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방법 논문

형광 융합 단백질 기반 리포터를 이용한 세포 내 제노톡신 유도 PARP1/PARP2 활성화의 시각화 및 정량적 분석

374 조회수

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DOI:

10.3791/70497

⸱

2026년 4월 17일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Warren Alpert Medical School & Legorreta Cancer Center, Brown University, 2Department of Pharmacology & Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama

이 논문에서

요약

여기서는 고정된 포유류 세포에서 폴리(ADP-리보스)(PAR) 농축 초점의 세포 기반 시각화, 아세포 위치 및 정량적 분석을 기술합니다. 이 분석법은 제노톡신 노출 세포 핵에서 염기 절제 수리 또는 단일 가닥 절단 복구와 관련된 DNA 손상 유도 PARP 활성화 부위를 정량화할 수 있게 합니다.

초록

폴리(ADP-리보스)(PAR)는 ADP-리보스 중합효소 계열 효소의 네 가지 구성원—PARP1, PARP2, PARP5a, PARP5b—에 의해 합성되는 ADP-리보스 중합체의 중합체입니다. 하지만 DNA 단열에 반응하여 PAR을 합성하는 것은 PARP1과 PARP2뿐입니다. PAR은 단백질 번역 후 변형으로 정의되지만, DNA 또는 RNA 변형으로도 존재하는 것으로 밝혀집니다. PAR 수치는 PAR 당수분해효소인 PARG에 의해 추가로 조절되며, PARP1 및 PARP2와 함께 DNA 손상으로 인한 PAR의 세포 수준을 조절합니다. PAR의 동적 합성과 분해는 DNA 수리와 DNA 손상 반응에서 PAR의 조절 역할에 매우 중요하며, 이는 다시 염색질 재조직, 복제, 전사, 세포 사멸에 영향을 미칩니다. PARP1/PARP2 활성화와 PAR의 축적은 지속적인 염기 절제 수리 또는 DNA 단가닥 절단 복구 부위로 간주될 수 있습니다; 그러나 수많은 PARP1/PARP2 활성화제는 복제 스트레스 및 기타 DNA 대사 과정과도 연관되어 있습니다. 형성된 PAR 사슬은 PAR 결합 도메인(PBD)을 통해 DNA 손상 또는 유전체 손상 부위로 DNA 수리 및 DNA 손상 반응(DDR) 인자를 모집하는 것을 촉진합니다. 10개의 서로 다른 PBD는 PAR 결합 모티프, PAR 결합 아연 손가락, WWE 도메인, 매크로 도메인 등 다양한 영역을 인식합니다. PAR 역학의 세포 분석을 용이하게 하기 위해, 우리는 PBD를 증강 녹색 형광 단백질(EGFP)과 융합하여 세포 기반 PAR 초점의 정량 최적화를 수행하였습니다. 우리는 GBD/WWE 도메인을 암호화하는 RNF146 조각을 사용하여 유전체 손상 부위와 진행 중인 BER 또는 SSBR에서 PAR 축적을 시각화하고 정량화하는 검사법을 기술합니다. 렌티바이러스 입자 생성, 표적 세포주의 전도, 포유류 세포의 유전체 DNA 손상 유도 처리, 공초점 형광 현미경 촬영, 데이터 반자동 정량화 등 실험 단계를 설명합니다.

서론

이 프로토콜은 LivePAR 분석법을 설명하는데, 이는 포유류 세포에서 주로 염기 절제 수리(BER) 또는 단일 가닥 절단 복구(SSBR)와 관련된 유전체 손상 부위에서 폴리(ADP-리보스)(PAR)의 시각화 및 정량 분석을 가능하게 합니다. BER는 손상되거나 변형된 염기를 DNA에서 제거하는 중요한 DNA 수리 경로입니다(BER와 PARylation에 대한 리뷰는 4,5,6,7 참조). BER는 수정된 염기4를 인식하고 절단하는 DNA 글리코실라아제에서 시작하며, 예를 들어 메틸화된 염기인 8,9를 절단하는 메틸 퓨린 글리코실라아제(MPG)나 8-옥소과닌 글리코실라아제(OGG1)가 8-옥소과닌 글리코실라아제(AP)를 남겨 제거합니다. AP 부위는 AP 엔도뉴클레아제 1(APE1)11, 12, 13에 의해 절단되어 DNA 골격에 틈이 생깁니다. 중합효소, 즉 DNA 중합효소 β (Polβ)14,15가 손상되지 않은 가닥을 템플릿으로 사용하여 틈을 맞추고 채우며, 마지막으로 DNA 리가아제가 복구된 가닥16,17을 봉인합니다. 예를 들어 DNA 리가아제 I 또는 DNA 리게아제 III가 있습니다.

