마우스 부신 피질에 대해 대(zona glomelosa) 및 다소 포시큘라타(zona fasciculata) 풍부 세포의 2D 1차 배양을 확립하는 견고하고 재현 가능한 접근법이 개발되었습니다. 이 시스템은 각 영역의 핵심 분자 및 기능적 특징을 보존하여, 신호 전달 경로, 호르몬 생성, 부신 피질 세포 행동에 대한 체 외 내 집중 연구를 가능하게 합니다.
연구 논문
마우스 부신 피질에 대해 대(zona glomelosa) 및 다소 포시큘라타(zona fasciculata) 풍부 세포의 2D 1차 배양을 확립하는 견고하고 재현 가능한 접근법이 개발되었습니다. 이 시스템은 각 영역의 핵심 분자 및 기능적 특징을 보존하여, 신호 전달 경로, 호르몬 생성, 부신 피질 세포 행동에 대한 체 외 내 집중 연구를 가능하게 합니다.
마우스의 부신은 중간엽 세포층(캡슐)으로 감싸져 있으며, 특수한 내분비 기능을 가진 뚜렷한 동심원 구역으로 구성된 피질을 포함하고 있습니다: 알도스테론을 생성하는 사구체대(zG)와 코르티코스테론을 생산하는 다발구간(zF)입니다. 부신 연수(수질)는 샘 중앙에 위치하며 카테콜아민을 생성합니다. 각 부신피질대 세포에 대한 기전적 연구는 해당 부류의 분자, 세포, 기능적 특성을 보존하는 시험관 내 모델이 부족해 한계가 있습니다. 이 한계를 극복하기 위해 성체 마우스 부신의 미세해리를 이용한 분획 접근법이 개발되었습니다. 이 방법은 수컷 마우스의 부신 세포를 캡슐 및 zG 세포를 포함하는 zG 풍부 외부 분획(OF)과 zF 풍부함 내분획(IF, zF 및 수질 세포 포함)으로 분리합니다. 이 분획들은 zG 또는 zF 세포에 대해 농축된 2차원(2D) 1차 배양을 생성하는 데 사용되었습니다. 유전자 발현 분석 결과, zG가 풍부한 배양물은 높은 수준의 zG 마커(Cyp11b2, Dab2, Shh)를 발현하며, Wnt/β-카테닌 경로 표지자(Wnt4, Lef1)도 증가함이 확인되었습니다. 반면, zF 풍부 배양은 zF 마커(Cyp11b1 및 Akr1b7)의 발현이 더 높고 Wnt/β-카테닌 경로 표지자의 수치가 낮은 것으로 zF 전사 서명과 일치합니다. 스테로이도발생 마커(Nr5a1, Star)의 발현은 두 세포 분획의 부신피질 기원을 확인하였습니다. 티로신 하이드록실라아제는 zF 농축 배양에서 부신 수질 세포의 존재를 나타냅니다. 기능적으로 zG 비축 배양은 기저 조건에서 알도스테론을 생성했으며, 안지오텐신 II, 칼륨, 부신피질자극호르몬(ACTH)에 반응하여 생성이 증가하는 것을 보였다. 반대로, zF 농축 배양은 기저선에서 코르티코스테론을 생성했으며 ACTH 자극에 반응하여 출력이 증가했습니다. 전반적으로 이 프로토콜은 부신 피질 생물학 연구를 위한 견고하고 재현 가능하며 생물학적으로 관련된 시험관 내 모델을 대표합니다. 이 시스템은 신호 전달 경로, 분자 메커니즘, 생리학적 반응에 대한 영역별 특이적 조사를 가능하게 합니다.
