지중해에서 칸디다 알비칸스 감염을 최적화하여 균류 발병기전과 숙주 방어 연구를 위한 프로토콜

요약

이 프로토콜은 플라나리아 Schmidtea 지중해를 곰팡이 감염 시 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 모델 시스템으로 활용하는 최적화되고 상세한 가이드를 제공합니다. 이 방법은 인간 곰팡이 병원체인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 플라나리아를 감염시키는 이전 절차를 기반으로 하며, 재현성과 실험적 일관성을 높이기 위한 상세한 지침을 제공합니다.

초록

칸디다 알비칸스는 대부분의 인간을 무증상으로 정착시키는 흔한 기회성 곰팡이 병원체입니다. 일반적으로 양성 공통 질환이지만, 항생제 사용, 면역 기능 장애, 상피 장벽 파괴로 인한 장군 불균형은 표재성 점막 질환부터 생명을 위협하는 전신 칸디다증에 이르기까지 곰팡이 과증식과 감염을 유발할 수 있습니다. 서로 다른 감염 단계와 다양한 측정 가능한 숙주 결과를 가진 C. 알비칸의 병인을 생체 내에서 해부하기 위한 새로운 전임상 감염 모델이 필요합니다. 플라나리아 Schmidtea 지중해는 이전에 C. albicans 감염 시 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 무척추동물 숙주로 자리 잡았습니다. S. mediterranea는 박테리아와 곰팡이를 포함한 병원성 미생물 감염을 극복할 수 있는 보존된 선천 면역 기전에 전적으로 의존합니다. 플라나리아의 뛰어난 재생 능력과 접근 가능한 줄기세포 집단은 이 생물을 생체 내에서 초기 면역 반응, 조직 복구, 병원체 제거를 분석하는 데 적합한 모델로 만듭니다. 이 모델은 곰팡이의 병원성과 숙주 전사 반응을 동시에 분석하여 감염 역학에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다. 여기서는 C. albicans로 S. mediterranea를 감염시키기 위한 상세한 수정, 표준화된 절차, 최적화된 절차를 포함한 최신 프로토콜이 제시되었으며, 이는 재현성을 높이고 곰팡이 병인과 숙주 방어에 대한 체계적인 연구를 가능하게 하기 위해 설계되었습니다.

서론

칸디다 알비칸스는 흔한 기회성 곰팡이 병원체로, 무증상으로 인간의 50-70%에 정착합니다 ^1,2,3. 일반적으로 무해한 공생체인 C. albicans는 미생물군 불균형, 항생제 사용, 면역억제, 상피 장벽 붕괴, 의료기기 사용 등과 같은 조건에서 과도하게 성장할 수 있으며, 이로 인해 표재성 점막 감염부터 생명을 위협하는 전신성 칸디다증에 이르는 질병이 발생할 수 있습니다 ^4,5. 면역 저하자, HIV/AIDS 환자, 화학요법 또는 면역억제 치료를 받는 환자, 만성 질환자 또는 중환자실에 있는 환자 등에서 사망률은 70%를 초과할 수 있으며, 이는 침습성 칸디다증이 미치는 중대한 공중보건 부담을 강조합니다 ^6,7,8. 전 세계적으로 침습성 곰팡이 감염은 매년 650만 명 이상에게 영향을 미치며, 미국에서만 칸디다 관련 감염의 직접적인 의료비가 연간 80억 달러를 넘습니다 ^9,10. 이용 가능한 항진균제 치료에도 불구하고, C. albicans 감염과 관련된 이환율과 사망률은 수십 년간 거의 변하지 않았으며, 이는 곰팡이 질환에서 숙주-병원체 상호작용을 더 잘 이해할 시급한 필요성을 부각시킨다.

C. albicans는 다양한 병원성 인자를 활용하여 다양한 숙주 환경에서 정착, 지속, 병태 기전을 지원합니다. 여기에는 숙주 조직 부착, 면역 회피, 세포벽 재형성, 가수분해 효소 분비, 형태학적 가소성, 그리고 바이오필름^형성 11,12,13,14,15,16이 포함됩니다. 이 특성들은 C. 알비칸스가 다양한 숙주 지위에 적응하고, 면역 반응을 조절하며, 항진균 치료에 저항할 수 있게 합니다.^{16, 17, 18, 19, 20, 21}. 이러한 과정들이 숙주 이환율, 사망률, 병원체 제거 등 감염 결과에 어떻게 영향을 미치는지 명확히 하는 것은 보다 효과적인 예방 및 치료 전략을 개발하는 데 필수적입니다.

이러한 숙주-병원체 역학을 조사하기 위해, 우리는 플라나리아 Schmidtea 지중해를 숙주로 삼은 모델 시스템을 구축했다 22,23,24. 이 모델은 침목 기반 감염 방법을 활용하여 C. albicans에 동시적으로 노출될 수 있는 다기관 숙주 반응을 연구하는 다목적 플랫폼입니다. 다음 섹션에서는 이 프로토콜을 개선하고 재현성을 높이며 실험실 간 일관된 실행을 촉진하는 단계별 절차를 업데이트합니다.