BER과 SSBR의 주요 원인은 폴리(ADP-리보스) 중합효소 1과 2(PARP1/PARP2)18,19,20으로, 이는 BER 또는 SSBR 과정에서 DNA 가닥 절단을 빠르게 감지하는 효소입니다. 이러한 절단을 감지하면, PARP1/PARP2는 NAD+를 가수분해하여 자신과 다른 단백질에 ADP-리보스 중합자를 첨가하는 과정을 촉매합니다(검토 참조,6 참조). 이로 인해 다른 DNA 수리 인자를 손상 부위로 끌어들여 DNA 수리의 정확도를 높여주는 동적 단백질 스캐폴드(PAR)가 형성됩니다. 이 역동적인 PAR 스캐폴드를 관리하기 위해, ADP-리보스-수용체 가수분해효소 3(ARH3), 말단 ADP-리보스 당화 수화분해효소 1(TARG1), 모노-ADP-리보실 가수화분해효소 1/2(MacroD1/2), 폴리(ADP-리보스) 당화분해효 소(PARG)6,21,22,23,24,25,26 등 여러 단백질이 PAR 사슬의 가수분해와 제거에 기여합니다 . 그러나 PARG는 이 과정을 주로 담당하며(21,27), DNA 손상 반응(DDR)28,29에서 중요한 역할을 합니다.

따라서 PARG는 PARP1과 PARP2의 기능과 매우 밀접하게 연관되어 있습니다. PARP1과 PARP2가 PAR 고분자를 생성하는 반면, PARG는 '정화' 효소 역할을 하여 이 고분자들을 가수분해하고 PARylation30,31을 효과적으로 역전시킵니다. 이 과정은 BER와 SSBR 모두를 완료하고, PARP1/PARP2가 새로운 DNA 손상에 반응하기 위해 재활용될 수 있도록 하는 데 필수적입니다. 따라서 PARP1, PARP2, PARylation, PARG는 협력하여 BER과 SSBR 4,6을 통해 효율적이고 가역적인 DNA 수리를 보장합니다.

PARylation의 정도는 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있으며, 전체 DNA 손상 반응에서 중요한 역할을 합니다32. 이러한 요인에는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 메틸 메탄설포네이트(MMS), 과산화수소(H2O2), 또는 삼부틸 하이드로퍼옥사이드(tBuOOH)와 같이 DNA 염기에 부가체를 첨가하는 제노톡신 노출이 포함됩니다. 더 나아가, PARylation의 정도는 NAD+의 전구체인 디하이드로니코틴아마이드 리보사이드(NRH)와 같이 PARylation 과정을 조절하는 분자에 의해 영향을 받을 수 있습니다. NRH는 NAD+ 수준을 높여 PARP 활성화를 촉진하고, FK866은 NAD+ 수치를 낮추고 PARP-활성화를 음의 조절 3을 할 수 있습니다. 마지막으로, PARP1/PARP2, PARG 또는 기타 DNA 수리 단백질(예: BER의 결함이나 BRCA1/BRCA2와 같은 상동 재조합 인자)의 유전적 돌연변이나 소분자 억제가 PARP 활성화를 변화시킬 수 있습니다.