얇은 중간엽 캡슐이 쥐 부신을 감싸고 있으며, 부신은 두 개의 주요 구획인 외부 피질과 내측 연수로 구성되어 있습니다. 성체 수컷 쥐의 부신 피질은 추가로 구분되는 구별대(zG)와 부단대(zF)로 나뉘며, 각각 고유한 형태적·기능적 특징 1,2,3,4를 가집니다. 부신 피질의 주요 기능은 미네랄로코르티코이드(알도스테론)와 글루코코르티코이드(쥐의 코르티코스테론)를 포함한 스테로이드 호르몬 생성입니다5. zG는 가장 바깥쪽이자 가장 밀집된 영역으로, 알도스테론 합성효소(CYP11B2)를 발현하는 로제트 구조로 조직된 난방 세포들로 구성되어 알도스테론 2,3,5,6,7을 생성할 수 있게 합니다. 알도스테론의 분비는 주로 레닌-안지오텐신-알도스테론계(RAAS), 칼륨, 그리고 다소 적은 부분에서 ACTH 5,8에 의해 조절됩니다. zF는 요골 섬유/섬유 형태로 배열된 더 큰 세포들로 구성되어 있으며, 피질의 대부분(~85%)을 차지하고 주로 ACTH 2,3,5,9에 의해 조절됩니다. 여러 신호 전달 경로가 전구세포 역학, 분위, 스테로이도생성 활동을 조절하여 부신의 발달, 유지 및 기능을 조율합니다. 이 중 SF-1(스테로이도제닉 인자-1, Nr5a1)은 부신피질 명확, 증식 및 호르몬 생성에 필수적인 주요 조절제입니다. zG에서 활성하는 소닉 헤지혹(Shh) 신호는 전구세포 확장을 촉진하고 zG11, 12, 13에서 피질 재생을 지원합니다.
특히 정준 β-카테닌 경로를 통한 Wnt 신호전달은 부신 구역과 피질 완전성에 매우 중요합니다. 마우스에서는 정상 부신피질의 크기와 분대가 캡슐에서 zF까지 이어지는 WNT 신호 활동의 구배에 의해 조절됩니다. 이 구배는 주로 zG의 WNT4, 캡슐 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22의 WNT2B 및 R-스폰딘(RSPO1 및/또는 RSPO3)의 국소적 발현에 의해 지지됩니다 . 부신 피질은 아캡슐/외부 zG 영역에 위치한 증식성 전구세포에서 세포가 구심력 있게 흐르는 것에 의해 유지되며, 이들은 분화된 zG 세포를 생성하여 zF 쪽으로 이동합니다. 세포가 zG에서 zF로 전이할 때, 유전자 발현과 기능에 변화가 일어나는데, 이를 트랜스-분화라고 합니다. 이 모델은 zG 23,24,25의 알도스테론 생성 세포를 특이적으로 표적으로 하는 ASCre/+ 형질전환 마우스 계통 연구들에 의해 강력히 지지되었습니다.
부신 전체의 해리를 기반으로 한 부신 생물학을 연구하기 위해 여러 시험관 내 접근법이 사용되었습니다 26,27,28. 예를 들어, 한 연구에서는 부신 피질의 해리를 전기생리학적 및 패치 클램프 분석에 적용했고, 또 다른 연구에서는 해리된 부신 피질 세포를 이용해 부신 생리와 혈압 조절과 관련된 신호 전달 메커니즘을 조사했습니다26. 이러한 방법론은 중요한 기능적 통찰을 제공했지만, 세포 배양 전 피질 영역 분리보다는 전체 부신 준비 세포에 의존합니다.
부신의 복잡성과 조직학적 다양성을 고려할 때, 그 세포 구획의 뚜렷한 역할을 이해하는 것은 부신 기능의 기전을 밝히는 데 필수적입니다. 이 연구에서는 zG 또는 zF 세포를 풍부하게 한 1차 마우스 부신피질 세포 배양을 확립하였습니다. 이 방법의 주요 장점은 zG 풍부한 세포 배양을 생성할 수 있다는 점으로, 이를 통해 신호 전달 경로와 환경 요인을 실험적으로 조절하여 부신 피질 생물학에서 그 특정 역할을 더 잘 조사할 수 있게 합니다. 여기에는 전구세포 유지 연구, zF로의 대간 가소성 및 전환 분화의 기전, 세포외 기질 구성 모델링이 포함됩니다. 동시에 이 방법은 고농축된 zF 세포 배양을 생성하여 존 특이적 기능 및 신호 전달 연구를 위한 보완적 플랫폼을 제공합니다. 이 특징들은 함께 부신 생물학에 대한 이해를 진전시키는 견고하고 실험적으로 통제된 시스템을 제공합니다.
