마우스 눈물샘 상피 세포를 배양하기 위한 두 개의 소분자로 구성된 새로운 혈청 프리 2D 및 3D 배양 시스템입니다

Baihui Zeng; Shurong Wang; Cheng Li

doi:10.3791/70438

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방법 논문

마우스 눈물샘 상피 세포를 배양하기 위한 두 개의 소분자로 구성된 새로운 혈청 프리 2D 및 3D 배양 시스템입니다

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DOI:

10.3791/70438

⸱

2026년 2월 10일

Baihui Zeng¹^,² , Shurong Wang¹ , Cheng Li²^,³^,⁴

¹Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, ²Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, ³Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, ⁴Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

이 논문에서

요약

소분자 조합인 2C(Y27632 및 SB431542)를 이용한 새로운 혈청 무첨가 배양 시스템이 도입되어 2D 및 3D 배양 모두에서 눈샘 상피세포(LGECs)를 효율적으로 증식하여 증식과 분화를 정밀하게 조절할 수 있게 되었습니다.

초록

눈물샘(LG) 기능 장애는 수성 결핍성 건조안증의 주요 원인이며, 세포 기반 및 조직 공학 치료가 이 질환에 상당한 잠재력을 보입니다. 그러나 혈청 없는 환경에서 배양된 충분한 씨앗 세포의 가용성이 제한되어 이 기술들의 광범위한 적용이 어려웠습니다. 본 연구에서는 Y27632와 SB431542(2C) 두 가지 소분자를 사용하여 LG 상피세포(LGECs)를 효율적으로 증식하는 새로운 무혈청 배양 시스템을 개발했습니다. LGEC의 2D 1차 배양에서는 6-8주 된 마우스에서 LG를 분리하여 Dispase II와 콜라게나제 A를 이용해 효소적으로 소화하였습니다. 생성된 세포 현탁액은 7,500 cells/^{cm 2} 의 밀도로 배양 접시에 씨앗을 넣고 2C와 함께 12-14일간 배양했습니다. 세포 합류율이 80-90%에 도달하면 1:2 비율로 서브컬처가 시작되었습니다. 3D 배양을 위해 10,000개의 P1 LGEC를 10 μL 2C 및 10 μL 매트릭스 젤에 재현탁한 후 24웰 플레이트 중앙에 시딩했습니다. 37°C에서 30분간 굳어진 후, 2C 600 μL를 추가하여 계속 배양하였습니다. 분별을 위해 3D 구형체는 2C로 7일간 배양한 후 2C를 제거한 후 추가로 7일간 배양을 계속했습니다. 2C로 배양한 LGEC는 높은 증식을 보였으며, 줄기 및 증식 마커의 발현이 높았으며(Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0.0011, 0.0002, 0.0012, 0.0003, 0.0014]), 10회 통과 후에도 형태와 증식 능력을 유지했습니다. 더 나아가, 3차원 조건에서 LGEC는 줄기/전구세포 특성을 가진 구체를 형성했으며, 이는 2C가 제거된 후 여러 LG 세포 유형(AQP5, K19, α-SMA 양성)과 성숙한 분비 기능을 포함하는 미세선체 구조로 분화했다. 이 접근법은 조직 공학을 위한 안정적인 씨앗 세포 공급원을 제공할 것으로 기대되며, LG 생리학을 연구할 새로운 시험관 내 모델을 제공합니다.

서론

눈물샘(LG)은 눈물막의 수층을 생성하는 데 필수적이며, 이는 안구 표면 항상성¹을 유지하는 데 필수적입니다. 손상이나 염증으로 인한 LG 기능 장애는 수성 결핍성 건조안증(ADDE)을 초래합니다. 이 상태는 심한 안구 표면 염증, 만성 각막 질환, 심한 경우 영구적인 시력 상실로 이어질 수 있습니다². 현재 ADDE 치료는 주로 증상 관리에 그치며, 기저 샘 기능 장애는 다루지 않아 장기적 효능이 제한됩니다.^1. LG 기능 장애에 대한 표적 치료법 개발은 장기적이고 간단한 시험관 내 모델의 부재 등 여러 도전 과제를 제시하고 있으며, 이는 LG 병태생리에 대한 이해를 제한하고 효과적인 치료법 개발을 저해합니다. 세포 이식이 LG 재생을 촉진하는 잠재력을 보여주었지만, 시험관 내 세포의 제한된 증식 능력과 기존 배양 시스템의 복잡성은 임상 적용에 큰 장애물이 됩니다 ^1,3. 따라서 성체 쥐 LGs에 대한 간단하고 장기적인 배양 시스템을 구축하는 것은 LG의 생리학과 병리학에 대한 이해를 진전시키고, LG 손상 수리 및 재생을 위한 신뢰할 수 있는 LG 줄기/전구세포 공급원을 제공하는 데 필수적입니다.

