Eimeria 기생충에서의 무작위 형도유전자 통합 및 발현 검증

요약

여기서는 형질전환 Eimeria 기생충에서 외래 유전자의 통합 및 발현을 검증하는 표준화된 방법을 제시합니다. 유전체 및 단백질 수준 분석을 통합함으로써 이 워크플로우는 안정적인 유전자 삽입과 발현을 확인합니다. 이러한 접근법은 연구 및 백신 응용을 위한 형질전환 Eimeria 개발을 용이하게 합니다.

초록

형질전환 Eimeria 기생충의 검증은 안정적인 유전체 통합과 외인성 유전자 발현을 확인하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 Eimeria tenella에서 형질전환유전자 삽입과 단백질 발현을 검증하는 포괄적인 워크플로우를 설명합니다. 절차는 포자가 형성된 난자에서 유전체 DNA 추출로 시작되며, 이후 표적 조각의 존재를 예비적으로 확인하기 위해 PCR 증폭을 진행합니다. 게놈 통합을 추가로 확인하기 위해 전체 게놈 재시퀀싱을 통해 삽입 부위를 식별하고 기생충 게놈 내 통합 구조의 안정성을 평가합니다. 단백질 발현은 이후 정제된 스포로조이트에서 추출한 용해액의 서부 블롯팅을 통해 표적 재조합 단백질을 검출할 수 있게 합니다. 또한, 감염된 숙주 세포를 이용한 간접 면역형광 분석법(IFA)을 통해 세포 내 위치 확인이 가능합니다. 이 검사들은 함께 형질전환 Eimeria 계통을 검증하는 견고하고 재현 가능한 틀을 제공합니다. 이 워크플로우는 유전체 통합 및 단백질 발현의 신뢰성 있는 확인을 가능하게 하여, 유전자 조작, 기능적 유전체학, 그리고 Eimeria 기생충을 표적으로 하는 백신 개발 등 후속 응용을 지원합니다.

서론

Eimeria 종에 의해 발생하는 코시디오시스는 가금류에서 가장 경제적으로 중요한 기생충 질병 중 하나로, 체중 증가 감소, 사료 전환 불량, 그리고 매년 수십억 달러에 달하는 전 세계 재정적 손실을 초래합니다 ^1,2,3. 에이메리아 기생충의 유전자 조작은 기초 연구와 백신 개발에 강력한 도구가 되었습니다 ^4,5,6. 안정적인 형질전환은 형광 리포터나 보호 항원과 같은 외부 유전자의 통합 및 발현을 가능하게 하여, 기생충 발현의 실시간 시각화와 백신 후보 ^7,8,9의 표적 평가를 가능하게 합니다.

Duan 등의 이전 논문은 형질전환 기생충 의 핵 확산 및 생체 내 전파를 위한 표준화된 프로토콜을 제공하여 재조합 기생충 계통을 효율적으로 생성하고 풍부하게 하는 방법을 확립했다¹⁰. 그러나 현재로서는 형질전환유전자의 안정적인 유전체 통합 및 기능적 발현을 확인하는 통합 워크플로우는 존재하지 않습니다. 이러한 검증은 하위 생물학 연구나 백신 적용에 사용되는 형질전환 계통의 진위성, 안정성 및 재현성을 보장하는 데 매우 중요합니다.

본 논문은 감염성 점액낭병 바이러스(IBDV) VP2 항원(Et-VP2)을 발현하는 형질전환 E. tenella 계통을 모델¹¹로 사용하여 Eimeria tenella에서 형질전환 통합 및 발현을 검증하는 완전한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 발현 플라스미드 p5′AMic2linkerVP2m3′A는 VP2 유전자와 mCherry 리포터를 탑재하여 야생 E. tenella sporozoites(Et-WT)에 형질전환되었습니다. 붉은 형광 난포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 분리되어 코시디아가 없는 닭에서 연속적으로 전달되었습니다. 이 워크플로우는 유전체 DNA 추출, PCR 기반 예비 통합 분석, 삽입 부위 식별을 위한 전체 유전체 재염기서열, 단백질 발현을 검증하는 웨스턴 블롯팅, 그리고 재조합 단백질의 세포 내 위치를 시각화하는 간접 면역형광 분석법(IFA) 절차를 시연합니다. 이 방법들은 함께 변형 유전자 Eimeria 계통의 진위 여부를 재현 가능하고 포괄적인 틀로 제공하여 기능적 유전체학 연구와 백신 개발에 신뢰성 있게 활용할 수 있게 합니다.