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모든 실험은 보스턴 아동병원 기관동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 00002611호 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서 사용된 모든 재료(시약, 소모품, 장비 포함)의 전체 목록은 재료표에 제공되며, 해당 제조사 및 카탈로그 번호도 함께 제공되어 재현성을 보장합니다.
마우스 부신 사구체 세포와 다구체 세포의 1차 배양
이 연구에서 성체 수컷 쥐 야생형(Mus musculus, C57BL/6) 부신피질 세포의 1차 배양을 확립하는 방법들은 원래 Sprague-Dawley 쥐를 위해 개발된 절차를 변형하여 채택했다28. zona glomerulosa와 zona fasciculata 세포 집단의 분리와 동일성을 확인하기 위해, Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+(일명 Cre) 마우스 1,2,3,4와 Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J(ROSAmT/mG) 마우스29를 이용한 계통 추적 모델이 사용되었습니다.
시술 전 준비
재료
표면 절개에는 두 세트의 겸자와 가위, 복강 절개에는 또 다른 세트가 있습니다(보충 그림 1A). 배양지를 가열하고 PBS(37 °C)를 사용했습니다. DMEM/F-12로 2개의 요리(P60)를 준비했습니다. 선을 순차적으로 세척하기 위해 가열한 PBS로 3개의 접시(P60)를 준비했으며(목욕 1, 2, 3) (보충 그림 1B, 1–3), 부신을 용액 내에 유지하기 위한 접시 1개(보충 도판 1B, 4). 표면에 멸균 필터 페이퍼를 깔고 2개의 접시(P60)를 준비했습니다(보충 그림 1C, 1–2). 500 μL 소화액으로 P60 접시 2개를 준비하고 사구체(zG) 또는 다발(zF)에 대해 라벨을 붙였습니다(보조 그림 1D, zG, zF). 2개의 튜브를 준비하고 zG와 zF를 표지한 후 4.5mL의 소화액을 추가했습니다.
해결책
소화액을 만들기 위해 콜라겐제 1형(최종 농도 4 mg/mL)과 DNase I(최종 농도 0.04 mg/mL)을 순수 DMEM/F-12 배양지 5 mL에 용해시켰습니다. 주사기와 0.22 μM 필터를 사용해 용액을 50 mL 튜브에 여과했습니다. 소화액 은 매번 신선하게 준비해야 합니다.
동물
마우스 부신 사구체 및 다구체 세포에 대한 1차 배양을 얻으려면, 약 6-7주 된 10–15마리의 젊은 성체 수컷 마우스를 사용합니다. 여성은 남성보다 부신이 약간 더 크며, 이 프로토콜에 대해 남녀 모두를 사용할 수 있습니다. 그러나 이 연구에서는 어린 암컷에게 존재하는 X존의 잠재적 간섭을 피하기 위해 수컷만 사용하여 정확한 구역 분리를 보장했습니다. 생쥐는 기관 동물 관리 지침에 따라 CO₂ 흡입으로 안락사되었습니다. 호흡 부재와 반사 반응 부재로 사망이 확인되었다. 부신은 사망 확인 후 3–5분 이내에 즉시 박리하여 조직 생존 가능성을 유지하였다.
복부의 위치 및 노출
쥐는 멸균된 평평한 표면 위에 등쪽 십정위 자세로 놓였다(그림 1A). 동물의 털은 70% 알코올로 소독되었다. 검자와 가위는 피부 절개를, 두 번째 세트는 복강 절개에 사용되었습니다. 복부 서두부 부위에 처음에는 양쪽 흉부 쪽으로 측면으로 확장되어 복막을 노출시키도록 절개가 이루어졌습니다(그림 1B). 피부를 조심스럽게 젖히고 복부 근육을 펴 복강을 노출시켰습니다(그림 1C). 초기 절개는 내부 장기 손상을 피하기 위해 얕은 곳이어야 합니다. 조심스럽게 절개하여 근육층으로 진행한 후 복강을 노출시킵니다. 혈관이 파열되는 것을 피하세요. 출혈은 부신 위치를 찾기 어렵게 만들고 채혈을 지연시킬 수 있습니다. 미생물 오염을 최소화하기 위해 수술 기구를 교체하세요.