LivePAR 분석은 WWE 도메인(아미노산 100–182)을 암호화하는 약지 단백질 146(RNF146)의 일부를 사용하며, 이 도메인은 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP)과 연결됩니다. WWE 도메인은 결합 부위37에 보존된 트립토판(W)과 글루타메이트(E)의 보존된 잔기에서 이름을 딴 구상 도메인입니다. WWE 도메인은 PAR 사슬 내에서 가장 작은 내부 구조 단위인 iso-ADP-리보스에 결합합니다38,39. RNF146은 E3 유비퀴틴 리게아제로, iso-ADP-리보스38,40을 인식하며, BER에 관여하는 단백질(XRCC1, DNA 리가아제, PARP1)을 표적으로 하여 프로테아좀 분해를 돕는 것으로 보고됩니다41. 이 WWE 도메인을 EGFP와 연결하면 포유류 세포에서 제노톡신에 의해 유도된 PARylation 부위의 시각화와 검출이 가능합니다. 이 프로토콜에서는 LivePAR 리포터를 발현하는 안정적인 세포주 생성(그림 1A), PARP1/PARP2를 활성화하기 위한 DNA 손상 유도, PAR 생성, 그리고 공초점 형광 현미경 데이터의 획득 및 분석(그림 1)을 설명합니다.

pMD2.g(VSVG) 플라스미드는 바이러스 외피 당단백질(VSVG)을 제공하여 바이러스가 감염할 수 있는 세포 범위를 기존 렌티바이러스 외피 단백질에 비해 확장합니다. pRSV-REV 플라스미드는 바이러스 RNA에 결합하고 바이러스 유전자의 전사를 활성화하는 중요한 트랜스액티브터인 조절 요소(REV) 단백질을 제공합니다; 효율적인 바이러스 복제에 필수적입니다. pMDLg/pRRE 플라스미드는 기질(MA), 캡시드(CA), 뉴클레오캡시드(NC) 단백질을 암호화하는 gag, 바이러스 복제와 숙주 세포 게놈에 통합되는 데 필요한 효소를 암호화하는 pol, 그리고 바이러스 RNA 번역 및 유전체 RNA 패키징의 효율을 높이는 RNA 조절 요소(RRE) 등 여러 핵심 내부 포장 구성 요소를 제공합니다. pLV-EF1A-LivePAR-Hygro 플라스미드(그림 1A)는 RNF146(아미노산 100–182) 도메인의 WWE 도메인 C-말단에 융합된 강화 녹색 형광 단백질(EGFP)을 암호화하는 cDNA를 포함하고 있으며, 이 단백질 도메인은 폴리(ADP-리보스) 사슬에 결합하며, 벡터는 하이그로마이신 저항성 카세트도 암호화합니다. 바이러스는 세포 배양 상원액에서 분리되어 -80 °C에서 보관하거나 즉시 전이(transduction)에 사용할 수 있습니다(그림 1B).

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프로토콜

1. 렌티바이러스 생성

참고: 이 프로토콜은 3세대 렌티바이러스 패키징 시스템인42,43을 사용하여 유전적으로 암호화된 PAR 리포터를 발현하는 세포를 생성합니다. 렌티바이러스 입자는 293FT 세포에서 외피, 조절, 포장 성분으로 구성된 4-플라스미드 시스템과 함께 EGFP 태그된 RNF146의 WWE 도메인을 암호화하는 pLV-EF1A-LivePAR-Hygro 구조체를 사용하여 생성되며, 이 구조물은 폴리(ADP-리보스) 사슬에 결합합니다. 생성된 바이러스는 PAR 축적의 시각화 및 정량화를 위한 안정적인 세포주를 생성하는 데 사용됩니다.

