사용됩니다. 예를 들어, 내측 반월상월상월판(DMM)3의 불안정화와 전방 십자 인대 절단(ACLT)4의 불안정화는 정상적인 관절 구조를 파괴하여 연골 퇴행과 골골증 유사 변화를 초래합니다. 또는 화학 모델은 세포외 기질을 분해하는 물질(예: 콜라게나제나 단소나트륨 요오도아세테이트)을 관절 내 주입하여 연골 세포의 빠른 죽음과 연골 침식을 초래하는 5,6. 주사 모델은 보통 몇 주 내에 최종 병리학에 도달하는 반면, 외과 모델은 일반적으로 더 긴 치료 기간이 필요합니다.

사용 가능한 외과 기법 중에서, 우리는 OA7의 가속화된 발병 때문에 Hulth 모델을 선택하고 더욱 정교하게 개선했습니다. 전방 십자인대와 후방 십자인대의 절단과 내측 측부 인대 절제술 및 전내측 반월상연골 절제술을 결합함으로써, 이 모델은 심각하고 빠르게 진행되는 연골 손상과 연골하 골 변형을 신뢰성 있게 유도합니다. 구조적 관절 실패까지의 짧은 시간 프레임 덕분에 수정된 Hulth 모델은 급성 또는 아급성 OA 연구에 특히 적합하며, 최적화된 프로토콜이 향후 전임상 연구를 위한 실용적이고 재현 가능한 플랫폼을 제공할 것이라 제안합니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 상하이 중의학대학교 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다. 6-8주 생후 약 20g 무게의 수컷 C57BL/6 마우스는 상업 공급업체로부터 구입되었습니다( 재료표 참조)(윤리 승인 번호: PZSHUTCM2312210005).

1. 수술 전 관리

  1. 수술 전 최소 1주일간 쥐가 적응할 시간을 주세요.
  2. 수술 전 모든 수술 기구를 소독하고 수술 공간을 소독하세요.
  3. 가스 마취기를 켜고, 2-3% 이소플루란을 사용해 5분간 유도 챔버에 마우스를 넣어 전신 마취를 시작하세요.
    참고: 산소 유량이 0.5 NL/min에서 1 NL/분 사이로 유지되도록 하세요.
  4. 마취 후 마우스를 수술 플랫폼으로 옮기고, 마취 마스크를 통해 1-1.5% 이소플루란(1-1.5% 이소플루란)을 사용해 마취를 유지하여 수술 완료 시까지 마취를 유지합니다.
  5. 무릎 관절이 위를 향한 채 쥐를 누운 자세로 놓아 안정성과 수술 부위에 적절한 접근성을 확보하세요.
  6. 반사 작용이 없는지 확인하여 마취 깊이를 확인한 후, 무릎 관절 주변의 털을 완전히 제거하기 위해 제모 크림을 발라주세요.
  7. 잔여 크림을 거즈나 면봉으로 조심스럽게 제거한 후, 노출된 피부를 먼저 75% 에탄올로 소독한 뒤, 무균 상태를 유지하기 위해 요오드 팅크를 사용하세요.

2. 수술 절차 (그림 1)

  1. 쥐의 뒷다리를 뻗고 피부를 조이기 위해 접지력을 가하세요. 멸균된 수술용 칼날을 사용해 오른쪽 무릎 관절 내측을 따라 0.5-1cm 길이의 세로 절개를 하세요.
    참고: 아래에 설명된 모든 수술 절차는 현미경 아래에서 수행되었습니다.
  2. 피부를 젖히고 관절낭을 완전히 노출시키기 위해 근막을 둔하게 해리하여 슬개골 인대를 시각화하세요.
  3. 미세한 주사 바늘을 사용해 내측 측부 인대(MCL) 위에 있는 근막을 탐침하고 절개합니다.
  4. 확대 확대 상태에서 미세가위로 MCL을 횡단하세요.
  5. 바늘을 이용해 슬개골 인대를 전위하여 관절 내 공간을 노출시키고 내측 반월판을 확인합니다.
  6. 절단 후 미세가위로 내측 반월상공대(MMTL)를 횡단하고, 바늘로 조직을 부드럽게 탐색하여 반월판의 완전한 박리와 이동성을 확인합니다.
  7. 전방십자인대(ACL)를 확인하고 절개하며, 후방십자인대(PCL)나 측측 반월상월판의 손상을 피해야 합니다. 이로 인해 수술 후 전방 서랍 부지가 양성 징후로 나타나 관절 불안정성을 확인시켜 줍니다.
    참고: 서랍 검사: 상처 봉합 전에 한 손으로 대퇴골을 안정시키고 다른 손으로 발목을 잡아 경골과 대퇴골을 수직 방향으로 유지했습니다. 경골과 대퇴골 사이의 상대적 전후방 변위는 수동으로 적용되었으며; 관찰 가능한 이동 운동은 양성 서랍 징후를 나타내어 십자인대 파열을 확인했습니다.
  8. 더 심한 골관절염을 유도하기 위해, 또는 전방 십자인대(ACL)와 후방 십자인대(PCL)를 동시에 절단하고, 내측 반월상 반월板절제술(MMT)(고전적인 Hulth 모델과 동일)을 시행하는 방법이 있습니다.
    참고: 이 단계는 선택 사항이며 필요에 따라 수행할 수 있습니다; 선택된다면, 이는 고전적인 훌스 모델의 모델링 접근법을 의미한다.