좌부 부신의 식별 및 채집
좌측 부신은 후복막에서 왼쪽 신장 위쪽 안쪽에 위치하며, 타원형에 분홍색을 띠고 흰색 지방 조직으로 둘러싸여 있습니다(그림 1D–G). 시야를 높이기 위해 둔한 겸자로 인접 장기를 조심스럽게 치우면서, 짧고 통제된 절단으로 가위를 사용해 대부분의 지방 조직을 제거하여 부신을 분리하세요. 부신 손상을 막기 위해 부신을 직접 잡지 마세요. 분리 직후 샘은 37°C에서 10mL의 미리 가열된 DMEM/F-12와 함께 P60 배양 접시에 삽입되었습니다(그림 1F).
우측 부신의 식별 및 수집
오른쪽 부신은 후복막에서 오른쪽 신장보다 측면, 위쪽에 위치하며, 타원형과 분홍색 색을 띱니다(그림 1E–H). 이 부신은 간, 상행 대장 등 다른 장기와 인접해 있어 식별이 더 어려울 수 있습니다. 인접한 장기를 둔탁한 겸자로 조심스럽게 옮겨 시각을 개선한 후, 가위로 짧고 통제된 절단으로 대부분의 지방 조직을 제거하여 부신을 분리하고, 캡슐을 손상시키지 않도록 주의하세요. 분리 직후 샘은 P60 배양 접시에 37°C에서 10mL 미리 가열된 DMEM/F-12와 함께 배치되었습니다. 부신은 같은 접시에 결합되어 있습니다(그림 1F). 시술 중에는 우발적인 절단을 방지하기 위해 해당 부위의 주요 혈관을 주의 깊게 다루는 것이 필수적이며, 이는 출혈을 유발하고 채취 과정을 복잡하게 만들 수 있습니다. 주의해야 할 주요 혈관은 신장정맥과 신동맥입니다. 부신과 부착된 지방 조직을 채취했습니다. 이로 인해 샘의 처리가 용이해지고 캡슐 손상과 오염으로부터 보호됩니다(그림 1I).
멸균 층류 후드에서의 작업
샘을 층류 후드로 옮기기 전에 접시를 70% 알코올로 깨끗이 닦았습니다. 부신은 상온(25 °C)에서 PBS로 세 차례 세척되었으며(접시 1, 2, 3), 접시 4에서 수집되었습니다(보충 그림 1B). 필터 페이퍼는 지방 부착을 돕고 더 나은 결과를 보장합니다. 다선을 준비하는 동안, 분리된 조직은 생존 가능성을 유지하기 위해 미리 가열된 DMEM에 보관되어야 합니다. 부신은 부착된 지방 조직에 의해 잡혔고(그림 1I–J), 지방은 필터 종이에 조심스럽게 해부되었으며(보조 그림 1C, 접시 1), 캡슐 손상을 방지하기 위해 정밀 겸자와 조절된 움직임을 사용했습니다. 기대되는 결과는 그림 1K에서 보듯이 지방과 결합 조직이 없는 매끄럽고 온전한 샘입니다. 부신은 정밀 미세해부를 용이하게 하기 위해 신속히 신선한 여과지(보완 그림 1C, 접시 2)로 옮겨졌습니다. 캡슐은 미세한 겸자로 부드럽게 집었고, 메스 칼날을 사용해 조직을 완전히 절단하지 않고 방사선 절개를 했습니다.
피질 내부 내용물은 겸자로 약간의 기계적 압력을 가해 절개를 통해 부드럽게 바깥쪽으로 배출되었습니다. 캡슐과 zG는 겸자 끝에 연결되어 있었고, 내부에서 배출된 분비선 물질은 zF와 연수에 해당했습니다. 효소 소화는 모든 샘이 처리된 후에야 시작되어야 하며(그림 1L), 이는 외부 구역과 내부 구역의 기계적 분리 때문입니다.