플라나리아는 자유생활 무척추동물로, 부상이나 감염으로 인해 잃어버린 조직을 빠르게 대체할 수 있는 뛰어난 재생 능력을 지녔습니다²⁵. 이들은 적응 면역 체계가 없으며, 패턴 인식 수용체, 항미생물 펩타이드, 점액 분비, 식세포 등 보존된 선천적 방어력에 전적으로 의존하여^{26, 27, 28, 29}일 이내에 박테리아 및 곰팡이 병원체를 제거합니다. 선천 면역은 진핵생물 전반에 걸친 첫 번째 방어선이며, 포유류 시스템 외에는 아직 연구가 부족하기 때^문에(27), 플라나리아는 이러한 과정을 세포 및 분자 해상도로 생체 내에서 연구할 기회를 제공합니다. 이들의 재생 능력은 성체 다능성 줄기세포인 신아세포에 의해 구동되며, 이 줄기세포는 성체 세포의 약 30%를 차지하며 감염 후 회복에 기여합니다^23,30. 이러한 특징들은 S. mediterranea를 유전적, 세포적, 조직적, 유기체 규모에서 병원체 병원성 및 숙주 방어를 해부하는 강력한 모델로 만들어, 전통적인 포유류 시스템으로는 연구하기 어려운 질문들을 해결할 수 있게 합니다.

또한, 플라나리아의 크기가 작고(보통 길이 몇 밀리미터), 저렴한 비용^{, 유지 관리}의 용이성은 척추동물 모델에 내재된 재정적, 윤리적, 규제적 제약을 피하면서 대규모 실험을 지원합니다. C. 알비칸스와 마찬가지로 S. mediterranea는 유전체적으로 다루기 쉬우며, 완전히 염기서열 분석되고 주석이 달린 게놈을 가지고 있으며, 전사 프로파일링, 고해상도 면역조직화학 및 조직학, 강력한 RNA 간섭(RNAi^{) 등} 첨단 분자 및 세포 기법을 지원합니다.. 이 도구들은 감염 중 숙주와 병원체의 반응을 병행 분석할 수 있게 합니다.

여러 대체 전임상 모델들이 곰팡이 감염 연구를 위해 사용되어 왔습니다. Galleria mellonella (왁스 나방), Caenorhabditis elegans (회충), Drosophila melanogaster (초파리), 척추동물 Danio rerio (얼룩말피시)와 같은 무척추동물 숙주는 각각 실험적 이점을 제공하지만 뚜렷한 한계도 가지고 있습니다. 이러한 시스템은 감염이 숙주 사망을 빠르게 유도하여 질병, 회복, 다시스템 반응에 대한 상세한 평가를 어렵게 하기 때문에 생존을 주요 종점으로 삼는 경우가 많습니다. 이는 플라나리아 모델이 쉽게 포착할 수 있는 특징들입니다.

Mus musculus(쥐), Rattus norvegicus(쥐), Oryctolagus cuniculus(토끼), Cavia porcellus(기니피그)와 같은 포유류 모델은 인간 생리학을 더 밀접하게 재현하지만, 높은 비용, 소규모 집단 규모, 윤리적 및 규제 요건, 그리고 선천적 면역 반응과 적응적 면역 반응을 구분하는 어려움 때문에 제한을 받습니다. 더욱이, 수십 년간 쥐를 대상으로 한 진균 병태 연구는 주로 후기 전신 감염(^{39,40,41,42,43})에 집중되었으며, 상피 장벽 파괴와 점막 과증식과 같은 초기 사건들은 종종 간과되어 있습니다. 이는 인간에서 곰팡이 질환 발병의 가장 흔한 경로입니다 44,45,46.

따라서 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 것은 곰팡이의 병원성, 숙주 방어, 질병 진행의 기저에 있는 생물학적 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 침습성 곰팡이 감염은 전 세계적으로 점점 심각해지는 위협으로, 여러 종이 모든 주요 항진균제 계열에 내성을 보이고 있습니다. 10억 명 이상의 사람들이 곰팡이 감염에 영향을 받는 것으로 추정되며, 기후 변화, 광범위한 항생제 사용, 면역 저하자 증가 등의 요인이 항진균 내성 병원체의 출현을 가속화하고 있습니다 47,48,49,50. 병원성 곰팡이가 숙주와 어떻게 정착하고 상호작용하는지 이해하는 것은 새로운 예방 및 치료 전략 개발에 매우 중요합니다.

다음은 S. mediterranea-C. albicans 상호작용에 대한 개정 및 표준화된 전신 감염 프로토콜을 설명하며, 재현성을 촉진하고 곰팡이 발병 기전 및 숙주 방어 기전의 체계적 조사를 가능하게 합니다. 원래 프로토콜은 이전 출판물^{22, 23, 24}에서 따랐습니다. 표 1은 이 개정판에 포함된 주요 업데이트를 요약하는데, 여기에는 곰팡이 접종 절차의 개선, 웰 용량 감소, 정의된 동물 포함 기준, 감염성 및 치명적 용량 결정, 그리고 업데이트된 가축 사육 권고사항 등이 포함됩니다. 이 워크플로우는 C. albicans 배양, 침수에 의한 플라나리아 감염, 증상 및 치명적 용량 조건에서 질적 및 정량적 측정을 통해 곰팡이 병원성 및 숙주 반응 평가에 대한 상세한 지침을 제공합니다(그림 1). 여기서 제시된 최적화된 절차는 감염 역학과 숙주 결과의 핵심 결정 변수로 경험적으로 확인된 변수들을 포함하여, 재현성을 높이고 숙주-병원체 상호작용의 체계적 평가를 가능하게 합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 이전 방법들인^{22, 23, 24}를 기반으로 하며, 재현성을 높이고 S. mediterranea에서 곰팡이 병인기전 및 숙주 반응에 대한 체계적인 연구를 가능하게 하기 위한 명확하고 표준화된 절차를 확립합니다. 주요 프로토콜 개선에는 사전에 정해진 동물 포함 및 제외 기준, 표준화된 미생물 제제, 그리고 숙주 종합 평가가 포함됩니다.