기존 체외 배양 시스템은 상당한 진전을 이루었지만, 여전히 주목할 만한 한계에 직면해 있습니다. 이들 방법 중 다수는 혈청 보충 배지를 사용하는데, 이는 배치별 변동성, 불명확한 성분, 섬유아세포 또는 중간엽 세포 오염 위험 등 여러 문제를 야기합니다 ^4,5,6,7,8. 더불어, 혈청 기반 시스템은 LG 질환의 병원성 기전 연구에 부적합하며, 면역^{거부 위험 가능성}으로 인해 세포 이식 치료에 도전이 됩니다. 이러한 한계에 대응하기 위해 쥐와 인간 모두에서 LG 상피세포(LGECs)를 배양하기 위한 여러 무혈청 방법이 개발되었습니다. 예를 들어, Ueda 등은 신생아 쥐에서 LGECs를 유혈청 없이 성공적으로 배양하는 방법을 사용했다^. 그러나 이 방법은 세포를 소배양을 통과시킬 수 없고, 충분한 LGECs를 얻기 위해 많은 신생아선이 필요하다는 점에서 제한이 있었습니다. 마찬가지로 고바야시 등은 콜레라 독소를 이용해 혈청 없는 배양 시스템을 개발했으나,¹¹번 통과 중 세포 형태를 유지하는 데 어려움을 겪었다. 최근 발전으로는 Zhang 등은 쥐 LG 줄기세포용 3D 배양 시스템 개발과 Bannier-Hélaouët 등은 쥐와 인간을 대상으로 한 LG 오가노이드 배양 시스템 개발(12,13,14,15)이 있습니다. 하지만 이러한 시스템은 여러 소분자, 성장 인자, 첨가제가 포함된 복잡한 배지 제형에 의존하여 배양 과정을 복잡하게 만들고 확장성을 제한합니다. 이러한 도전 과제는 LGECs의 증식 및 줄기/전구적 특성을 유지하면서도 증식성 및 줄기/전구세포 특성을 유지하여 추가 치료 응용과 연구를 가능하게 하는 단순화되고 효과적인 혈청 없는 배양 시스템의 필요성을 강조합니다.

최근 몇 년간 소분자 매개 화학적 재프로그래밍의 급속한 발전으로 1^차 성인 세포를 시험관 내에서 유지 및 확장하는 새로운 전략이 도입되었습니다. 세포 내 신호 전달 경로, 세포-기질 상호작용, 세포 부착을 조절함으로써 소분자는 세포 증식과 가소성을 크게 향상시켜 세포 확장 효율과 운명 조절을 향상시킵니다¹⁷. 소분자는 생산 조절 가능, 낮은 면역원성, 비유전체 통합 특성 덕분에 성인 상피세포를 증식하는 시험관 내 시스템 구축에 이상적입니다¹⁶. 다양한 소분자의 조합은 피부, 각막, 결막 상 피 줄^{기세포 등} 다양한 1차 세포 유형의 시험관 내 확장을 효과적으로 유지하는 것으로 나타^{났습니다.} 따라서 LGECs 확장을 위한 소분자 기반 전략 개발은 연구 및 치료 환경 모두에서 미래 응용의 잠재력을 보여줍니다.

이 프로토콜에서는 두 가지 소분자인 Y27632와 SB431542 (2C)를 사용하여 LGEC의 확장을 지원하기 위해 간단하고 효율적인 혈청 무첨가 배양 시스템이 개발되었습니다. 이 두 분자의 장점을 결합하여 2D 및 3D 배양 모두에서 혈청 없는 시스템이 확립되었습니다. 2C로 배양된 LGEC는 높은 증식 능력과 줄기/전구세포 특성을 보였으며, 최소 10회 이상의 시험 관 통과 후에도 전형적인 상피세포 형태를 유지하였습니다. 3D 배양에서 LGEC는 줄기세포/전구세포의 특징을 유지했을 뿐만 아니라, 2C가 제거된 후에도 분비 구조로 분화하여 분비 기능을 가진 미세선체 구조를 형성하는 능력을 보였다. 이 혈청 없는 시스템은 LG 생리학 및 병리학의 시험관 내 모델에 적합하며, LG 조직 공학 및 재생 응용 분야에 상당한 세포 공급원을 제공합니다. 하지만 현재 프로토콜은 3D 문화에 대한 예비적 탐구만 제공합니다. 장기적인 3D 문화는 현재 이 연구의 범위를 벗어납니다. 이 방법은 성체 마우스 LGECs에 특화되어 있으며, 추가 최적화 없이는 다른 종에 적용되지 않을 수 있다는 점을 유의해야 합니다.

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프로토콜

모든 실험은 시각 및 안과학 연구 협회(ARVO)와 지림 대학교 및 샤먼 대학교 실험동물 윤리 위원회의 규정을 준수하여 수행되었습니다.

참고: 모든 세포 배양 절차는 세포 수술실의 자외선 멸균 생물안전 캐비닛에서 수행되었습니다.