소화
두 개의 튜브는 OF(외부 분획: 캡슐 및 zG) 또는 IF(내부 분획: zF와 연수)로 라벨링되었습니다(그림 1M). 총 4.5mL의 예열된 소화액(37°C)이 추가되었고, OF와 IF는 적절한 튜브로 옮겼습니다. 샘플은 37°C에서 5% CO₂가 포함된 가습 인큐베이터에서 30분간 배양했으며, 튜브를 10분마다 부드럽게 돌려 2–3번 수동으로 뒤집어 효소 용액에 균일하게 노출되도록 했습니다. 소화에 필요한 시간은 콜라겐제의 질, 활성, 보관 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 30분 후, 5mL 혈청 피펫을 사용해 천천히 조절된 스트로크로 40회 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 슬러리를 생성하여 조직을 해리시켰습니다. 조직 해리 후에는 이상적으로는 보이는 조각이 남지 않고, 매질이 흐릿하게 보여야 합니다. 조각이 남아 있다면 추가로 15분 소화를 고려할 수 있습니다.
세척 및 도금
소화 후에는 45mL의 DMEM/F-12를 추가하여 잔류 효소를 제거하여 세포를 세척했습니다(그림 1 M). 샘플은 150 × g 에서 실온(25 °C)에서 12분간 원심분리되었습니다. 원심분리 후에는 약간 분홍빛에서 연한 노란색을 띠는 작고 컴팩트한 펠릿이 나오며, 상청액은 투명하고 눈에 띄는 입자가 없어야 합니다. 상정액은 조심스럽게 제거되어 폐기되었으며, 펠릿을 건드리지 않도록 주의했습니다. 이 펠릿은 도금에 필요한 최종 부피에 따라 미리 가열된 37 °C 배양 배지에 재현탁되었습니다(아래 참조). 배양 생존성과 활력을 보장하기 위해 약 70%의 최적 도금 밀도가 유지되었습니다. 세포 수는 도금 전에 노이바우어 카운팅 챔버를 사용해 추정했으며, 배양 접시 면적에 따라 씨앗 수를 조정하여 원하는 합류도를 달성했습니다. zG 농축된 외부 분획(OF) 세포는 웰당 약 1마리 밀도로 플레이트링합니다(일반적으로 10개의4 셀× ~1.5–2.5개), zF 농축된 내부 분획(IF) 셀은 웰당 ~0.63개의 동물(일반적으로 10개의4 셀× ~2.5–4.0 생성)으로 플레이트링합니다.
세포 배양 유지
세포는 위에서 설명한 배양 배지에서 배양되어 표준 조건에서 37°C, 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 유지되었습니다. 24시간 배양 후 배지를 교체하여 잔해와 잔여 혈구를 제거했습니다. 이 단계는 최적의 성장을 촉진합니다. 플레이트는 신중하게 흡입되었고, 신선하게 미리 데워진 37°C 매체가 추가되었습니다. 기능적 실험에서 세포를 평가하기 전에 최소 48시간을 기다려야 합니다. 배양이 잘 자리 잡았는지 확인하기 위해 기능적 실험을 수행하기 전에 3일을 기다리는 것이 권장됩니다. 이 기간을 넘긴 장기 배양은 트립신화 및 배설이 필요할 수 있으며, 이는 세포 선택과 1차 배양 특성 상실로 이어질 수 있습니다.
데이터 분석 및 지원 절차
1차 부신 세포 배양 제조
조직 채취, 소화, 세척, 플레이트 부착에 동일한 절차로 전신 부신 1차 배양을 구축했으며, 분자 및 기능 검사의 표준 대조군으로 사용되었습니다.