모든 절차는 적절한 멸균 및 무균 생물안전 레벨 2 기법을 사용하여 수행되어야 합니다. 장갑, 실험복, 발가락이 닫힌 신발을 포함한 표준 실험실 개인 보호 장비(PPE)를 항상 착용해야 합니다. 플라나리아 S . mediterranea 를 이용한 수술은 무척추동물의 윤리적 사용에 관한 기관 지침에 따라 진행되었습니다.

모든 프로토콜 개선은 표 1에 요약되어 있습니다. 모든 시약, 중요 장비, 배지, 완충제, 면역염색 레시피는 재료표 와 표 2에 나열되어 있습니다.
참고: 무척추동물 모델 S. mediterranea 와 관련된 모든 절차는 동물 복지의 최고 기준을 보장하기 위해 시행되어야 합니다. S. mediterranea 는 자연 서식지를 모방하는 최적화된 조건에 기숙되어야 합니다. 실험은 연구 전반에 걸쳐 윤리적 치료를 보장하기 위해 잠재적인 통증이나 고통을 최소화하도록 설계되어야 합니다.

1. 곰팡이 배양

1. C. 알비칸스 균주 정보
   1. 표준 C. 알비칸스 실험실 균주 SN250⁵¹ 이 모든 실험에서 야생형 균주로 사용되었으며, http://www.fgsc.net/ 년 균류 유전학 스톡 센터에서 공개되어 있습니다. SN250은 임상 분리 균 SC5314에서 유래했으며, 원래 퍼진 칸디다증⁵² 환자의 혈액 배양에서 채취되었습니다.
   2. C. albicans 균주는 −80°C에서 25% 글리세롤 비톡으로 유지됩니다.
2. 감염을 위한 C. 알비칸스 균주 배양
   1. 냉동 재고에서 줄무늬
      1. 멸균 어플리케이터를 사용해 −80°C 육수에서 원하는 균주를 효모 펩톤 추출물(YPD)(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%; pH 6.8) 한천 플레이트에 스트라이크합니다.
      2. 30°C에서 정적으로 72시간 배양하세요.
3. 야간 배양 준비
   1. 멸균 어플리케이터 스틱을 사용해 멸균 붕규산 유리 배양관(18mm × 150mm)에서 단일 군락을 4mL 액체 YPD에 접종합니다.
   2. 동일한 조건에서 예방접종되지 않은 YPD를 포함한 음성 대조관을 포함시켰습니다.
   3. 튜브를 느슨하게 덮어 산소 공급을 허용하고, 30°C에서 16시간(하룻밤) 배양하며, 진동 인큐베이터에서 220rpm(궤도)에서 진동시킵니다.
      참고: 음성 대조군에서 미생물 증식이 발생하면 실험을 중단하고 새로운 배지와 멸균 기법으로 재개하십시오.
4. 수확 및 세척 셀
   1. 무균 기법을 사용하여 배양물을 표지된 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다.
   2. 세포를 펠릿으로 삼기 위해 ~3,000 × g에서 5분간 원심분리기를 진행합니다.
   3. 펠릿을 손상시키지 않고 YPD 상청액을 조심스럽게 제거하세요.
   4. 알갱이를 플라나리아 물에 재현탁하여 사용된 YPD와 같은 부피로 재현탁합니다(조성은 표 2 참조).
   5. 소용돌이 현상으로 완전히 섞으세요.
   6. 성장 배지를 완전히 제거하기 위해 1.4.2-1.4.4 단계를 두 번 더 반복합니다.
   7. 최종 세척 후에는 세포 펠릿을 소용돌이로 신선한 플라나리아 물에 다시 부유시킵니다.
5. C. 알비칸스 세포 농도 정량화
   1. OD 측정을 위한 희석
      1. 1:20 희석(50 μL 배양 + 950 μL 플라나리아 물) 또는 대체 희석 인자를 사용하는 무균 1.7 mL 미세원심분리관 3개를 준비합니다. 충분히 섞으세요.
      2. 1000 μL 플라나리아 물이 담긴 빈 튜브를 준비합니다.
   2. 분광광도법
      1. 분광광도계를 600 nm(외경₆₀₀)에서 광학 밀도를 측정하도록 설정하세요.
      2. 분광광도계를 플라나리아 물로 비우세요.
      3. 희석된 샘플마다 OD₆₀₀ 을 측정하고 기록 값을 기록하세요.
      4. 세 가지 측정값을 평균하고 희석 계수를 곱하여 재고 배양의 OD₆₀₀ 을 구합니다. OD₆₀₀ 을 세포 농도로 변환하세요.
         참고: 각 분광광도계에 대해 광학 밀도 변환 계수는 경험적으로 결정되어야 합니다. 사용된 특정 기기에 따르면, OD₆₀₀ of 1은 약 2 ×10⁷ C. albicans 세포/mL⁵³에 해당합니다.
6. 실험적 접종 농도 결정
   1. 각 실험 조건에 맞는 원하는 접종 농도를 준비하세요.
      참고: 플라나리아 군락의 효과적인 용량, 특히 감염성 또는 치명적 종말에 대해 최소 세 번의 생물학적 복제를 수행하십시오. 감염성 및 치명적 접종 농도를 준비하는 대표적인 계산은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