프로토콜

닭을 대상으로 한 모든 동물 실험은 중국농업대학교 기관동물 관리 및 이용위원회(승인 번호: CAU20160628-2)의 승인을 받았습니다. 모든 사육 및 실험 절차는 중국농업대학 기관 동물 관리 및 이용위원회의 지침에 따라 수행되었으며, 동물 관련 생의학 연구를 위한 국제 지침 원칙을 준수하였습니다. 본 연구에는 7일 된 수컷 특이적 병원체가 없는(SPF) 화이트 레그혼 닭이 사용되었습니다. 이 새들은 실험 기간 내내 표준 사육 조건 하에서 사료와 물을 자유롭게 공급받을 수 있도록 유지되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. Eimeria spp의 포자 난자에서 유전체 DNA 추출.

1. 난포 현탁액 1mL(≥1 ×^{10 7}/mL)를 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 난포 알갱이에 해당하는 1mm 유리 구슬을 같은 부피로 추가하세요. 조직 균질제를 사용해 60Hz로 격하게 구슬을 5분간 두드려 난포 벽이 완전히 깨지고 내용물이 방출될 때까지 파괴합니다.
2. 혼합물(유리 구슬 제외)을 새 튜브에 모아 12,000 x g 에서 원심분리기에서 1분간 가열합니다. 상청액을 버리고 500 μL CTAB 버퍼와 40 μL 단백질효소 K를 추가한 뒤, 혼합물을 60 °C에서 30분간 배큐합니다.
3. 500 μL 페놀-클로로포름-아이소아밀 알코올(25:24:1)을 추가하고, 10초 동안 보텍스를 넣고, 12,000 x g 에서 5분간 원심분리합니다. 상부 수상을 새 튜브로 옮기세요.
   참고: 유기층이 포함된 튜브는 환경 오염을 방지하기 위해 단단히 뚜껑을 닫고 폐기하세요. (선택 사항) 단백질 오염이 여전히 높으면 1.3 1–2단계를 추가로 반복합니다.
4. 500 μL 클로로포름을 추가: 아이소아밀 알코올(24:1), 10초간 보텍스, 그리고 12,000 x g 에서 5분간 원심분리기. 수상을 새 튜브로 옮기고 같은 양의 이소프로판올을 추가하세요. DNA 침전물이 나타날 때까지 반전하여 혼합합니다.
   참고: −20°C에서 ≥1시간 또는 밤새 강수량이 증가합니다.
5. 12,000 x g 에서 원심분리기를 10분간 사용해 DNA 펩릿을 채취합니다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척한 후, 12,000 x g 에서 원심분리기를 5분간 사용한 후 상원액을 버립니다. 진공 펌프로 잔류 액체를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 실온 또는 37 °C에서 자연 건조하세요.
6. 건조된 DNA 펠릿을 RNase 함유 ddH₂O 또는 TE 버퍼에 용해합니다. 37°C에서 ≥1시간 또는 4°C에서 하룻밤 배큐하여 잔류 RNA를 제거합니다. 정제된 DNA는 −20 °C에 저장합니다.
   참고: 장기 보존을 위해 용해되지 않은 DNA 펠릿은 −20 °C 또는 −80 °C에서 직접 보관할 수 있습니다. 하위 적용 전에 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 무결성과 농도를 평가합니다.