유전자 발현 분석
OF 및 IF 세포에서 총 RNA를 정제하기 위해, 제조사 프로토콜에 따라 배양된 세포를 RNA 키트를 이용해 TRIReagent에서 균질화되었습니다. RNA의 무결성과 농도는 분광법을 사용하여 평가하였습니다. 전체 RNA의 추가 처리는 고용량 cDNA 역전사 키트를 이용한 cDNA로의 역전사를 포함했습니다. 유전자 발현 분석은 열사이클러를 이용한 실시간 정량 PCR(qPCR)으로 수행되었습니다. 변동성을 제어하기 위해 기술적 복제본이 사용되었습니다. TaqMan Universal PCR 마스터 믹스와 마우스 TaqMan 프라이머가 사용되었습니다(표 1). 각 샘플 반복 실행 시 선형 증폭 범위 내에서 사이클 임계값(CT) 값이 선택되었습니다. 이 유전자는 내인성 대조 유전자 인 β-액틴과 리보솜 단백질 18S(Rps18)에 의해 정규화되었습니다. 상대 발현 수준은 2–ΔΔCt 방법을 사용하여 계산되었습니다. 세 가지 다른 실험의 데이터는 평균 표준편차(SD)± 제시됩니다. 우리는 세 가지 독립적인 실험을 수행했습니다.
1차 ZG 및 ZF 배양에서 알도스테론과 코르티코스테론 분비 자극
1차 배양 대상은 5% CO₂가 포함된 가습 환경에서 37°C에서 37°C에서 형성되고 유지되었습니다. 48웰 플레이트에서 완전한 배양지를 사용해 웰당 약 5개 ×10개의 4 셀이 플레이트링되었습니다. 4일간의 연속 배양 후, 기저 분비 측정은 이 기간 동안 누적된 호르몬 생성을 반영했습니다. 자극 검사에서는 배지를 흡인하고, 잔류 인자를 제거하기 위해 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척했습니다. 이후 각 웰에 200 μL의 신선 배지를 추가하였으며, 다음 분석들은 정해진 시간 창 내의 급성 자극 분비를 나타냅니다. 알도스테론 자극 검사에서는 배양액에 안지오텐신 II(Ang II, 10 nM), 칼륨(K+), 염화칼륨(KCl, 10 mM), ACTH(10 nM)가 보충되었습니다. 차량 제어장치로 염화나트륨(NaCl, 10 mM)이 사용되었습니다. 코르티코스테론 자극 검사에서는 동일한 절차를 따랐으나, 매개체 대조군으로 ACTH(10 nM), 포스콜린(10 μM), 또는 NaCl(10 mM)이 보조되었다. 37°C, 5% CO₂에서 6시간 배양 후, 배양 상원액을 -80°C에서 수집하여 호르몬 정량을 위해 보관하였으며, 앞서 설명한31. 남은 부착 세포는 단백질 추출을 위해 용해되었고, 호르몬 수치는 해당 용해액의 총 단백질 함량에 맞게 정규화되었다.
알도스테론 및 코르티코스테론 측정값의 단백질 추출 및 정규화
단백질 추출은 RIPA 용해 및 추출 버퍼를 사용하여 수행되었으며, 1x 홀트 프로테아제 억제제 조합을 보조하였습니다. 세포는 P200 피펫 팁을 사용해 15회 위아래로 피펫팅하여 재현탁한 후, 프로브 소닉에이터로 초음파 검사를 진행했습니다. 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트로 측정되었습니다.
방사면역분석법(RIA)을 통한 알도스테론 측정
세포 배양 상청액 내 알도스테론 농도는 제조사 프로토콜을 따라 결정되었습니다. 간단히 말해, 50 μL 상청액과 1% BSA 150 μL PBS, 그리고 500 μL 알도스테론 방사성 추적자를 알도스테론 항체 코팅 튜브에 첨가했습니다. 혼합 후, 튜브들은 실온(25°C)에서 18시간 동안 배양되었습니다. 그 후 배양 혼합물을 디캔팅하고, 코브라 II 자동 감마 계수기31을 사용해 튜브 내 방사능을 측정했습니다. 알도스테론 수치는 앞서 설명한 대로 총 단백질로 정상화되었습니다.
코르티코스테론 측정
세포 배양 상청액 내 코르티코스테론 농도는 제조사 프로토콜에 따라 마우스 및 쥐 코르티코스테론에 특화된 경쟁 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 키트를 사용하여 측정하였습니다. 코르티코스테론 수치는앞서 설명한 대로 총 단백질로 정상화되었습니다.