2. 플라나리아 종과 유지

1. 플라나리아 종과 유지
   1. 모든 실험에는 플라나리아 S. mediterranea 의 CIW4 무성 클론 계통을 사용하세요.
   2. 플라나리아 군체는 1,500–2,000 mL의 1× 플라나리아 물이 담긴 투명 식품용 플라스틱 용기에 보관하세요.
   3. 용기는 20°C의 어둠 속에 두고, 뚜껑을 느슨하게 닫아 가스 교환이 가능하도록 하세요.
   4. 플라나리아는 항생제로 치료하지 마세요.
2. 군체 유지 및 먹이
   1. 일주일에 한 번 신선하게 걸러낸 소간 퓨레를 집단에 먹이세요.
   2. 용기는 일주일에 두 번 청소하세요.
   3. 플라나리아 밀도는 용기당 200–400마리로 유지하세요. 이전 연구들은 군체 준비와 장기 유지 관리에 관한 상세한 절차를 보여줍니다.³¹.
3. 사전 실험 조건화
   1. 실험적 감염 전에 플라나리아를 7–12일간 굶겨 대사와 크기 조건을 표준화합니다.
   2. 각 실험 조건마다 우물당 5–10마리의 동물 그룹을 사용하세요. 양성 및 음성 대조군을 포함한 모든 조건에서 동물 수가 균등하도록 하십시오.
4. 동물 크기 선택
   1. 길이 약 5mm인 플라나리아를 선택하며, 이는 동물당 약 5× 10개의⁵ 숙주 세포에 해당합니다⁵⁴.
   2. 5mm 미만의 플라나리아는 사용하지 마세요. 이 크기의 동물은 배아세포나 불완전한 발달을 가진 개체를 포함할 수 있어 결과가 일관되지 않을 수 있습니다.
   3. 5mm 이상의 플라나리아는 형광 면역염색에 덜 적합하므로 사용을 피해야 합니다.
   4. 감염 용량(ID₅₀)과 치명량(LD₅₀) 조건을 설정할 때 길이 약 5mm의 플라나리아를 사용하세요.
      참고: 일관된 크기 선택을 위해 5mm × 5mm 기준 격자를 출력하여 투명한 플라나리아 용기 아래에 플라스틱 바인더 슬리브 안에 넣으세요. 길이를 측정하기 전에 플라나리아가 완전히 펼쳐졌는지 확인하세요.
5. 건강 및 포함 기준
   1. 중요한 단계: 사용 전에 모든 플라나리아를 입체현미경으로 검사하세요.
   2. 다음 조건을 포함한 눈에 띄는 손상이나 부상이 있는 동물은 제외하세요:
      1. 배반포(색소가 부족한 조직) 또는 불완전한 색소침착 발달 상태.
      2. 비정상적인 색소침착, 예를 들어 현저히 어두운 부위가 있습니다.
      3. 조직이 결손되거나 손상된 경우.
      4. 병변이나 흉터.
      5. 열린 상처.
      6. 형태학적 이상이나 변형.
      7. 만성적이거나 치유되지 않는 상태라면 됩니다.
   3. 발달 이상이 있는 동물은 제외하세요.
      1. 머리나 꼬리 영역이 갈라지거나 중복되어 있습니다.
      2. 기형적이거나 비대칭적인 신체 형태.
      3. 광수용체 수가 잘못됨(양측 광수용체 한 쌍만 허용됨).
      4. 비정상적으로 위치한 인두.
      5. 결함 있는 섬모로 인해 운동성 저하나 불규칙한 활공 행동이 발생합니다.
   4. 길이 약 5mm이고, 완전히 발달했으며, 눈에 띄는 부상이나 이상이 없는 동물만 포함하세요.
6. 플레이트 준비
   1. 모든 포함 기준을 충족하는 건강한 플라나리아를 조직 배양 처리되지 않은 6웰 폴리스티렌 플레이트에서 우물당 2mL의 신선한 플라나리아 물에 옮깁니다.
      참고: 감염 하루 전에 동물을 옮겨 새로운 환경과 개체 밀도에 적응할 수 있도록 하십시오.
   2. 다음 실험 조건에 맞는 우물을 할당하세요:
      1. 음성 대조군: 감염되지 않았거나 모의 처리된 동물.
      2. 양성 대조군: 야생형 C. 알비칸스에 감염된 동물.
   3. 모든 물을 제거하고 신선한 플라나리아 물 2mL로 교체하여 우물 전체의 균일성을 유지하세요.