3. 수술 후 관리

  1. 절개 부위를 4-0 나일론 봉합사로 봉합하고 수술 부위를 요오드 팅크로 소독하세요.
  2. 쥐를 온도 조절 가능한 온열 패드 위에 올려놓아 의식을 회복하고 정상적인 호흡과 운동 활동을 보일 때까지 유지하세요. 완전히 회복되고 아무런 고통 징후가 보이지 않으면, 고양이를 집 우리로 돌려보내세요.
  3. 수술 후 3-5일간 봉합사 상태를 지속적으로 모니터링하세요. 봉합사가 끊어지는 것이 관찰되면 마우스를 다시 마취하고 재봉합을 시행하세요
  4. 수술 후 최대 3일간 근육 내 항생제를 투여하여 수술 후 감염을 예방하세요.
    참고: 항생제 투여는 수술 후 감염 예방을 위해 사용됩니다. 수술 후 진통은 실험 목적에 따라 결정되며; 골관절염 연구에서는 치료 효능 평가를 혼란시키지 않도록 급성기에는 진통제를 보류하는 경우가 많습니다.
  5. 부기, 분비물, 국소 염증 징후를 매일 관찰하세요.
  6. 승인된 프로토콜에 따라 연구 기준점에서 쥐를 안락사시키고, 무릎 관절을 조직학적 또는 영상 분석을 위해 해리합니다.
    참고: 이 단계에서 우리는 실험 동물들을 과다복용 마취로 안락사시키는 프로토콜을 채택했습니다. 이는 쥐를 대상으로 >100 mg/kg 용량의 펜토바르비탈 나트륨 용액을 복막 내 주사로 이루어졌습니다.

4. OA 개발 평가

  1. 안락사 전에 관절 부기를 평가하고 무릎 관절의 구조적 변화를 평가하기 위해 초음파 검사를 실시하세요. 로타로드 테스트를 수행하여 마우스의 운동 성능을 평가합니다.
    참고: 마우스 초음파 검사에는 이소플루란 마취가 필요합니다.
  2. 안락사 후에는 무릎 관절을 박리하고 주변 근육과 근막을 조심스럽게 제거하면서 경골, 비골, 대퇴골을 보존하세요.
    관절을 고정하고 최소 30일 동안 10% 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 용액에 녹석을 제거하며, 완전한 탈석을 위해 일주일에 두 번 용액을 교체하세요.
  3. 탈석화된 무릎 관절을 파라핀에 박고 두께 4 μm8의 시상석 절면을 준비합니다.
  4. 반월상월판이 명확히 보이면 절편 채취를 시작하세요. 연골과 연골하 뼈 형태를 시각화하기 위해 사프라닌 O와 빠른 녹색으로 해당 부위를 염색하세요. OARSI9 점수 시스템을 사용하여 연골 분해를 평가합니다.
  5. Safranin O-Fast Green 염색 절차 (상업용 키트, 재료표 참조)
    1. 탈파라핀화 및 재수화
      1. 절편을 자일렌에 3분간 탈파라핀화하고, 3번 반복하세요.
      2. 잔류 자일렌을 제거하기 위해 등급별 에탄올 시리즈(100%, 90%, 80%)를 통해 각각 2분씩 수화합니다.
        참고: 에탄올 시리즈는 농도 내림차순으로 사용해야 합니다.
      3. 증류수에 1분간 씻고 잠시 물을 빼세요.
    2. 바이거트의 철 헤마톡실린 염색
      1. Weigert의 작업 용액을 섹션에 바르고 5분간 스테인을 발라.
      2. 증류수에 1분간 씻고 잠시 물을 빼세요.
    3. 산성 분화
      1. 산성 차별액을 15초 동안 절면에 바릅니다.
      2. 10분간 물에 씻고 남은 물을 빼세요.
        참고: 분화 시간이 매우 중요합니다 — 분화가 길어지면 빠른 녹색 염색이 방지되고, 분화가 부족하면 깊고 빠른 녹색 염색이 발생하며 사프라닌 흡수가 부족합니다
    4. 빠른 녹색 염색
      1. 구획마다 5분간 빠른 녹색 용액을 바르고 잠시 물을 빼세요.
      2. 약한 산성 용액을 사용해 잔여하는 빠른 녹색 얼룩을 15초간 제거한 후 잠시 물을 빼세요.
    5. 사프란 오 스테인
      1. 사프라닌 O 용액을 절면에 4.5분간 바르세요.
      2. 과도한 사프란인 O를 제거하기 위해 90% 에탄올로 구간을 빠르게 옮기세요, 2-3초.
        참고: 이 단계는 사프라닌 착색의 강도에 따라 적절히 연장될 수 있습니다.
    6. 탈수와 정화
      1. 100% 에탄올에 1분간 건조 부위를 넣으세요.
      2. 완전 탈수를 위해 자일렌에 절개를 제거하고, 2분간 반복합니다.
        참고: 이 단계에서 사용되는 자일렌은 4.5.1절에 사용되는 자일렌과 혼합해서는 안 되며; 교차 오염은 절편 품질을 저해할 수 있습니다.
    7. 중성 발삼으로 장착하기
      1. 과도한 자일렌이 증발하도록 구역을 휨 후드에 넣으세요.
      2. 조각을 제거하고, 적당량의 중성 발삼을 표본에 바른 뒤 커버슬립으로 조심스럽게 덮으세요.
      3. 광학 현미경으로 부위를 살펴보고 기포가 있는지 조심스럽게 제거하세요.
      4. 조각을 슬라이드 박스에 보관한 후 60°C 오븐에 24시간 동안 넣어 중성 발삼이 완전히 경화되도록 하세요.