1. LGEC의 1차 문화

LG 조직의 분리
1. 마취된 C57BL/6J 마우스(6-8주 된 경우)는 자궁경부 탈구로 안락사시키고, 귀 부위(LG 부위)는 오염을 방지하기 위해 75% 에탄올로 소독합니다.
2. 외안에서 귀 아래 피부까지 절개하여 LG를 노출시킵니다. 멸균된 매끄러운 겸자와 가위를 사용해 해리 현미경 아래에서 LG를 주변 조직(이하선과 결합조직)과 조심스럽게 분리하여 LG를 얻습니다.
3. LG를 1.5mL 마이크로 원심분리관 안에 미리 냉각된 조직 채집 배지(DMEM, 10% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신)에 넣고, 조직을 얼음 위에 올려 분해를 최소화합니다.
조직 준비
1. LG를 3.5cm 접시에 넣은 새로운 냉부 조직 채취 배지에 옮깁니다.
2. 남은 쥐 털을 제거한 후, LG를 둘러싼 결합조직 캡슐을 떼어내세요. 매끄러운 겸자를 사용해 소문 사이의 결합 조직을 분리해 분비선 조직을 분리하세요.
  참고: LG 표면의 캡슐과 엽 사이의 결합 조직을 완전히 제거하여 엽 사이의 관을 노출시키고, 이는 이후 소화 과정에서 소화액의 침투를 용이하게 합니다.
3. 조직을 새로운 채집 배지로 옮기고 5-10분간 세척하여 오염을 방지하세요.
효소 소화
1. LGs를 소화액(혈청 무첨가 배지에 2 mg/mL 디스파제 II와 2 mg/mL 콜라겐제 A를 보충)이 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 넣습니다. (보충표 1)
  참고: 4개의 LG에 필요한 소화액 1mL가 필요합니다.
2. LG 조직을 미세한 가위로 관 안에서 약 0.5-1 mm³ 크기의 작은 조각으로 미세하게 해부합니다.
3. 마이크로 원심분리관을 37°C에서 5%_CO2 와 함께 2.5-3시간 배양하세요. 30-60분마다 조직을 소화액에 부드럽게 섞어 효소 소화를 충분히 하도록 하세요.
LGECs 분리와 수확
1. 소화 시간이 끝나면 마이크로 원심분리기 튜브를 여러 번 흔들 수 있습니다. 소화 용액을 여러 번 피펫으로 돌려 조직을 단일 세포 또는 작은 세포 덩어리로 분해합니다. 소화 진행 상황을 현미경으로 관찰하세요.
  참고: 소화 용액 내에 보이는 입자가 남아 있지 않고 현미경으로 많은 수의 단일 세포와 관과 같은 세포 집합체가 관찰되면 소화 과정을 중단하세요.
2. 튜브를 300 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리한 후 소화 배지를 버립니다.
3. 세포 펠릿을 멸균 DPBS 1mL에 재현탁한 후, 1000 x g 에서 상온에서 3분간 원심분리하여 남아 있는 소화 효소를 제거합니다.
4. 1.4.3 단계를 반복하여 상원액을 제거하고 세포 펠릿을 500 μL 무혈청 배지에 재현탁합니다.
LGECs 파종 및 1차 배양
1. 혈청 무첨가 배지에 1% 페니실린-스트렙토마이신과 2C(10 μM Y27632 및 10 μM SB431542)를 보충하여 LGECs 배양 배지를 준비합니다. (보충표 1)
2. 세포를 7.5 x 10³ 세포/cm² 밀도의 표준 24웰 배양판에 혈청 무첨가 2C 배지를 사용해 씨앗을 심습니다.
3. 씨앗을 뿌린 후에는 배양판 가장자리를 부드럽게 두드려 세포 분포를 고르게 합니다. 플레이트를 5%_CO2가 포함된 37 °C 인큐베이터에 넣으세요.
4. 파종 후 72시간 후에 배양지를 처음 교체하세요. 그 후에는 매체를 2-3일마다 바꾸세요.
  참고: 처음 72시간 동안 배양을 방해하지 마세요. 첫 배지 교체 시에는 세포를 DPBS로 세척하지 마세요. 기존 배지를 제거하고 새 배지를 넣으면 됩니다.

2. LGEC의 하위문화

참고: 세포 합류율이 80-90%에 도달할 때 서브배양을 하며, 이는 일반적으로 1차 배양 후 약 14일 후에 발생합니다.

배양지를 제거하고 멸균 DPBS로 세포를 부드럽게 두 번 세척하세요.
0.25% 트립신-EDTA 250 μL 첨가 후 37°C에서 5%_CO2 와 함께 10-15분간 배양합니다. 촘촘한 접합부가 해리되고 세포가 반올려지면, 같은 양의 정의된 트립신 억제액을 추가하여 소화를 종료합니다.
참고: 1차 배양 중 평평하고 큰 부착 세포가 관찰된 경우, 0.25% 트립신-EDTA를 5분간 처리하여 이질적인 세포를 제거하세요. 그 후 0.25% 트립신-EDTA를 추가로 5분간 처리하여 추가 소화하고 이후 통과를 위한 더 순수한 LGECs 집단을 얻습니다.
세포 현탁액을 1mL 피펫으로 피펫팅하여 혼합한 후, 1.5mL 원심분리관으로 옮겨 1000 x g 의 원심분리기를 실온에서 3분간 가열합니다. 상원액은 버리세요.
멸균 DPBS로 셀을 세척한 후 다시 원심분리기로 LGEC를 수집하세요.
LGEC를 2C 배양 배지에 재현탁하여 1:2 비율로 씨앗을 주어 아부 배양합니다. 배양판을 흔들어 세포를 부드럽게 섞고, 37°C에서 5%_CO2와 함께 배양합니다.
참고: 1:2 비율로 서브컬처링할 때, 세포 합류율이 80-90%에 도달하면 LGEC가 한 웰 플레이트에서 분해되어 두 개의 새로운 웰 플레이트에 균등하게 분포됩니다.
파종 후 3일째에 배지를 바꾸고, 세포 상태에 따라 2-3일마다 배지를 교체하세요.
매일 반위상 대비 현미경으로 세포 형태를 관찰하고 사진으로 기록하세요.

3. LGEC의 3차원(3D) 배양

참고: 3D 배양 실험은 P1 LGEC를 사용합니다. P1 LGEC가 2C와 7일간 배양한 후 80-90% 합류에 도달하면 3D 배양에 사용됩니다.