면역염색
면역형광은 파라핀 내재 부신 절편과 폴리-L-라이신으로 코팅된 사전 처리된 유리 커버슬립에서 배양된 세포 모두에서 수행되었습니다. 모든 샘플에 대해 5% 정상 염소 혈청(NGS)을 PBS에서 차단하였고, 핵은 DAPI(4′, 6-디아미디노-2-페닐린돌, 1:1000)로 교환하였습니다. 슬라이드와 커버슬립은 각각 5분씩 세 차례 세척되었으며, 배양 단계 사이에 PBS 농도 0.1%를 사용했습니다. 염색 후 샘플은 Antifade Mountant로 장착한 후 어둠 속에 보관되어 영상 촬영을 기다렸습니다. 조직 절제: 부신 파라핀 절편은 자일렌에서 탈파라핀된 후, 등급별 에탄올 시리즈(100%, 95%, 70%)로 헹군 후 PBS로 세척했습니다. 항원 회취는 Tris-EDTA 버퍼(10 mM Tris 염기, 1 mM EDTA, 0.05% Tween-20, pH 9.0)에서 95 °C에서 20분간 가열하여 수행되었습니다. 상온으로 식힌 후, 절단을 PBS로 세척하고 5% NGS로 1시간 동안 블로킹했습니다. 절편은 4°C에서 1:100 희석된 1차 항체를 5% NGS 내 PBS에서 배열하였다: 마우스 항-Dab2, 닭 항-GFP, 토끼 항-RFP. 다음 2차 항체가 사용되었습니다(1:300): Alexa Fluor 594 염소 항쥐 IgG, Alexa Fluor 594 염소 항닭 IgY, Alexa Fluor 647 염소 항토끼 IgG.
배양 세포: 플레이트 부착 4일 후 커버슬립에 대한 면역형광 검사를 수행하였습니다. 세포는 미리 예열된 4% 파라포름알데히드(PFA)로 37°C에서 15분간 고정한 후 PBS에서 세 번 세척했습니다. 차단은 상온에서 1시간 동안 PBS에 5% NGS를 사용해 수행하였다. 커버슬립은 4°C에서 마우스 항 Dab2(5% NGS/PBS 1:100)와 함께 하룻밤 배양하였고, 이어서 Alexa Fluor 488 염소 항생쥐제(1:500)를 배양하였습니다.
이미지 획득: 현미경 시스템을 사용해 배양된 세포의 밝은 시야 및 형광 이미지(mGFP 및 mTomato)를 획득했습니다. mGFP 형광은 녹색 형광용 필터(여기: 470 nM, 방출량: 525 nM)를 사용해 포착했으며, mTomato 형광은 적색 형광용 필터 세트(여기 585 nM, 방출량: 624 nM)를 사용해 포착했습니다.
소프트웨어 및 통계 분석
시각적 요약, 회로도, 도표는 Adobe Illustrator 2023(Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html)과 BioRender(https://www.biorender.com)를 사용해 제작되었으며, 2025년 5월에 접속했습니다. 데이터는 GraphPad Prism 버전 10.0을 사용해 분석되었습니다. 이용 가능 주소: https://www.graphpad.com. 모든 실험은 결과의 재현성을 보장하기 위해 최소 3회 이상 독립적으로 반복되었습니다. 두 그룹 간 비교에는 학생 t-검정(적절한 경우 쌍 또는 비쌍)을 사용했습니다. 세 개 이상의 그룹이 포함된 비교의 경우, 분산 분석(ANOVA)과 적절한 사후 검정을 통해 그룹 간 유의미한 차이를 확인하였습니다. 결과는 평균 ± SD로 제시됩니다. p-값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
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존 강화 1차 부신 세포 배양의 설립 및 특성 규명
1차 부신 세포 배양은 zG 세포에 대해 농축된 OF, zF 세포에 대해 농축된 IF에서 성공적으로 확립되었습니다. 배양된 세포의 대표적인 이미지는 그림 2A(OF–zG)와 그림 2B(IF–zF)에 나와 있습니다. 이 배양에서 zG 세포와 비zG 세포의 농축을 평가하기 위해 ASCre/+:: ROSAmTmG/+ 마우스 모델을 사용하였습니다(그림 2C). 이 쥐들에서 Cyp11b2 프로모터에 의해 구동되는 Cre 재조합효소가 5주에서 6주 된 동물의 zG 세포에서 mGFP 발현을 특이적으로 유도합니다(그림 2C, S2A–C). 생세포 형광 영...