  1. 37°C의 가습 대기와 5%CO2를 함유한 DMEM 내 저통통 293FT 세포를 배양합니다. 293FT 크기의 세포가 3주 이상 배양된 적이 없는지 확인하세요.
    참고: 저희는 통로 번호가 3에서 10 사이의 293FT 세포를 일상적으로 사용합니다. 293FT 세포가 SV40 대형 T 항원에 의해 형질전환되고 불사화되었습니다. 이 세포들은 높은 형질전환 효율을 가지고 있어 재조합 단백질 생산과 유전자 발현 연구에 필수적입니다. 지질 기반 형질전환과 바이러스 전도 방법 모두에 잘 반응합니다.
  2. 1일째 1일째에 1.7 × 10개의 293FT 세포를 60mm 조직 배양 접시에 5.5mL 배양 배지에 배치합니다. 세포를 인큐베이터에 24시간 동안 돌려보내세요.
  3. 2일차(형질전환 당일)에는 1.5mL 멸균 미세원심분리관에 FBS 및 펜/연쇄상구균 없는 DMEM 배지 375 μL을 추가합니다. 그 다음 지질 기반 트랜스펙션 시약 10 μL, pLV-EF1A-LivePAR-Hygro 플라스미드 4 μg, pMD2.g(VSVG) 플라스미드 2 μg, pRSV-REV 플라스미드 2 μg, pMDLg/pRRE 플라스미드 2 μg를 추가합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 부드럽게 두드려 배지, 형질전환 시약, 플라스미드 DNA를 혼합하세요(소용돌이 방지). DNA/형질전환 시약 복합체 형성을 위해 실온에서 15–30분간 배양합니다.
  4. 플라스미드/형질전환 시약 혼합물을 293FT 세포가 포함된 60mm 접시에 배지를 제거하지 않고 드롭 단위로 첨가합니다. 세포를 인큐베이터에 다시 넣어 48시간 보관하세요.
    참고: 이 기간은 렌티바이러스 입자가 성장 배지로 생성되고 방출되는 과정을 가능하게 합니다.
  5. 4일째에는 형질전환된 293FT 세포에서 배양 배지를 채취하여 렌티바이러스 입자를 분리합니다. 멸균된 0.45 μm 필터를 통해 렌티바이러스 입자에서 세포 잔해를 분리합니다.
  6. 사용 가능한 시약(선택 사항)으로 렌티바이러스 역가를 산출합니다.
    참고: 이 방법은 일반적으로 105 에서 106 감염 단위(IFU/mL)를 생성하며, 이는 아래 전도에서 설명한 감염 중수(MOI)가 대략 ~5에 해당합니다.
  7. 렌티바이러스 입자가 포함된 배지를 네 개의 멸균 크라이오바이어(튜브당 1.0 mL)에 분리하여 -80 °C에서 보관합니다.

2. 전도

참고: 이 절에서는 세포주에 형질전환유전자를 도입하는 데 사용되는 렌티바이러스 전도법을 개괄합니다(그림 1B). 우리 실험실1, 3, 33, 37, 44, 45에서 꾸준히 효과적이었습니다.

  1. 적절한 배지에서 37°C, 5%CO2의 가습 환경에서 선택한 세포주(저전달수)를 배양합니다.
    참고: 필요한 세포 유형의 초기 통과부터 시작하세요. 새로운 세포 바이알은 송전을 위해 씨앗을 뿌리기 전에 최소 한 번 해동하고 통과되어야 합니다.
  2. 첫째 날에는 1× 105–1.5 × 105 세포를 6웰 플레이트의 각 웰에 2mL 배지 내에 씨앗을 뿌립니다. 세포를 인큐베이터에 24시간 보관하세요.
  3. 2일째(전도일)에는 세포 간 융합률이 20%에서 40% 사이인지 확인하세요. 15mL 원뿔형 튜브에 바이러스 1mL, 성장 배지 1mL, 폴리브렌 2 μL(2 mg/mL 스톡)을 넣고 역전(vortexing) 방지 방식으로 부드럽게 혼합합니다.
    참고: 폴리브렌은 렌티바이러스 전이 과정에서 바이러스 입자와 세포막 사이의 정전기 반발을 방지하기 위해 사용됩니다. 폴리브렌은 양전하를 띠기 때문에 음전하를 띤 바이러스 당단백질과 상호작용하여 그 전하를 중화시킵니다. 더 나아가, 폴리브렌은 세포 배양 배지 내 글리코사미노글리칸에 결합하여 바이러스와의 상호작용을 방지합니다. 따라서 폴리브렌은 전도 효율을 크게 향상시킵니다.
  4. 6웰 플레이트에서 성장 배지를 제거하고 각 웰에 바이러스/배지/폴리브렌 혼합물을 추가하세요. 전도 혼합 세포를 32 °C의 가습 대기와 5%CO2 가 포함된 인큐베이터에 16–18시간 동안 보관합니다.
    참고: 렌티바이러스 전이 과정에서 32°C에서 밤새 세포를 배양하는 것은 흔하지만 필수는 아니며 바이러스 감염 효능을 크게 높여줍니다. 온도를 낮추면 세포 대사가 느려져 세포 방어력이 감소하고 바이러스 감염에 대한 감수성이 높아집니다.
  5. 3일째에는 바이러스 이식 세포의 배지를 신선한 배지로 교체하고 37°C 인큐베이터로 옮깁니다. 48시간 동안 부화하세요.
    참고: 이 2일은 세포가 RNF146(100–182)-EGFP 형질전환유전자를 생성하고 하이그로마이신에 내성을 갖기에 충분합니다.
  6. RNF146(100–182)-EGFP 형질전환유전자를 발현하는 다클론 안정 세포주를 개발하기 위해, 2.5단계에서 지시된 대로 2일간의 인큐베이션 후 하이그로마이신 선발을 다음으로 시작한다.
    1. 또는 하이그로마이신이 없는 상태에서 이 형질전환 세포 집단을 확장하여 향후 10–14일 동안 PAR 분석에 사용하기도 합니다(일시적 전도). 앞서 설명한 대로1.
  7. 하이그로마이신 존재 상태에서 세포가 성장하면 100mm 플레이트에 옮기고 필요한 만큼 확장합니다.
  8. 형질전환된 세포의 냉동 저장을 준비하여 향후 사용을 준비하세요.
  9. 3절에 설명된 대로 공초점 현미경을 이용한 RNF146(100–182)-EGFP 형질유전자 발현을 검증합니다. RNF146(100–182)-EGFP 형도유전자는 세포 전반에 발현됩니다.
  10. 다른 곳에서 설명한 대로 면역블롯을 통해 RNF146(100–182)-EGFP 형질전환유전자의 발현을 검증합니다 1,37.