2. 기생충 게놈 내 Et-VP2 구조체의 존재를 PCR 검증

1. Et-VP2 구성체의 유전체 통합을 검증하기 위한 프라이머 쌍(표 1)을 설계합니다.
   참고: 프라이머 서열은 Primer-BLAST를 사용하여 설계되었으며, 일반적인 파라미터 파미터는 18–24 bp, 녹는점은 약 55–60 °C, 그리고 최소한의 2차 구조 형성을 가졌습니다. 비특이적 증폭을 방지하기 위해 각 프라이머 쌍의 특이성을 Eimeria tenella 게놈 과 비교하여 추가로 검증하였다.
2. 2× Taq 마스터 믹스 25 μL, 21 μL ddH₂O, 각 1 μL 순방향 및 역방향 프라이머, 2 μL DNA 주형을 포함한 50 μL 반응 혼합물을 준비합니다.
3. 다음 열 사이클링 조건을 사용하여 증폭을 수행합니다: 95 °C에서 5분간 초기 변성; 95 °C 30초, 55 °C 30초, 72 °C 1분 30주기; 이후 72°C에서 10분간 최종 연장이 이루어졌습니다.
   참고: 열 사이클링 전에 모든 시약이 충분히 혼합되었는지 확인하세요. 최적 증폭 효율을 위해 갓 준비된 DNA 템플릿을 사용하세요.

3. 형질전환 기생충 계통(Et-VP2) 재염기열 분석

1. 샘플 제출 및 라이브러리 구축
   1. 차세대 재시퀀싱 분석을 위해 1 mL 난포 현탁액(≥1 ×^{10 7}/mL)을 상업 시퀀싱 서비스 제공업체에 제출하세요.
   2. 유전체 DNA의 품질 평가 후, 초음파를 이용한 기계적 파괴로 DNA를 분해합니다. 분해된 DNA를 정제하고, 말단 수리를 수행하며, 3′ 말단에 아데닌(A) 염기를 추가하고, 시퀀싱 어댑터를 연결합니다.
   3. 아가로스 겔 전기영동을 이용해 원하는 크기의 DNA 조각을 선택하고 PCR 증폭을 수행하여 시퀀싱 라이브러리를 구축합니다.
   4. 건설된 도서관에 품질 검사를 받으세요. Illumina NovaSeq 플랫폼에서 150 bp의 읽기 길이를 사용하여 쌍 끝 시퀀싱을 수행합니다. 데이터 정확성을 보장하기 위해 시퀀싱 깊이를 100×로 유지하며, 최소 6GB의 원시 데이터를 생성하고 최소 품질 점수는 Q20>90%)을 요구합니다.
      참고: 모든 시약과 DNA 샘플은 오염을 방지하기 위해 무균 기법을 사용하여 취급하세요. 데이터 분석으로 넘어가기 전에 시퀀싱 매개변수가 필요한 깊이 및 품질 지표를 충족하는지 확인하세요.
2. 데이터 분석
   1. Fastp 소프트웨어(v0.23.2)를 사용하여 다음 기준에 따라 원시 시퀀싱 데이터를 필터링합니다¹²:
      1. 어댑터 시퀀스를 제거하세요.
      2. 저품질 임계값을 Q20으로 설정하고, 전체 읽기 길이의 30% 이상을 차지하는 저품질 염기가 있는 리드를 제거합니다.
      3. 50bp 미만의 측정값은 제거하세요.
   2. 품질 관리 리드를 Bowtie2 소프트웨어(v2.4.5)를 사용해 E. tenella 참조 게놈(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1)과 정렬합니다¹³. 차세대 시퀀싱 데이터의 무작위성은 적용 범위 깊이와 균일성을 기반으로 평가됩니다.
   3. 시퀀싱 리드가 형질전환 벡터 서열과 일치하는지 확인하세요. T-DNA 영역을 매핑하지 않는 리드를 제거하여, 한쪽 끝이 T-DNA에, 다른 쪽 끝이 E. tenella 참조 게놈에 매핑되는 키메라 리드를 얻습니다.
   4. 키메라 리드의 서열을 바탕으로 ToxoDB(릴리스 64)를 사용하여 정렬을 수행하여 잠재적 T-DNA 삽입 부위의 구체적 위치를 결정합니다. Mosdepth 소프트웨어(v0.3.3)를 사용하여 벡터와 Eimeria 게놈 사이의 상동 영역(즉, 5′ 및 3′ 조절 영역)의 시퀀싱 깊이를 분석합니다¹⁴.
   5. E. tenella 게놈 내 형질전환 플라스미드의 잠재적 통합 부위를 식별하고, 2.1단계에서 설명한 반응 시스템을 사용하여 PCR로 이를 검증합니다.
      참고: 데이터 정확성과 재현성을 유지하기 위해 분석 전반에 걸쳐 소프트웨어 버전과 매개변수 설정을 일관되게 사용하세요.