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본 연구에서는 zG(OF) 및 zF(IF) 세포를 풍부하게 한 1차 마우스 부신 세포 배양을 생성하는 정교한 프로토콜이 제시되었으며, 이 배양은 각 영역의 존 동일성과 스테로이도제인(스테로이도인) 기능을 충실히 재현합니다. 이 프로토콜은 부신 피질의 세포 및 분자 생물학을 존 특이적 맥락에서 상세히 조사할 수 있게 하여, 부신 피질의 발달, 분화, 기능 및 재생에 관여하는 단백질, 신호 전달 경로 및 메커니즘 연구를 지원하고, 특히 외부 조직 구획의 다른 조직 구획으로부터의 간섭을 줄여야 합니다. 2차원(2D) 마우스 1차 부신 세포 배양은 OF에서 추출되었으며, zG 세포는 농축되었고, IF는 zF 세포에 대해 농축되었습니다. 분자 특성 분석은 이들 배양물의 뚜렷한 세포 구성을 확인했으며, 기능적 분석은 영역 특이적 호르몬 생성과 생리적 자극에 대한 반응을 입증했습니다.
이 연구에서 사용된 OF와 IF
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저자들은 이 연구와 관련된 경쟁적인 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
이 연구는 FAPESP(브라질 상파울루 연구재단) 프로젝트 번호 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), 그리고 2R01DK123694(DTB) 지원과 보스턴 어린이병원 내분비학과(DTB)의 지원을 받았습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Conical Tube (50 mL ) | Corning (Corning, NY, USA) | 352070 | Sterile |
| 0.22 µm 주사기 필터 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | SLGV033RS | 소화 용액 여과 |
| 10 mL 일회용 주사기 | BD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA) | 300912 | Sterile |
| 5 mL 혈청 배양 파이펫 | Corning (Corning, NY, USA) | 4487 | Sterile |
| 10 mL 혈청 배양 파이펫 | Corning (Corning, NY, USA) | 4488 | Sterile |
| 필터 파이펫 팁 (P200) | Axygen (Union City, CA, USA) | TF-200-R-S | Sterile |
| 필터 파이펫 팁 (P1000) | Axygen (Union City, CA, USA) | TF-1000-R-S | Sterile |
| P60 배양 접시 | Corning (Corning, NY, USA) | 430166 | 조직 배양 처리 |
| 48-웰 플레이트 | Corning (Corning, NY, USA) | 3527 | 조직 배양 처리 |
| 멸균 필터 용지 | N/A | N/A | 지방 제거 및 해부 지원 |
| DMEM/F-12 배지 | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 11320033 | 1:1 배합 |
| 태아 소 혈청 (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 10082147 | 열활성화 |
| ITS 보조제 | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 41400045 | 100X |
| GlutaMAX 보조제 | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 35050061 | 100X |
| 페니실린-스트렙토마이신 (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 15140122 | 항생제 |
| PBS 1X | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 10010023 | pH 7.4 |
| 콜라게나제 1 타입 | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 17100-017 | 조직 소화 |
| DNase I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | DN25-1 | 조직 소화 |
| 안지오텐신 II (Ang II) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | A9525 | 호르몬 자극 |
| 부신피질자극호르몬 (ACTH) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | A0298 | 호르몬 자극 |
| 포스코린 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | F6886 | cAMP 자극 |
| 칼륨 염화물 (KCl) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P9541 | 알도스테론 자극 |
| 나트륨 염화물 (NaCl) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S7653 | 차량 대조 |
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| 곡선 핀셋 | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 11251-10 | 해부 |
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| 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | 세포 배양 |
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| RIPA 용해 및 추출 버퍼 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 89901 | 단백질 추출 |
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| Alexa Fluor 594 |
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