3. 정초점 현미경 및 분석

참고: 이 프로토콜 섹션은 커버슬립 준비, LivePAR 발현 세포의 시딩 작업, 처리제(tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi 및/또는 NRH) 노출, 그리고 공초점 영상 및 PAR 초점 분석을 위한 현미경 슬라이드에 고정 세포를 준비하는 과정을 상세히 설명합니다(그림 1C). 또한 ImageJ 소프트웨어와 PAR 초점의 반자동 정량화를 위한 맞춤형 매크로 사용법도 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 요인(예: 소분자, BER 단백질 노크아웃)이 DNA 손상 의존적 PARylation에 미치는 영향을 조사하는 데 사용될 수 있으며, 우리 연구실에서 성공적으로 적용되었습니다34,37.

  1. 커버슬립 준비
    1. 20mm 커버슬립 20× 20mm 두께의 커버슬립을 디에틸 에테르에 20분간 담가두는 유리 용기에 배기 후드에 담가세요.
      참고: 디에틸 에테르를 다룰 때는 연기성 및 잠재적 위험성 때문에 연기 후드를 사용해야 합니다.
    2. 디에틸 에테르를 제거하고 커버슬립을 에탄올 농도가 점차 감소하는 상태로 세척합니다 [100%, 70%, 50%, 그리고 0%(ddH2O)].
    3. 물을 제거하고 커버슬립을 1N HCl에 20분간 부드럽게 저어줍니다.
    4. HCl을 제거하고 커버슬립을 ddH20으로 3번 세척하세요.
    5. 커버슬립은 사용 전까지 70% 에탄올 4°C에 보관하세요.
  2. 셀의 도금
    1. 20mm × 멸균 커버슬립 두 장을 60mm 세포 배양 접시에 나란히 놓으세요. 실험에 필요한 만큼 요리를 준비하세요. 커버슬립이 담긴 접시에 세포를 넣기 전에 모든 에탄올이 증발했는지 확인하세요. 잔여 에탄올을 씻어내려면 멸균 PBS를 접시에 10–15분 동안 넣어 씻어내고; 세포를 시딩하기 전에 PBS를 제거하세요.
    2. 세포 배양 접시당 20만 개의 LivePAR 발현 세포를 씨앗. 세포가 커버슬립에 24–36시간 동안 달라붙도록 두고, 배지를 조절한 후 복제(성장)를 시작하세요.
  3. PAR 초점의 유도
    1. LivePAR 발현 세포를 100 μM NRH, 10 μM PARGi, 10 μM MNNG 또는 40 μM tBuOOH에 노출시킵니다. 또한, PARP1/PARP2 의존성 PAR 형성을 검사하기 위해 10 μM PARPi를 첨가하여 PARP1/PARP2를 억제합니다. 커버슬립에 세포가 포함된 배지에 화합물을 직접 넣고, 배양 접시에서 배지를 부드럽게 휘저어 화합물을 분배합니다. 60mm 접시는 37°C에서 60분에서 90분 정도 부화시킵니다.
      참고: NRH는 최적의 PARP1/PARP2 매개 PARylation 33,46,47을 위해 충분한 세포 NAD+ 수치가 확보되도록 하는 데 사용됩니다. PARGi는 PARP1/PARP2로 합성된 PAR 사슬이 PARG에 의해 분해되는 것을 방지하는 데 사용됩니다. MNNG 또는 tBuOOH는 DNA 염기 변형을 유도하여 BER을 유도하는 데 사용되며, 이는 PARP1/PARP2의 활성화로 이어집니다. PARPi는 신호(초점)가 PARP1/PARP2 활성화에서 비롯됨을 확인하는 데 사용됩니다.
  4. 셀 고정 및 커버슬립 장착
    1. 미디엄을 제거하고 PBS로 세척하세요.
      참고: 세포 배양에 사용되는 배지에는 혈청 단백질이 많이 포함되어 있으므로 PBS로 한두 번 세척하는 것이 중요합니다. PBS로 세척하면 미디어 내에 남아 있는 MNNG나 tBuOOH의 잔여도 제거할 수 있습니다.
    2. 4% 포름알데히드를 PBS에 넣어 상온에서 15분간 프리픽스를 투여하세요. PBS로 세포를 3번 세척하세요.
    3. 세포에 3mL의 차가운 메탄올(아세톤, 7:3)을 첨가하여 고정합니다. 접시를 -20°C에서 9분간 두세요.
    4. 메탄올: 아세톤을 제거하세요. PBS로 3번 세척하세요.
    5. 유리 슬라이드에 DAPI가 포함된 15 μL 안티페이드 매체를 피펫 사용. 셀이 안쪽을 향하게 하여 커버슬립을 장착 매체 위치에 부드럽게 장착하여 기포를 최소화하세요.
    6. 커버슬립 양면에 소량의 투명 탑코트 네일 에나멜을 발라서 유리 슬라이드에 맞춰 중앙에 고정하고 밀봉하세요. 슬라이드를 어두운 곳에 두어 탑코트 네일 에나멜이 마를 때까지 기다려 주세요(~10분). 슬라이드는 4°C의 어두운 온도에서 보관하다가 촬영 준비가 될 때까지 보관하세요.
  5. 영상 세포
    1. 모든 슬라이드를 63× 배율로 최소 10배 이상 공초점 현미경으로 촬영하세요. 488 nm 레이저를 사용해 PAR 초점을, 405 nm 레이저를 사용해 핵 염색(DAPI)을 검출합니다(예: 그림 2 참조).