4. 형질전환 에이메리아 단백질의 서부 블롯팅

1. 최소 5개 × 10개⁶ 개의 스포로조이트가 포함된 PBS 현탁액을 1.5mL 원심분리관에 넣고 2500 x g 에서 5분간 원심분리기를 채취합니다. 펠릿을 100 μL RIPA 용해 완충액에 재현탁한 후 얼음 위에 1시간 배양합니다. 6× 단백질 로딩 버퍼 20 μL를 추가하고 혼합물을 100 °C에서 10분간 가열합니다.
2. 1.5mm 유리판을 사용해 SDS-PAGE 겔을 준비하세요. 아크릴아마이드 농도를 표적 단백질의 분자량에 따라 조절합니다. 중합 과정에는 층층 젤을 추가하기 전에 분리 젤을 증류수로 겹쳐 표면이 고르게 만듭니다.
3. 용해액을 10,000 x g 에서 5분간 원심분리하고, 각 샘플 레인에 40μL의 상청액을 주입합니다. 단백질 마커 10 μL을 별도의 통로에 적재하고, 남은 침낭 40 μL의 1× 적재 버퍼를 대조군으로 채웁니다.
4. 1× 버퍼에서 70V로 20분간 전기영동을 수행한 후 120V에서 60–90분간 전기영동을 수행하여 염료 전면이 젤 바닥에 도달할 때까지 진행합니다.
5. 예상되는 단백질 크기에 따라 젤을 절제하세요. PVDF 멤브레인을 메탄올에 1분간 미리 활성화한 후, 다음 순서로 트랜스퍼 샌드위치를 조립합니다: 스펀지, 필터 페이퍼, 젤(음극 쪽), PVDF 멤브레인, 필터 페이퍼, 스펀지. 기포를 제거하고, 단백질을 70V로 3시간 동안 옮겨 버퍼 안에 넣으세요.
6. 멤브레인을 PBST로 세 번(각각 5분씩) 세척한 후, 5% 무지방 우유로 실온에서 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 블로킹하세요. 멤브레인을 PBST로 두 번 세척해 잔여 차단 용액을 제거하세요.
7. 항체 완충제에 희석된 1차 항체(마우스 폴리클론 항-Flag(1:2000)와 마우스 단클론 항-GAPDH(1:2000)로 막을 배양합니다. 상온에서 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 부드럽게 흔들어 배양하세요. 항체 용액을 수집하고 막을 PBST로 5번(각각 5분씩) 세척합니다.
8. HRP 결합 염소 항쥐 IgG(1:2000)와 함께 상온에서 1시간 동안 막을 배양합니다. 막을 PBST로 5번(각각 5분) 세척하세요.
9. 용액 A와 B를 같은 양으로 혼합하여 ECL 기판을 준비합니다. 기판을 막에 고르게 적용하고 화학발광 이미징 시스템을 사용해 단백질 신호를 검출합니다.
   참고: 별도 명시가 없는 한 얼음 위에 단백질 샘플을 사용하는 모든 단계를 수행하십시오. 메탄올과 ECL 기질은 장갑과 보호 안경을 착용한 채 연기구 후드에서 다루세요.