3. 감염 설정

1. 예방접종 준비 (샘플 계산은 보조 파일 1 참조)
   1. 무균 기법을 사용해 6웰 플레이트를 사용자 쪽으로 기울여 부드럽게 모든 물을 제거합니다.
   2. 각 우물에 계산된 플라나리아 물의 부피를 추가하세요.
      참고: 동물이 말라버리지 않도록 한 우물씩 진행하세요.
   3. 각 웰에 계산된 C . albicans 배양 부피를 추가하세요.
      참고: 동물을 장시간 공기에 노출시키는 것을 피하세요. 건조는 스트레스를 유발하고 감염 결과를 변화시킬 수 있습니다.
2. 실험용 판 배양 조건
   1. 접종된 6웰 플레이트를 어둡고 정적인 실온의 장소에 놓으세요.
   2. 교차 오염을 방지하기 위해 감염되지 않은 플라나리아 군락과 별도의 구역에 실험용 플레이트를 보관하세요.
   3. 접종 날짜와 시간(시간 0시로 지정)을 기록하세요.
      참고: 서랍, 기기 표면, 붐비는 작업대와 같은 사람이 많이 다니거나 진동이 많은 곳은 피하세요. 움직임은 동물에게 스트레스를 주고 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다.
   4. 플라나리아를 C . 알비칸과 함께 최대 72시간 동안 인큐잉하며, 원하는 종점에 따라 다릅니다.
3. 곰팡이 세포의 재현탁
   1. 각 시점마다 플라나리아를 방해하지 않고 안정된 C. albicans 세포를 부드럽게 재현지하세요.
      참고: 시간(감염 후 시간(시간 [h] 또는 일수[d])은 초기 노출 이후 경과한 시간(시간 0)을 의미합니다.
   2. 감염 후 24시간 시점(HPI)
      1. 멸균 3mL 전사 피펫을 사용해 플레이트를 사용자 쪽으로 약간 기울입니다.
      2. 플라나리아의 물을 흡입한 후 동물이 없는 우물 구역에 부드럽게 분사하여 침착한 곰팡이층을 혼합합니다.
      3. 이 과정을 우물당 5–10번 반복하여 침착된 곰팡이층을 깨뜨리고, 플라나리아와 직접 접촉하지 않도록 합니다.
      4. 재정지(resuspending) 단계의 전후를 가장 잘 보기 위해 어두운 배경에서 곰팡이 침착을 관찰하세요.
      5. 동일한 조건에서 감염되지 않은 통제정을 재현탁하세요.
   3. 48 hpi
      1. 위에서 설명한 부정지 절차를 반복하세요.
      2. 지정된 시점으로부터 ± 시간 이내에 모든 부정 단계를 수행하세요.
4. 노출 종료 (72 hpi)
   1. 72 hpi에서 플라나리아를 새로운 6웰 플레이트에 부드럽게 옮기고, 각 웰마다 2mL의 신선한 플라나리아 물을 넣습니다.
   2. 가능한 한 적은 양의 액체를 사용하여 곰팡이 배양의 이동을 최소화합니다.
   3. 동물을 옮기면 모든 물을 제거하고 신선한 플라나리아 물로 교체하세요.
      참고: 동물과 조직 조각은 기계적 손상이나 추가적인 스트레스를 피하기 위해 조심스럽게 다루세요.

4. 호스트 평가 평가

1. 숙주 결과 기록
   1. 감염 후 1일(DPI)부터 숙주 결과 평가를 시작하여 원하는 실험 종점까지 매일 계속 진행합니다.
   2. 표준화된 0–3 점수 체계(그림 2)를 사용하여 숙주 피해를 정량화합니다.
      점수 0: 비감염 대조군(건강, 무증상)과 변화 없음.
      점수 1: 경미한 증상.
      점수 2: 심각한 증상.
      점수 3: 죽음.
2. 숙주 증상 평가 기준
   1. 점수 0 (무증상):
      1. 감염되지 않은 대조군과 비교해 관찰 가능한 변화가 없으며, 정상적인 형태, 색소침착, 행동, 반응성을 보이는 동물을 식별합니다.
   2. 점수 1 (경미함):
      무증상 대조군에 비해 다음 증상 중 적어도 하나가 관찰될 경우 경미한 점수를 부여합니다.
      1. 움직임 속도 저하나 비정상적인 활공 행동.
      2. 광선 반응의 부분적 또는 완전 상실.
      3. 지속되거나 반복적인 신체 수축.
      4. 비정상적이거나 불균일한 색소침착(밝거나 어두운 영역).
      5. 머리 또는 꼬리 조직의 퇴행.
   3. 점수 2 (심각):
      동물이 살아있는 동안 다음 증상 중 하나 이상이 나타나면 심각한 점수를 부여하세요.
      1. 눈 막이나 한쪽 또는 양쪽 눈의 손실.
      2. 완전한 두부 손실 또는 현저한 전방 조직 손상.
      3. 인두전 부위의 주요 조직 손실.
      4. 여러 신체 부위(두부, 인두부, 후면 구절)로 분열됨.
      5. 점액 분비나 내부 누출이 있든 없든 열린 상처.
      6. 부분 조직 용해로 인해 구조적 완전성이 상실됩니다.
      7. "C자형" 신체 자세, 마비 또는 심각한 운동 장애.
   4. 점수 3 (사망):
      다음 기준 중 하나 이상을 기준으로 사망을 확인하라.
      1. 완전 조직 또는 전체 동물 용해.
      2. 자극에 대한 반응이 완전히 상실됩니다.
      3. 회복이나 재생 실패.
         참고: 그림 2 는 숙주 표현형 분류의 일관성을 보장하기 위해 각 점수에 대한 대표적인 이미지와 정의 특징을 제공합니다.