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결과

무릎 관절의 종방향 스캔은 4mm 스캔 단계와 축방향 해상도 0.04mm의 마이크로초음파 8 시스템을 사용해 수행되었습니다. 수술 후 7일째에 3D 재건 결과, 모델 그룹에서 가짜 그룹에 비해 관절 강 부피가 현저히 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2A,B). Rotarod 피로 테스트10,11은 이 결과를 뒷받침하며, 같은 시점에 모델 그룹에서 달리기 지구력이 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 2C).

수술 후 28일째에 무릎 관절을 채취하여 시상상 파라핀에 박고 4μm 8 절개를 했습...

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토론

내측 반월상월상공(DMM) 및 전방십자인대 횡단(ACLT) 모델의 불안정화 모델과 비교하면, 수정된 Hulth 모델은 인대와 반월판 손상이 결합되어 골관절염을 유발합니다. 특정 구조적 파란은 서로 다른 평면에서 관절 생체역학의 변화를 결정합니다. ACLT4 는 회전 안정성(내회전 및 외회전)을 저해하고 전후 안정성을 감소시켜 양성 서랍 부호를 만듭니다. DMM3 는 내측 반월상공 인대(MMTL)를 파괴하여 내측 반월판을 불안정하게 하고, 경골대퇴골 운동 시 충격력에 저항하는 능력을 저하시킵니다. 또한 내측 측부 인대 절제술을 통해 내측 내측 인대 절제를 통해 내전력에 대한 저항을 제거합니다. 수정된 훌스 모델은 두 접근법 모두에서 생체역학적 변화를 포함하여, 더 빠르고 심각한 관절 연골 파괴를 일으킵니다. 내측 반월상 반월판 절제술(MMT)12

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 상하이 과학기술혁신행동계획(23YF1447900에서 CJM), 상하이 교육개발재단 및 상하이시 교육위원회의 청광 프로그램(23CGA53에서 CJM), 그리고 중국 국가자연과학기금(U24A6013에서 XH까지)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL 주사 주사기//사양: 30G 및 시간; 0.13 mm
3D 초음파 Vevo 3100 영상 시스템광학 장치베보 2100데이터 분석을 위한 Vevo LAB 소프트웨어와 통합된 고주파 초음파 영상 시스템입니다.
4-0 나일론 봉합사//
에탄올 75%상하이 타이탄 과학 유한회사.G73537O
C57BL/6J 수컷 쥐 (6-8주 생애)상하이 제사제실험동물유한회사./
제모 크림베트로트: C021123001
요오드 팅크//
이소플루란RWD R650-IE
마이크로 겸자RWD F12013-10
마이크로 가위RWD S11035-08
수정된 사프라닌 O 및 빠른 녹색 스테인 키트솔라비오G1371
바늘 홀더RWD F21001-12
수술용 칼날 (10#)RWD S31010-01
외과용 현미경올림포스SZ61

참고문헌

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