5. 형질전환 Eimeria 세포내 간접 면역형광 분석법(IFA)

1. 크로마토그래피 컬럼을 이용한 포자자체 정제
   1. 크로마토그래피 컬럼을 연동 펌프에 연결하고 유량을 50–60Hz로 조절합니다. 컬럼을 증류수와 글리신 용액으로 세척합니다.
   2. 셀룰로오스 층이 약 1cm 높이에 도달할 때까지 지속적으로 글리신 용액을 컬럼에 첨가합니다.
   3. Percoll 방법으로 정제한 스포로조이트를 컬럼에 적재합니다. 글리신 용액을 사용해 30–40Hz의 유량을 유지하고, 50mL 원심분리관에 흐름을 수집합니다.
   4. 현미경 관찰을 위해 유리 슬라이드에 방울을 놓아 유출액을 모니터링하세요. 스포로조이트가 감지되지 않으면 펌프를 멈추세요. 수집된 분획을 2,500 x g 에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 버리고 펠릿을 PBS에 재현탁합니다.
      참고: 모든 과정을 멸균 환경에서 수행하여 미생물 오염을 방지하세요. 글리신 및 퍼콜 폐기물은 기관 생물안전 규정에 따라 처리해야 합니다.
2. HFF 세포의 스포로조이트 감염
   1. HFF 세포 단층을 포함하는 24웰 플레이트에 1× 10개의 6개의 포자자이트를 씨앗. 페니실린-스트렙토마이신을 최종 농도인 1×(페니실린 100 U/mL와 스트렙토마이신 100 μg/mL)에 첨가하고, 부드럽게 혼합한 후 37 °C에서 4–6시간 배큐하여 침투를 허용합니다. 배지를 제거하고 1mL PBS로 한 번 세척한 후 상원액을 버리세요.
   2. 멸균 겸자를 사용해 유리 덮개를 조심스럽게 제거하여 새 24개 웰 플레이트로 옮기세요. 샘플을 4% 파라포름알데히드 1mL에 30분간 고정한 후, 1mL PBS로 한 번 세척한 후 상상액을 버립니다.
   3. 0.25% Triton X-100 1mL로 세포를 30분간 투과시킵니다. 1 mL PBS로 한 번 세척한 후 상원액을 버리세요.
   4. 3% BSA 1mL로 샘플을 30분간 차단하세요. 1 mL PBS로 한 번 세척한 후 상원액을 버리세요.
   5. 3% BSA에 희석한 마우스 단클론 항-플래그 항체(1:200)를 투여합니다. 희석된 항체를 밀봉 필름 위에 떨어뜨리고 커버슬립(세포 면이 아래)을 뒤집어 그 방울 위에 올립니다. 커버슬립을 37°C의 가습 챔버에 1시간 동안 부양하세요. 1mL PBS로 세 번(각각 5분씩) 세척하세요.
   6. 3% BSA에 희석된 FITC 결합 염소 항생쥐 IgG(1:200)와 Hoechst 33258(1:100)을 희석합니다. 스테인 혼합물을 밀봉 필름 위에 떨어뜨리고 커버슬립을 뒤집어 그 위에 올리세요. 37°C의 가습 챔버에서 1시간 배양한 후, 1mL PBS로 5회(각 5분) 세척합니다.
   7. 커버슬립을 5μL 안티페이드 마운팅 매체를 유리 슬라이드에 올려 장착하세요. 커버슬립(셀 면이 아래)을 방울 위에 뒤집어 공기 방울을 피하고 가장자리를 밀봉하세요. 장착된 슬라이드는 영상 촬영 전까지 4°C의 가습 챔버에 보관하세요.
      참고: 파라포름알데히드와 트리톤 X-100은 장갑과 안경 보호구를 착용한 채 화학 연기 후드에서 다룰 수 있습니다. 이 절차에서 사용되는 시약 제형은 표 2에 나열되어 있습니다.