5. 곰팡이 노출 후 숙주 생존 결정

1. 3 dpi에서 플라나리아를 새로운 6웰 플레이트에 부드럽게 옮기고, 각 웰당 2mL의 신선한 플라나리아 물을 넣어 잔류 곰팡이 배양물을 옮기는 것을 방지합니다.
2. 동물을 광학 현미경(≥ 10배 대의렌즈)으로 관찰하세요.
3. 보충 파일 2에 제공된 표준화된 점수표를 사용하여 숙주 결과를 기록하세요.
4. 살아있는 동물 결정
   1. 다음 중 하나 이상의 기준에 따라 살아있는 동물을 식별하세요.
      1. 네거티브 광주성.
      2. 부드러운 이동 피펫 교란에 대한 반응.
      3. 온전한 신체 구조.
      4. 판에 안정적인 부착.
5. 죽은 동물 식별
   1. 다음 중 하나 이상의 기준으로 죽은 동물을 식별하세요.
      1. 완전한 용해 또는 분해(잔류 잔해만).
      2. 투명하거나 내장이 잘려 나간 몸.
      3. 자극에 대한 움직임이나 반응의 부재.
      4. 재생 실패(배아세포 형성 부재).
6. 죽은 동물 처리
   1. 죽은 동물과 잔해는 현미경으로 생존 불가능함을 확인한 후에만 제거하세요.
   2. 중요한 단계: 교차 오염이나 생존 측정 변경을 방지하기 위해 죽은 동물을 즉시 제거하세요.
   3. 잔해나 곰팡이 잔류가 남아 있다면, C . albicans의 재씨앗 뿌림이나 바이오필름 형성을 방지하기 위해 깨끗한 플라나리아 물이 담긴 신선한 플레이트로 다시 옮겨 넣어야 합니다.
      참고: 시각적 검사 시 6웰 플레이트를 어두운 배경 위에 올려 대비를 개선하고 표현형 평가를 용이하게 하세요.

6. 곰팡이 부담 평가

1. 군체 형성 단위(CFU) 정량화
   1. 원하는 감염 시점에 플라나리아(각 상태당 하루에 5–10마리)를 수집합니다. 매칭된 미감염/모의 대조군과 야생형 감염군을 포함하세요.
   2. 2mL의 신선한 플라나리아 물로 우물을 두 번 부드럽게 헹구어 배경 C. albicans 세포를 제거합니다.
   3. 플라나리아를 멸균되고 라벨이 붙은 1.7 mL 또는 5.0 mL 마이크로 원심분리관에 옮기고 모든 잔류 물을 제거합니다.
   4. 각 튜브에 신선한 플라나리아 물 300 μL을 추가하세요.
   5. 멸균된 공약을 사용해 큰 조각이 남지 않을 때까지 균질화합니다(약 30–45초).
   6. 균질을 연속적으로 희석하는 것을 수행하세요(예: 1:10, 1:100, 1:1000).
   7. 각 희석액의 100–200 μL을 YPD 한천 플레이트에 플레이트링하고, 앰피실린, 리팜피신, 스트렙토마이신, 네오마이신 각각 50 μg/mL를 보충합니다. 멸균 유리 구슬이나 멸균 세포 확산기를 사용해 고르게 발라.
   8. 도금 후 5–10분 동안 플레이트를 벤치 위에 세워 두어 액체가 한천에 흡수되도록 하세요.
   9. 희석과 상태별로 3중판을 준비하세요.
   10. 플레이트를 30°C에서 48시간 배양하세요.
   11. CFU를 세고 희석 계수를 곱합니다.
   12. CFU 값을 플라나리아 수에 정규화하여 조건별 평균적인 CFU를 계산합니다. 예를 들어, 5마리의 균질체에서 10× 희석된 100개의 집락이 관찰되면, 계산된 값은 동물당 200 CFU가 됩니다.