  6. 공초점 이미지 분석
    1. 다음 텍스트를 포함하는 텍스트 파일을 만들고 이름을 "LivePAR_Macro"로 설정하세요. 이 매크로는 LivePAR 발현 세포의 핵에서 PAR 초점을 "자동" 정량화하는 것을 용이하게 합니다:
      매크로 "DAPI 양성 염색 [1]" {
      tit=getTitle();
      run("중복...", "title=DAPI 중복");
      selectWindow("DAPI")
      run("8비트");
      run("스플릿 채널")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      close();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("가우시안 블러...", "시그마=3");
      setAutoThreshold("Default");
      run("Make Binary");
      run("Invert")
      run("구멍을 채우다")
      런("유수령")
      run("입자 분석...", "크기=50.00-Infinity circularity=0.00-1.00 show=개요 추가, 제외, 포함, in_situ");
      rename("DAPI_"+tit);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      close();
      }
      매크로 "PAR [2]" {
      setBatchMode(true);
      run("8비트");
      t=getTitle();
      run("중복...", "title=GB1 중복");
      run("중복...", "title=GB20 중복");
      selectWindow("GB20")
      run("가우시안 흐림...", "반경=20 스택");
      selectWindow("GB1");
      run("가우시안 흐림...", "반경=1 스택");
      imageCalculator("뺄셈 스택 만들기", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      close();
      selectWindow("GB20");
      close();
      selectWindow("Result' of GB1");
      rename("Blank_GB1-GB20_"+t);
      title = getTitle();
      run("스플릿 채널")
      selectWindow("C1-"+title);
      close();
      selectWindow("C2-"+title);
      setThreshold(90,255) //90 값은 실험적 변동성을 고려하여 변경할 수 있습니다
      run("입자 분석...", "크기=0.00-200 순환도=0.00-1.00 쇼=마스크 요약");
      close("C2-"+제목);
      selectWindow("C2-의 마스크+title);
      닫음 ();
      setBatchMode(false);
      }
    2. ImageJ를 다운로드하여 컴퓨터에 설치하세요 (https://imagej.net/ij/download.html).
    3. ImageJ를 열고 매크로(텍스트 파일: LivePAR_Macro)를 설치하세요 . 플러그인 | 매크로 | 설치하세요.
    4. ImageJ에서 모든 공초점 파일을 열어 *.tif 파일로 저장해 원본 파일을 보존하세요.
    5. 스프레드시트 문서를 열고 [날짜]_[셀 라인]_Foci 분석으로 저장하세요.
    6. 한 번에 *.tif 파일씩 분석하세요. 원자핵을 찾으려면 1 을 누르세요; ROI Manager 라는 창이 열리면, 창 내 모든 항목을 선택한 후 추가 를 눌러 원자핵 영역을 원본 이미지 위에 겹쳐 보입니다. 잘못 식별된 핵을 삭제하세요. 자유손 선택 도구를 사용해 핵을 그린 후 2 를 눌러 PAR 초점을 정량화하세요.
      참고: 프레임 내에 완전히 들어가지 않은 핵은 포함하지 마십시오.
    7. ROI 매니저에서 각 핵을 하나씩 선택하고 2를 누르세요. 선택한 핵 내 초점 수를 나타내는 카운트가 나타납니다. 파일의 모든 핵에 초점이 점수화되면, 정보를 복사해서 열린 스프레드시트 문서에 붙여넣으세요.
    8. 모든 *.tif 파일로 3.6.6과 3.6.7 단계를 반복합니다.
    9. 선택한 소프트웨어에서 핵별로 PAR 초점 을 그래프로 표시하세요(예: 그림 3 참조).