준비 단계
1. 매트릭스 젤(보충표 1)을 -20°C 냉동고에서 4°C 냉장고로 옮겨 하룻밤 해동합니다.
2. 적절한 예냉을 위해 필요한 피펫 팁을 -20 °C 냉동고에 넣으세요.
3. 3D 배양을 시작하기 전에 24 웰 배양판을 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에 2시간 동안 예열합니다.
4. 아이스 박스를 준비하고 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 여러 개를 넣어 예식하세요. 사용 전에 바이오세이프티 캐비닛에서 아이스박스를 소독하세요.
LGEC의 3D 문화
1. 2.1단계부터 2.4단계까지 설명된 P1 LGEC를 얻습니다.
2. 세포 펠릿을 2C 배양 배지에 재현탁하고, 세포 밀도를 10 μL당 1× 10⁴ 세포로 조절합니다.
3. 4 °C 냉장고에서 해동한 매트릭스 젤과 -20 °C 냉동고에서 미리 냉각된 피펫 팁을 가져와, 바이오 안전 캐비닛 안의 아이스박스에 넣으세요.
4. 인큐베이터에서 예열된 24웰 배양 플레이트를 분리하여 생물안전 캐비닛에 넣으세요.
5. 적절한 양의 세포 현탁액을 매트릭스 젤과 1:1 비율로 혼합하고, 미리 냉각된 피펫 팁을 사용해 추가합니다. 고르게 분포되도록 부드럽게 섞으세요.
6. 3.2.5단계에서 혼합물을 20 μL를 예열된 24웰 플레이트의 각 웰 중앙에 조심스럽게 피펫 주입합니다.
7. 플레이트를 뒤집어 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 30분간 배양하여 매트릭스 겔이 굳어질 때까지 기다립니다.
8. 매트릭스 겔이 굳어지면, 각 웰에 600 μL 2C 배양지를 추가합니다.
9. 배양 플레이트를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 14일간 배양합니다. 배지를 파종 후 3일째부터 2-3일마다 교체하세요. 세포 상태에 따라 다릅니다.
10. 매일 역위상 대비 현미경으로 3D 구형 형성을 관찰하고 기록을 위한 이미지를 촬영합니다.
3D LGEC 구체의 구분
1. 3.2단계에서 설명한 3D LGEC 구형 배양.
2. 7일간 배양 후 2C 배양지를 제거하고 세포를 DPBS로 부드럽게 두 번 세척하여 잔여 2C를 제거합니다. 매트릭스 젤을 건드리지 않도록 주의하세요.
3. 2C(Null) 없는 혈청 무첨가 배지를 추가하고 7일간 추가 배양하여 분화를 유도합니다.
4. 배양 기간 동안 매체를 2-3일마다 교체하세요.
5. 매일 반위상 대비 현미경 아래에서 유도된 3D 구형체의 형태학적 변화를 관찰하고, 기록을 위해 이미지를 촬영합니다.

4. 차별화된 3D LGEC 구체의 임베딩 및 냉동 단면

참고: 3차원 구형의 분화는 3.3절에 설명된 대로 유도됩니다. 7일간의 분화 후, 아래 단계를 따라 최적의 절단 온도(OCT) 삽입과 분화된 3D 구상체의 냉동 절단을 진행하세요.

우물 가장자리를 따라 배양지를 흡입하세요. 분화된 구형체를 멸균된 DPBS로 세 번 부드럽게 세척하세요.
생물안전 캐비닛이나 훈기장에 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL를 웰에 넣고, 구체를 실온에서 10분간 고정합니다.
구형을 멸균된 DPBS로 세 번 부드럽게 세척하고, 각 세척은 10분간 지속하여 고정제를 제거합니다.
주걱을 사용해 3D 구형 매트릭스 젤 돔 같은 구조물을 조심스럽게 긁어내어 20% 자당 용액이 담긴 5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
돔 구조가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
자당 용액에서 돔 구조를 제거하고, 잔여 자당을 조심스럽게 제거한 후 OCT 화합물에 박습니다. 액체 질소에 냉동하여 -80°C에서 보관하세요.
염색 전에 냉동 미세절기를 사용해 두께 10μm 크기의 단면을 준비합니다.