7. 면역형광 항칸디다 염색

1. 일반적인 염색 고려사항
   1. 별도의 명시가 없는 한 모든 동작은 상온에서 부드러운 궤도 흔들림(100–140 rpm)으로 수행하십시오. 항체 세부 정보와 시약 출처는 보충 문서 1 을 참조하십시오.
      주의: 포름알데히드, 도데실 황산나트륨(SDS), 과산화수소는 유해 화학물질이며 기관 안전 규정에 따라 취급해야 합니다. 포름알데히드는 독성이 있으며 발암물질로 분류됩니다; SDS는 자극 요소입니다; 그리고 과산화수소는 화상을 유발할 수 있는 강한 산화제입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험복, 니트릴 장갑, 닫힌 발가락 신발, 안전 고글)를 착용하세요. 인증된 화학 연기 후드에서 휘발성 시약을 사용하는 절차를 수행하고, 기관 환경 보건 및 안전 지침에 따라 폐기물을 처리합니다.
2. 샘플 채취
   1. 각 실험 조건과 시점에서 동물을 수집하세요.
   2. 동물을 2mL 플라나리아 물이 들어 있는 표지된 20 mL 섬광 바이알에 옮깁니다.
   3. 모든 액체를 제거하고, 신선한 플라나리아 물 2mL로 한 번 헹군 후 다시 모든 액체를 헹군 후 다시 한 번 씻어내세요.
3. 고정 및 투과화
   1. 동물을 7.5% N-아세틸시스테인(NAC)을 1× PBS에 3분간 희생합니다.
   2. 용액을 제거하고 동물을 4% 포름알데히드에 0.3% PBSTx에 15분간 고정시킵니다.
   3. 1× PBS로 두 번 세척 샘플을 세척하세요.
   4. 샘플을 1% SDS에 15분간 투과시킵니다.
   5. 1× PBS로 세 번 샘플을 헹구세요.
4. 표백
   1. 표백제는 6% 과산화수소를 1× PBS에 밝은 LED 조명 아래 4–12시간 동안 샘플링합니다.
      참고: 표백이 즉시 진행될 수 없는 경우, 고정 샘플을 4°C의 1× PBS에 최대 1주일간 보관하거나, 탈수 샘플을 100% 메탄올에 담아 장기 보관하세요.
5. 차단 및 항체 배양
   1. 동물을 1× PBS가 포함된 24웰 플레이트로 옮깁니다.
   2. 2.5% PBS-TB(트리톤 X-100 및 소 혈청 알부민 포함)에 비특이적 결합을 상온에서 4시간 또는 4 °C에서 8시간 차단합니다.
   3. 1차 항칸디다 항체(PBS-TB에 1:500)를 실온에서 4시간 또는 4 °C에서 8시간 배양합니다.
   4. 1차 항체를 제거하고 20분마다 8회 세척하며, 0.3% PBSTx를 사용하세요 (총 ~2.5시간).
   5. Alexa-568 결합된 항토끼 2차 항체(PBS-TB 내 1:800)를 실온에서 4시간 또는 4 °C에서 8시간 인큐베이션합니다.
      참고: 광표백을 방지하기 위해 샘플을 빛으로부터 보호하세요. 항체 용액은 재사용할 수 있습니다.
   6. 2차 항체를 제거하고 20분마다 8회 0.3% PBSTx로 세척합니다.
6. 선택 사양 슬라이드 장착
   1. 동물을 현미경 슬라이드에 올려놓고 모든 동물을 앞쪽이 위로 향하게 합니다.
   2. 트랜스퍼 피펫을 사용해 과도한 물을 제거하세요.
   3. 종이 타월 가장자리를 이용해 가장자리에 남은 액체를 조심스럽게 흡수하세요.
   4. 겔바톨 마운팅 매개체 150–175 μL(조성 표 2) 을 드롭 단위로 가두어 동물이 완전히 덮일 때까지 추가합니다.
   5. 공기 방울이 생기지 않도록 샘플 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮으세요.
   6. 젤바톨이 최소 2시간 이상 굳어질 때까지 기다려 주세요.
   7. 슬라이드는 장기 보존을 위해 서늘하고 어두운 곳에 보관하세요.
7. 영상
   1. 노란-녹색 여기(~578 nm)를 사용하는 샘플을 이미지화하여 주황-적색 방출(~603 nm)을 관찰합니다.
   2. 2배 대물렌즈를 사용해 동물 전체의 염색 패턴을 시각화하세요.

8. 문제 해결

1. 감염 결과가 일관되지 않을 경우, 야생형 SN250 또는 다른 기저 균주를 사용하여 5–10 ×^{10 7} 세포/mL 단위로 용량-조절 곡선을 수행한다.
2. 그룹당 5–10마리의 동물로 구성된 최소 세 번의 생물학적 복제를 수행하세요.
3. 교차 오염, 무균 기술 실패, 균주 생존 가능성 문제, 또는 기초 동물 건강 상태가 좋지 않은 경우 등 잠재적 문제를 파악하기 위해 음성 및 양성 대조군을 포함시켜야 합니다.
4. 용량 조절 실험을 완료한 후, 그룹별 중위 생존율을 결정하기 위해 풀을 복제합니다.
5. Mantel–Cox 로그 랭크 쌍별 분석을 사용하여 생존 차이를 분석합니다.
6. Kaplan–Meier 생존 분석을 사용하여 균주 또는 치료법 간 사망 시간 차이를 평가합니다.
7. 비치명적 또는 감염성 용량 조건의 경우, 생존 대신 증상이 있는 숙주 결과(예: 경증 또는 중증 표현형 또는 곰팡이 정착)를 분석합니다.
8. 숙주 반응을 용량군 간 비교하여 이후 실험에 적합한 감염 또는 치명적 용량 범위를 결정합니다.

결과

클라나리아에 C. albicans 를 감염시키기 위한 최신 프로토콜(그림 1)과 숙주 결과를 체계적으로 정량화하는 프로토콜(그림 2)이 제시됩니다. 이 정교한 워크플로우는 이환율(증상 질환 중증도), 생존율(치명성), 진균 부담(CFU), 병원체 정착의 시공간-시간 역학(형광 면역염색) 등 다양한 감염 매개변수를 강력히 평가할 수 있도록 지원합니다. 대부분의 무척추동물 감염 모델이 주로 이진 생존/사망 판독값을 제공하는 것과 달리, 이 플라나리아 모델은 감염 결과와 숙주 반응의 광범위한 스펙트럼을 포착합니다. 플라나리아는 증상성 질병 진행과 이후 회복을 초래하는 아치명적 감염과 같은 다양한 미생물 도전 종말에 사용할 수 있습니다. 또한 치명량 접종을 포함한 생존 연구에도 사용될 수 있습니다. 이러한 역량은 플라나리아가 다양한 질병 결과에서 숙주-병...