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결과

LivePAR 프로브를 발현하는 세포는 RNF146(100-182)-EGFP 융합 단백질을 암호화하는 렌티바이러스를 생성하여 생성할 수 있습니다(그림 1A). 세포는 전달 후 최대 2주간 일시적 발현 후 평가하거나, 하이그로마이신 선택(그림 1B)1 후 안정적인 세포주로 평가할 수 있습니다. 제노톡신 처리 후에는 DNA 손상에 의해 유도된 PAR 초점을 핵 내에서 시각화할 수 있으며, 고정 후 공초점 형광 현미경으로 영상화할 수 있습니다(그림 1C). 이 이미지들은 차량 제어 셀에서 범세포 EGFP 염색을 보여줍니다(그림 2, 상단). 그러나 제노톡신 처리된 세포는 핵 초점이 축적되어 ...

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토론

LivePAR 분석법은 PARP1/PARP2가 PAR 사슬을 활발히 합성하는 핵 유전체 DNA 손상 부위를 탐지하기 위해 개발되었습니다. 이를 위해 WWE 도메인(아미노산 100–182)을 암호화하는 RNF146 조각을 EGFP 1,2,3,37에 융합시켰습니다. 추가로 기술한 PAR 프로브는 EGFP가 DTX4의 아미노산 잔기 1부터 166, PARP11의 아미노산 잔기 22에서 112, DTX2의 아미노산 1–178에 융합되어 있으며, 각각 확장된 WWE 도메인37을 암호화하여 PAR의 iso-ADP-리보스 모이에티를 인식합니다. 또한, 최근에는 EGFP가 Af1521 37의 Af1521 37에서 ...

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공개 사항

R.W.S.는 Canal House Biosciences, LLC의 공동 창립자이며, 과학 자문위원회 위원이고 지분을 보유하고 있으나, 이 회사는 이 연구에 관여하지 않았으며 자문 활동도 관련이 없습니다. 저자들은 이해 충돌이 없다고 주장합니다.