5. 분화 3D LGEC 구형의 분비 함수 검출

샘플 채취
1. 3.3절에 설명된 3차원 구형의 분화를 유도합니다.
2. 7일간의 분화 후 배양지를 제거하고 3D 구체를 DPBS로 세 번 세척합니다.
3. 2C 없이 500 μL 무혈청 배지를 추가하고 37°C에서 5%_CO2 와 함께 2시간 배양합니다.
4. 배양지를 채취하여 1.5mL 마이크로 원심분리관에 기초 샘플로 옮겨 필로카르핀 자극 전에 락토페린(LTF) 농도를 측정합니다.
5. 3D 구상체를 멸균된 DPBS로 세 번 부드럽게 세척하세요.
6. 필로카르핀 1 μg/mL가 포함된 무혈청 배지 500 μL를 추가하고, 3D 구상체를 37°C에서 5%_CO2 와 함께 24시간 배양합니다.
7. 배양 후에는 배양지를 1.5mL 마이크로 원심분리관에 수집하여 필로카르핀 자극 후 LTF 농도 측정을 수행합니다.
8. 수집한 배양지를 4°C, 1000 × g에서 20분간 원심분리합니다. 상정액을 채취하여 -80 °C에 보관하여 나중에 사용하세요.
샘플 희석
1. -80 °C 냉동고에서 샘플을 꺼내 상온에서 완전히 해동시키세요.
2. 샘플 5 μL를 추출하여 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 키트에서 추출한 495 μL 샘플 희석 버퍼로 희석하여 100배 희석액을 준비합니다.
시약 준비
1. ELISA 키트의 모든 시약은 사용 20분 전에 실온에 보관하세요.
2. 세척 완충제 준비: 샘플 수를 기준으로 필요한 양을 계산하고, 농축된 세척 완충제를 증류수(1:24)로 희석합니다.
3. 표준 작동 솔루션 준비:
  1. 동냉 건조 표준액을 10,000 × g에서 1 분간 원 심분리합니다. 기준 표준 및 샘플 희석제 1mL를 넣고 10분간 두었다가 부드럽게 여러 번 뒤집으세요.
  2. 완전히 녹은 후에는 피펫으로 충분히 섞으세요. 이 재구성은 2000 pg/mL의 작동 용액을 생성합니다.
4. 키트 설명서에 따라 다음 표준 농도 구배를 준비하기 위해 연속 희석을 하세요: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 0 pg/mL.
5. 비오티닐화 검출 항체 작동 용액을 준비하세요:
  1. 분석에 필요한 부피(50 μL/well)를 계산합니다. 농축된 바이오티닐화 검출 항체를 800 × g 에서 1분간 원심분리한 후, 50× 농축된 바이오티닐화 검출 항체를 비오티닐화 검출 항체를 1× 작용액으로 희석하여 희석합니다.
  2. 사용 직전에 용액을 준비하여 계산량보다 약간 더 만들고, 보통 필요 이상으로 100-200 μL 더 첨가합니다.
6. 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합 작용 용액을 준비하세요:
  1. 실험에 필요한 부피(50 μL/웰)를 계산합니다. 농축된 HRP 공액액을 800× g에서 1 분간 원 심분리한 후, HRP 공액 희석제로 1배 농도로 희석합니다.
  2. 사용 직전에 용액을 준비하여 계산량보다 약간 더 만들고, 보통 필요 이상으로 100-200 μL 더 첨가합니다.
ELISA 분석 절차
1. 희석된 표준, 빈 샘플, 샘플의 웰을 결정하고, 각 샘플에 대해 3개의 복제를 수행하세요. 표준 작업 용액, 빈액 또는 희석된 샘플 용액 25 μL를 해당 웰에 추가합니다. 키트에 포함된 밀봉제로 플레이트를 덮고 37°C에서 90분간 배양하세요.
  참고: 용액은 마이크로 ELISA 플레이트 웰 바닥에 첨가해야 합니다. 안쪽 벽을 만지면 거품이 생기는 것을 최대한 피하세요.
2. 세척하지 않고 우물에서 액체를 디캔트하세요. 즉시 각 웰에 50 μL 비오티닐화 검출 항체 작용액을 첨가합니다. 플레이트를 새 실러로 덮고 37°C에서 60분간 배양하세요.
3. 각 웰에서 액체를 디캔트하고 각 웰에 350 μL의 준비된 세척 버퍼를 추가합니다. 1분간 담근 후 각 웰에서 액체를 흡입하거나 디캔트한 후 깨끗한 흡수지로 닦아주세요. 이 세척 과정을 3번 반복하세요.
  참고: 세척 과정 중 우물이 마르지 않도록 하세요.
4. 각 웰에 준비된 HRP 공액액 50 μL을 추가합니다. 플레이트를 새 실러로 덮고 37°C에서 30분간 배양하세요.
5. 우물에서 액체를 디캔트한 후, 5.4.3단계에서 설명한 세척 완충제와 함께 세척 과정을 다섯 번 반복합니다.
6. 각 웰에 50 μL 기질 시약을 추가합니다. 플레이트를 새 밀봉제로 덮고 37°C에서 어두운 곳에서 15분간 배양하세요.
7. 각 웰에 25 μL의 정지 용액을 추가하여 반응을 종료합니다. 정지 용액이 기판 용액과 같은 순서로 첨가되도록 하세요.
8. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 각 웰의 광 밀도(OD 값)를 450 nm에서 즉시 측정합니다.