토론

야생형 C. albicans 의 감염량을 변화시키면 S. mediterranea에서 재현 가능하고 용량에 따라 이환율 차이가 나타나며, 이는 곰팡이 병원성의 정량적 평가에 대한 모델의 민감도를 강조합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 유지 중인 플라나리아 군락 내에서 기초 감염 및 치사량을 설정하는 전략을 제시하고, CFU 정량화와 면역염색을 이용한 숙주 건강 점수와 곰팡이 부하 측정을 통합하여 전신 감염을 성공적으로 확인하는 기준을 제시합니다.

체계적 최적화를 통해 일관된 감염 역학과 재현 가능한 숙주 결과를 달성하는 데 필수적인 여러 실험 매개변수가 확인되었습니다. 접종 농도 외에도 플라나리아 크기, 개체군 밀도, 표면적 대 부피 비율과 같은 요인들이 감염의 진행과 심각도에 뚜렷한 영향을 미칩니다. 여기서 도입된 표준화된 포함 기준, 통제된 감염 조건, 상세한 평가 지표 점수 등 개선된 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.7 mL 미세원심분리관	VWR/제네메이트	490004-436-BOXOF500	투명, 500개 박스
20 mL 스킨틸론 바이알	피셔 사이언티브	12-100-006	면역염색을 위한 투명 유리병
24웰 비처리 폴리스티렌 플레이트	피셔 사이언티브	08-772-51	면역염색
5.0 mL 마이크로 원심분리관 및 nbsp;	에펜도르프/시그마 올드리치	EP0030119487-200EA	투명, 200개짜리 상자
6웰 비처리 폴리스티렌 플레이트	피셔 사이언티브	08-772-49	감염 분석
아가르	VWR	89405-066	YPD 매체의 세균학 등급
어플리케이터 스틱	서모피셔/퓨리탄	22-029-491	C. albicans 배양
바이오렌더	바이오렌더 주식회사	해당 없음	도면 삽화를 생성하는 데 사용되는 도형 디자인 소프트웨어
염화칼슘(CaCl2)	시그마-올드리치	C5080-500G	플라나리아 물/몬주우울(Montjuï) 1잔; C 염
<엠>칸디다 알비칸스 다클론 항체 항토끼 IgG	써모피셔	PA1-27158	면역염색
원심분리관	VWR	89039-664	<>C. 알비칸스 채취
배양관 붕규산 유리 18x150mm	VWR	47729-583	C. albicans 배양
쿠벳	피셔 사이언티브	14-955-127	배양의 광학 밀도를 측정하기 위해
포도당(D-포도당)	피셔 사이언티브	D16-3	YPD 매체
글리세롤	피셔 사이언티브	G33-4	분자생물학 등급은 C. albicans 의 냉동 저장을 위한 보조제입니다;
그래프 및 데이터 시각화 도구	그래프패드/프리즘		통계 소프트웨어 및 시각화 도구. 베리슨 10.6.1.
그래프 도구	R		통계 소프트웨어. 베리슨 4.4.3.
인큐베이터 셰이커	에펜도르프	EPM1282-0004-1EA	뉴브런즈윅 이노바 44/44R < 종> C. 알비칸스 배양
염화마그네슘 (MgCl2)	시그마	M8266-100G	플라나리아 물에 대해 그리고 nbsp; (몬주우 1회 ; C 염)
황산마그네슘 (MgSO4)	시그마-올드리치	M7506-500G	플라나리아 물에 대해 그리고 nbsp; (몬주우 1회 ; C 염)
현미경 슬라이드	VWR	16004-368
멀티줌 현미경	니콘		니콘 AZ100
N-아세틸-L-시스테인	시그마 올드리치	A7250-50G	점액 제거 및 희생 시약; 고정
파라말데히드, 16% 용액, 분자생물학 등급	전자현미경 과학	15710	고정성 시약
펠릿 페슬 무선 모터	피셔 사이언티브	12-141-361	플라나리아 균질화
펩톤, 세균학 등급	히메디아/VWR	89129-480	YPD 매체
공약	피셔 사이언티브	12-141-368	플라나리아 균질화를 위한 RNase 무첨가 일회용 펠릿
페트리 접시, 100 x 15mm	VWR	25384-342
폴리(비닐 알코올)	시그마-올드리치	P-8136	겔바톨을 위해
염화칼륨(KCl)	시그마 라이프 사이언스	P9541-500G	플라나리아 매체/물  (몬주우 1회 ; C 염)
2차 항체 염소 항토끼, IgG, Alexa Fluor 568	피셔 사이언티브	A-11011	면역염색
SN250	곰팡이 유전학 자원 센터		야생형 C. albicans 균주 (https://www.fgsc.net/)
아지드 나트륨	피셔 사이언티브	S227-100	겔바톨을 위해
중탄산나트륨(NaHCO3)	시그마-올드리치	S5761-1KG	플라나리아 매체/물  (몬주우 1회 ; C 염)
염화나트륨(NaCl)	시그마 라이프 사이언스	S3014-500G	플라나리아 매체/물  (몬주우 1회 ; C 염)
분광광도계	애질런트	26354	BioTek Epoch 2 마이크로플레이트를 이용해 광학 밀도를 측정할 수 있습니다
정적 인큐베이터	피셔 사이언티브	15-015-2634	C. albicans culturing
이송 피펫	피셔 사이언티브	13-711-9CM	이동하는 플라나리아용 멸균 일회용 점진 피펫
트리스 베이스	시그마-올드리치	252859	겔바톨을 위해
효모 추출물	써모피셔	212750	YPD 매체