감사의 글

NRH 공급과 관련해 수년간 지속적으로 지원해 주신 Marie Migaud(사우스 앨라배마 대학교)에게 특별한 감사를 드립니다. 소볼 연구실의 DNA 복구, DNA 손상 분석, 유전자 독성 노출 및 복제 스트레스의 영향에 관한 연구는 NIH [ES029518, ES028949, CA238061, CA236911, AG069740, ES032522]와 NSF [NSF-1841811]의 연구비로 지원받았습니다. 또한 레고레타 암 센터 기금(R.W.S.)의 지원도 제공되었습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약, 화학 물질 및 펩타이드
0.45 µm Durapore steriflip 필터Sigma-AldrichCat# SE1M003M00
20 x 20 mm 현미경 커버슬립Thermo Fisher ScientificCat# 22-170-371
아세톤Thermo Fisher ScientificCat# A18-1
세포 배양 접시, 100 mmVWRCat# 25382-166
세포 배양 접시, 60 mmFisher ScientificCat# 430166
세포 배양 플레이트, 6웰VWRCat# 62406-161
Cryovials, 2 mLVWRCat# 89499-722
디에틸 에테르Thermo Fisher ScientificCat# 60-29-7
디메틸 설포사이드Thermo Fisher ScientificCat# BP231-1
일회용 멸균 필터, 0.45 µmSigma-AldrichCat# SE1M003M00
DMEMCorningCat# 15-017-CV
에탄올, 200 proofDecon LabsCat# 2701
유리 현미경 슬라이드Thermo Fisher ScientificCat# 12-544-4
열 활성화된 태아 소 혈청Atlanta BiologicsCat# S11150
염산Thermo Fisher ScientificCat# A144-212
하이그로마이신Thermo Fisher ScientificCat# 10687010
대형 Kim WipesKimberly-ClarkCat# 34256
Lenti-X GoStix Plus 키트TakaraCat# 631280
메탄올Thermo Fisher ScientificCat# A452SK-4
MNNGMolportCat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸) 테트라하이드로푸란-2-일]-4H-피리딘-3-카복사마이드)Marie Migaud 또는 NuChem Sciences Inc
PARG 억제제 (PDD00017273)Sigma-AldrichCat# SML1781
PARPi 억제제 (Veliparib, ABT-888)MedChemExpressCat# HY-10129
페니실린/스트렙토마이신GibcoCat# 15140-122
폴리브렌Sigma-AldrichCat# TR-1003-G
tBuOOHThermo Fisher ScientificCat# 180345000
TransIT-x2 (세포전염 시약)MirusCat# MIR-6006
Triton-X100VWRCat# 0694
트립신-EDTAThermo Fisher ScientificCat# 25200-056
Vectashield (H-1000) 안티-페이드 장착 매체Thermo Fisher ScientificCat# NC1695563
세포주  
293-FTThermo Fisher ScientificCat# R70007
(SV40 대 T 항원으로 변형된 인간 배아 신장 세포로부터 파생)Thermo Fisher ScientificCat# R70007
LN428네너러스 기프트 받음N/A
(인간 교모세포종 종양 세포주)Dr. Ian Pollack (피츠버그 대학교)N/A
RPE-1ATCCCat# CRL-4000
(인간 hTERT-불멸화 망막 색소 상피 세포)ATCCCat# CRL-4000
U2OSATCCCat# HTB-96
(인간 골육종 세포주)ATCCCat# HTB-96
재조합 DNA
pMDLg/pRRE실험실 재고# 253Addgene, Cat# 12251
pRSV-Rev실험실 재고# 254Addgene, Cat# 12253
pMD2.G실험실 재고# 252Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro
(LivePAR은 RNF146의 WWE 도메인, 아미노산 잔기 100-182, EGFP와 융합; 하이그로마이신 저항 캐세트 포함)		실험실 재고# 1727Addgene, Cat# 176063
소프트웨어 및 알고리즘 
Adobe Illustrator (그림 준비용)Adobe Systems버전 2024
GraphPad PrismGraphPad버전 10.5.0 (Mac OS X)
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/download.html
```

참고문헌

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