6. RNA 분리

샘플 채취
1. LG 조직에 대해
  1. 1.1.2-1.1.2절에 설명된 대로 성체 쥐에서 눈과 외 LG 조직을 분리합니다.
  2. 새로 분리한 LG 조직을 PBS에 담가 혈액을 씻어내세요.
  3. LG 표면의 수분을 필터 페이퍼로 얼린 채 1.5mL 마이크로 원심분리관에 1mL RNA 추출 시약(보조표 1)을 넣은 채 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
    참고: RNA 추출 전에 조직의 완전한 용해를 보장하기 위해 분쇄 단계를 수행하세요.
  4. 마이크로 원심분리기 튜브에 깨끗한 강철 연삭 비드 두 개를 추가한 후, 튜브를 미리 냉각된 고속 저온 연쇄기에 넣습니다.
  5. 그라인더 파라미터를 설정하세요: 주파수 70Hz, 분쇄 시간 45초, 일시정지 15초, 그리고 10사이클 반복. 그라인더의 캡 손잡이를 조이고 분쇄를 시작하세요.
  6. 튜브를 얼음 위에 올리거나 -80 °C에서 보관하여 분쇄 과정이 끝난 후 후속 RNA 추출을 마시면 됩니다.
2. LGEC를 위해
  1. 배양지를 제거하고 LGEC가 80-90% 합류할 때 멸균 DPBS로 세포를 세 번 세척합니다.
  2. 각 웰에 600 μL RNA 추출 시약을 추가하고(24웰 플레이트용), 실온에서 5-10분간 배양합니다.
  3. 1mL 피펫을 사용해 각 웰의 RNA 추출 시약 용액을 반복적으로 피펫팅하여 완전한 세포 용해를 보장합니다.
  4. 용액을 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
  5. 튜브를 얼음 위에 올리거나 -80 °C에 보관하여 이후 RNA 추출을 하세요.
3. 3D LGEC 구형에 대해
  1. 3.2-3.3 단계에 설명된 대로 14일간 배양한 미차별 및 분화 3D LGEC 구상체를 수집합니다. 각 웰에 1mL의 소화용액(1 mg/mL Dispase II를 포함한 무혈청 배지)을 추가하여 3D 구형 매트릭스 젤 돔 형태 구조가 완전히 덮이도록 합니다. 37°C에서 5%_CO2 와 함께 30분간 배양하세요.
  2. 3D 구형체가 포함된 소화액을 1 mL 피펫을 사용해 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 원심분리기로 1000 × g에서 3분간 구형 펠릿을 수집합니다.
  3. 펠릿을 1mL DPBS로 세척하고 1000 × g 에서 원심분리기로 3분간 세척하여 다시 펠릿을 수집하세요.
  4. 600 μL RNA 추출 시약(매트릭스 겔 20 μL당 1)을 추가하고 실온에서 5-10분간 배양합니다.
  5. 3D 구상체가 완전히 용해되도록 1 mL 피펫을 사용해 완전히 혼합하세요.
  6. 튜브를 얼음 위에 올리거나 -80 °C에 보관하여 이후 RNA 추출을 하세요.
RNA 추출
참고: 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 마스크)를 착용하고, 클로로포름과 이소프로판올이 관련된 모든 시술을 훈기 후드에서 수행하십시오. 화학 폐기물 흐름은 기관의 폐기물 처리 프로토콜을 준수하여 유해 폐기물 생성용으로 지정된 유해 용기에 폐기합니다.
1. RNA 추출 시약(6.1단계부터)에 RNA 샘플이 담긴 원심분리관에 클로로포름(RNA 추출 시약 1/5 부피)을 첨가합니다.
  참고: 시술은 훈 후드에서 진행하세요.
2. 소용돌이를 사용해 충분히 혼합한 후 상온에서 10분간 배양하다가 상상 분리가 일어납니다.
3. 원심분리기 14,000 x g 기준 4°C에서 10분간 가열.
  참고: 원심분리 후 액체는 세 층으로 분리되며, RNA는 가장 상층의 투명한 수상에 있습니다.
4. 새로운 1.5mL RNase 프리 원심분리관을 준비하고, 이소프로판올(RNA 추출 시약의 절반 부피)을 연기 후드에 추가합니다.
5. 가장 위쪽의 투명 수용상(RNA 추출 시약 부피의 절반)을 조심스럽게 새로운 RNase 프리 튜브에 삽입합니다.
  참고: 피펫팅 시 중간 층을 오염시키지 않도록 주의하세요.
6. 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합하고 실온에서 10분간 배양하세요. 그 후 다시 14,000 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다.
7. 상정액은 버리고 75% 에탄올 500 μL를 넣어 튜브를 뒤집어 펠릿을 세척합니다. 다시 14,000 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리합니다.
8. 6.2.7단계를 반복합니다. 상원액을 버리고 잔여액을 빠르게 원심분리하여 제거하세요.
9. 튜브를 연기 후드에 얼음 위에 올려놓고 뚜껑을 열어 10-20분 동안 자연 건조시켜 흰색 펠릿이 반투명해질 때까지 기다립니다.
10. RNase가 없는 물 20 μL을 추가하여 펠릿을 녹입니다. 분광광도계를 사용해 RNA 농도와 순도를 측정합니다.
  참고: RNA 농도가 너무 높으면 적절한 양의 RNase 무첨가 물로 희석하세요.
11. RNA 용액을 얼음 위에 올리거나 -80°C에 보관하여 후속 역전사 과정을 진행합니다.

7. 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)

역전사
1. 제조사 지침에 따라 다음 성분들을 PCR 반응관에 순차적으로 추가하세요: 총 RNA 800 ng(농도에 따라 부피 계산), q-PCR용 5x 올인원 슈퍼믹스 4 μL , gDNA 제거제 1 μL, RNase 무첨가 물로 총 부피를 20 μL로 만듭니다.
2. 성분을 부드럽게 섞으세요. PCR 기계를 다음 조건으로 설정하세요: 55 °C에서 6분, 80 °C에서 1분, 그리고 12 °C로 무한정 유지.
3. cDNA는 -20°C에 보관하거나 역전사 반응이 완료된 후 qRT-PCR 과정을 위해 얼음에 보관합니다.
qRT-PCR
1. qRT-PCR 프리믹스 용액을 다음과 같이 준비합니다: 2x Green qPCR SuperMix 5 μL, 포워드 프라이머 0.2 μL (10 μM), 리버스 프라이머 0.2 μL (10 μM), 그리고 뉴클레아제 무첨가물 3.6 μL 부드럽게 섞어 얼음 위에 올려놓으세요.
2. 실험 설계에 따라 qRT-PCR 전혼합물 9 μL(7.2.1단계에서 준비됨)과 1 μL cDNA(7.1단계에서 준비됨)를 qRT-PCR 튜브에 추가합니다.
3. 관을 실온에서 1000 × g 에서 2분간 원심분리하세요.
4. 탐지하기 위해 튜브를 형광 정량 PCR 기계에 넣으세요.
  참고: 시약 제조사의 지침에 따라 다음 프로그램에 따라 3단계 방법을 사용하세요: 94 °C에서 30초, 94 °C에서 5초, 60 °C에서 15초, 72 °C에서 10초. 2단계부터 40-45 사이클로 순환 진행하세요.
5. 비교 CT 방법(^2-ΔΔCt)을 사용하여 정량 분석을 수행합니다.
  참고: 각 데이터셋은 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 최소 세 번의 독립적인 반복 검사가 필요합니다.

8. 면역형광 염색

참고: 면역형광 염색은 24웰 플레이트에서 70-80% 합류율을 가진 LGECs나 분화된 LGECs 3D 구조의 냉동 절편에서 수행됩니다.

LGEC를 위해
1. 웰에서 배양지를 제거하고 세포를 PBS로 세 번 세척하세요.
2. 생물안전 캐비닛이나 훈기후드의 각 웰에 4% PFA 500 μL 첨가하여 실온에서 15분간 배양하여 세포를 고정합니다.
3. 세포를 PBS로 세 번 세척하고, 각 세척은 5분씩 지속하세요.
4. 세포를 덮기 위해 0.2% Triton X-100 500 μL 첨가한 후, 실온에서 20분간 배양하여 세포막을 투과시킵니다.
5. 셀을 PBS로 세 번 세척하고, 각 세척은 10분씩 지속하세요.
6. PBS를 제거하고 면역조직화학 마커를 사용해 24웰 플레이트의 각 웰 주위에 원을 그립니다. 각 웰에 2% BSA 50 μL을 추가하여 셀을 덮습니다. 실온에서 1시간 배양해 블로킹을 하세요.
7. BSA를 제거하고 희석된 1차 항체 50 μL을 추가하여 LGEC를 덮습니다. 4°C에서 16-18시간 배양하세요.
8. 1차 항체를 제거하고 8.1.5 단계를 반복합니다.
9. 각 웰에 50 μL의 형광 2차 항체를 추가하여 LGEC를 덮습니다. 실온에서 어두운 환경에서 1시간 동안 배양하세요.
10. 8.1.5 단계를 반복하며 빛에 노출되지 않도록 하세요.
11. LGEC를 덮기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 용액 50 μL을 추가하고 형광 현미경으로 염색 상태를 관찰합니다.
3D LGEC 구형에 대해
1. 4단계에서 설명한 3D LGEC 구형 냉동 단면을 준비합니다. 8.1.2-8.1.11 단계에 명시된 면역형광 염색을 수행합니다.

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결과

2C를 사용하여 혈청 없는 LGECs 배양 시스템을 구축합니다
이 프로토콜의 목표는 1차 마우스 LGEC를 확장하기 위한 더 단순하고 효율적인 배양 시스템을 구축하는 것이었습니다. 광범위한 스크리닝 후, Y27632와 SB431542만으로 이루어진 혈청 무첨가 2C 조합이 성공적으로 개발되어 LGEC의 장기 시험관 내 확장이 가능해졌습니다. 혼합 효소 소화 후, 1차 LGEC가 2C로 3일간 배양한 후 부착하여 다중 세포 클론을 형성하기 시작했습니다(데이터는 표시되지 않음). 처음 3일은 LGEC 문화에 있어 매우 중요한 시기입니다; 이 기간 동안의 교란은 클론 형성에 큰 영향을 미치고 LGEC의 확장 실패를 초래하므로 피해야 합니다. 2C로 12일간 배양한 후, 클론들은 점차 융합되었고, 세포들은 잘 조직된 상피 형태와 단단한 세포 간 연결을 보였다. 반면, 2C가 없는 대조군(Null)은 불규칙한 형태를 가진 부착...

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토론

서론에서 설명한 바와 같이, 최근 몇 년간 LG 세포를 위한 여러 무혈청 배양 시스템이 개발되었습니다¹⁰^, ¹¹^, ¹²^, ¹³. 그러나 많은 방법들은 세포 증식이 부족하고 시험관 내에서 대규모 증식을 달성하지 못하는 등 한계가 ^{있습니다.} 더욱이 최근 혈청 없는 LG 줄기세포 및 오가노이드 배양 시스템은 다양한 첨가물을 포함하는 복잡한 제형에 의존해 배양 조건을 불필요하게 복잡하게 만들었습니다 12,13,14,15.

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학기금(82471048, 82271045); 선전 과학기술 프로그램(JCYJ20240813145510014); 길림성 보건연구인재 특별 프로젝트(2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); 그리고 지린성 과학기술발전계획 프로젝트(YDZJ202601ZYTS389)를 포함합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
-20° C 초저온 냉장고	하이얼
-80° C 초저온 냉장고	하이얼
0.25% 트립신-EDTA	깁코	25200056
1.5 mL 마이크로 원심분리관 및 nbsp;	키르겐	KG2211	RNASE 없는 것
35mm 세포 배양 접시	랩셀렉트	12111
4 & deg; C 냉장고	하이얼
4% 파라포름알데히드 (PFA)	서비스바이오	G1101
4'6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)	예센	708939ES03	-20도에서 저장하세요; C, 1 mg/mL로 500배 스톡, 1배 PBS로 희석해
5 mL 원심분리관 및 nbsp;	ACMEC	AC17457
50mL 원심분리기 튜브 & nbsp;	랩셀렉트	CT-002-50-SS
항알파 평활근 액틴 토끼 항체	앱캠	AB5694	항체 희석 버퍼로 1:100 온도로 희석;
항-AQP5 토끼 항체	그리고 nbsp; 복종	A9927	항체 희석 버퍼로 1:100 온도로 희석;
항사이토케라틴 14 토끼 항체	앱캠	AB181595	항체 희석 버퍼로 1:200 & nbsp 기준으로 희석;
항사이토케라틴 19 토끼 항체	앱캠	AB52625	항체 희석 버퍼를 1:400 로 희석;
항-Ki67 토끼 항체	앱캠	AB16667	항체 희석 버퍼로 1:200 & nbsp 기준으로 희석;
생물안전 캐비닛	스테릴가드
소 혈청 알부민(BSA)	예센	36101ES60	4°에서 보관하세요; C
C57BL/6J 마우스	샤먼대학교 실험동물센터
세포 배양 플레이트	랩셀렉트	11312	24-우물
세포 인큐베이터	에펜도르프
원심분리기	에펜도르프
클로로포름	허시	10006818	주의, 연기함 작업 시
CO₂ 상온 인큐베이터	에펜도르프
콜라게나제 A	로슈	10103586001	-20도에서 저장하세요; C, 200 mg/mL 스톡, 100배
정의된 트립신 억제제 용액(DTI)	깁코	R007100
DermaLife K 케라티노사이트 미디엄 컴플리트 키트 (세럼 프리 미디엄) 및 nbsp;	라이프 라인	LL-0007	4 & deg; C
D-행크스	바이오샤프	BL559A	Dispase II 희석에 사용됨
디메틸설옥사이드(DMSO)	시그마	D4540	Y27632 희석에 사용SB431542
디스파즈 II	시그마	D4693	-20도에서 저장하세요; C, 200 mg/mL 스톡, 100배
DMEM 기본 (1배)	깁코	C11995500BT
당나귀 항-래빗 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488	인비트로젠	A-21206	항체 희석 버퍼로 1:300 기준으로 희석하세요
둘벡코의 인산염 완충 생리식염수 (DPBS)	서비스바이오	G4200
에탄올 절대	허시	10009218	주의: 다른 에탄올 희석물 조제에 사용 및 nbsp;
동결 미세토움	라이카
고속 저온 그라인더	서비스바이오
역형광현미경	라이카
역현미경	올림포스
이소프로판올	허시	80109270
레이저 주사 공초점 현미경 FV3000	올림포스
저온 고속 원심분리기	에펜도르프
LTF 효소 결합 면역흡착 검사법(ELISA) 키트	일러브사이언스	E-MSEL-M0047	-20도에서 저장하세요; C
매트릭스 젤 (마트리젤)	82703	모겐겔	-20 & deg에서 알리코트를 사용하고 저장합니다; C
마이크로피페터	에펜도르프
마이크로플레이트 리더	써모피셔 사이언티브
뉴클레아제 없는 물	바이오샤프	BL510B
OCT 복합물	사이젠	4586
PBS, 1× (pH7.4)	서비스바이오	G4202
PCR 증폭기	바이오-래드
페니실린-스트렙토마이신	바이오샤프	BL505A
페니실린-스트렙토마이신-암포테리신	바이오샤프	BL142A
퍼펙트스타트 그린 qPCR 슈퍼믹스 키트	트랜스젠 바이오텍	AQ601-01-V2	-20도에서 저장하세요; C
퍼펙트스타트 대학교 RT& qPCR 키트	트랜스젠 바이오텍	AUQ-01	-20도에서 저장하세요; C
필로카르핀	알라딘	P424663	-20도에서 저장하세요; C, 2500x
프라이머 AQP5 순서: 앞쪽: CATGAACCCCCCCGATC TT 뒷면: CTTCTGCTCCCATCAT CC	상곤 바이오텍
프라이머 K14 순서: 앞쪽: CCCACCTTTCATCTTCC CAATT 뒷면: AAGCCTGAGGCATGTAGCAG	상곤 바이오텍
프라이머 K15 순서: 앞쪽: GAGGTGGCGTCTACACA GA 뒷면: TCTGAGCCTCCATCTCAC AG	상곤 바이오텍
프라이머 K19 순서: 앞쪽: ATTACTGCCCTGAGGAGC CA 뒷면: TTCAGCTCTCAATCCGA GC	상곤 바이오텍
프라이머 K5 순서: 앞쪽: CTCAGAGCTGAGGACAT GC 뒷면: AGCTCCGCATCAAAGAAC AT	상곤 바이오텍
입문서: Ki67 순서: 앞쪽: ACCATCATTGACCGCTCC TT 후면: TTGACCTTCCCCATCAGG GT	상곤 바이오텍
프라이머 LTF 순서: 앞으로:CAGGAGCCAACAAATGTG CC 리버스:TTGTACTGGTCCCTTTCG GC	상곤 바이오텍
프라이머 P63 시퀀스: 앞쪽: ATGTCACCGAGGTTGTG AAA 뒷면: GAATTCAGTGCCAACCTGTG	상곤 바이오텍
프라이머 SOX10 순서: 앞쪽: ATCAGCCACGAGGTAATG TCCAAC 뒷면: ACTGCCCAGCCCGTAGCC	상곤 바이오텍
프라이머 &α;-SMA 순서: 앞쪽: CTCCCTGGAGAAGAGCTA CG 뒷면: CGCTGACTCCATCCCAAT GA	상곤 바이오텍
실시간 형광 정량 PCR 기기	로슈
RNA 이소레이터 총 RNA 추출 시약	바지임	R401-01	주의, 연기함 작업 시
SB431542	에이펙스바이오	A8249	-20도에서 저장하세요; C, 20 mM 스톡, 2000배
분광광도계 나노드롭 1000	써모피셔 사이언티브		RNA 농도 측정
자당	맥클린	S818046	증류수로 녹이세요
트리톤 X-100	솔라비오	T8200
초순수 정수 시스템	밀리포어
범용 항체 희석 버퍼	에피자임	PS119	4 & deg; C
Y27632	에이펙스바이오	B1293	-20도에서 저장하세요; C, 20 mM 스톡, 2000배

참고문헌

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마우스 눈물샘 상피 세포를 배양하기 위한 두 개의 소분자로 구성된 새로운 혈청 프리 2D 및 3D 배양 시스템입니다

이 논문에서

요약

초록

서론

프로토콜

결과

토론

공개 사항

감사의 글

재료

참고문헌

재인쇄 및 허가

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