결과

유전체 PCR 분석은 형질전환 기생충에서 표적 조각의 존재를 확인한 반면, 야생형 대조군에서는 해당 밴드가 검출되지 않았습니다(그림 1A). 전체 게놈 재시퀀싱을 통해 선형성된 플라스미드가 기생충 게놈에 안정적으로 통합되어 있음을 보여주었으며, 연결 영역을 가로지르는 PCR 증폭으로 예측된 통합 부위가 검증되었습니다(그림 1B).

단백질 발현은 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 검증되었으며, 형질전환 균주에서 융합 단백질의 예상 분자량에 해당하는 뚜렷한 밴드가 발견되었습니다. 야생형 대조군에서는 신호가 관찰되지 않았습니다(그림 2).

간접 면역형광 분석은 형질전환 유전자를 발현하는 스포로조이트 내...

토론

이 프로토콜은 형질전환 E. tenella에서 유전체 통합, 단백질 발현, 세포 내 유전자 위치 확인을 위한 포괄적인 워크플로우를 확립합니다. 단일 분석에 의존하는 대신, 이 접근법은 유전체 및 단백질 수준의 증거를 결합하여 형질전환 유전자 삽입이 구조적으로 확인되고 기능적으로 발현되도록 보장합니다.

이 프로토콜의 여러 중요한 단계가 형질전환 혈통의 성공적인 검증에 큰 영향을 미칩니다. 이러한 단계들이 신중하게 최적화되지 않으면 기술적인 문제가 발생할 수 있습니다. 정제된 기생충 물질에서 추출한 고품질 유전체 DNA는 신뢰할 수 있는 PCR 증폭과 후속 시퀀싱 분석에 필수적입니다. 난자포의 교란이 부족하거나 숙주 세포 물질에 오염되면 DNA 품질이 저하되어 DNA 수율이 낮고 PCR 증폭이 약하거나 불안정해질 수 있습니다. 이러한 문제는 균질화 시간을 연장하거나 구슬 박동 강도를 높여 완화할 수 있습니다...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티페이드 마운팅 미디엄	MCE	HYK1042	형광 마운팅 미디엄으로 광퇴백 방지
BSA (3%)	Beyotime	ST023	IFA용 차단 버퍼 및 항체 희석 버퍼; 30분 동안 상온에서 차단
클로로포름:아이소아밀 알코올 (24:1)	Sigma	C0549	게놈 DNA 추출 중 잔류 페놀 제거용 시약
코시디아 없는 닭	Boehringer-Ingelheim	SPF	형질전환 주 생체 내 통과 및 증폭에 사용; 윤리위원회 승인(승인 번호: CAU20160628-2)
CTAB(세틸트리메틸암모늄 브로마이드)	Merck KGaA	H5882	게놈 DNA 추출 버퍼 성분; 배합: 3g CTAB + 12.27g NaCl + 15mL 1 mol/L Tris-HCl + 6mL 0.5 mol/L EDTA, 최종 용량 150mL로 ddH2O로 조정
DE-52 셀룰로오스	Solarbio	C8350	포자충 정제용 이온 교환 크로마토그래피 미디엄; NaOH, HCl, 증류수로 순차적으로 처리 후 글리신 용액으로 평형화
ECL 기질 (용액 A + 용액 B)	thermofisher	32106	화학 발광 검출 시약; 사용 전에 용액 A와 B를 동일 부피로 혼합
FITC-결합 염소 항-마우스 IgG	Sigma	AP124F	IFA용 형광 2차 항체, 희석 비율 1:200
유리 비드	Sigma	Z250473-1PAK
글리신 용액	Sigma	67419	크로마토그래피 칼럼의 평형화 및 용출 버퍼; 조성: 0.75g 글리신 + 7.9g NaCl을 500mL 증류수에 용해, pH 7.4-7.6로 조정, 오토클레이브
Hoechst 33258	Sigma	94403	핵 염색 시약, 희석 비율 1:100; IFA 위치 확인에 사용
HRP-결합 염소 항-마우스 IgG	Sigma	12-349	웨스턴 블로팅용 2차 항체, 희석 비율 1:2000
Illumina NovaSeq 시퀀싱 플랫폼	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (상해, 중국)		차세대 시퀀싱 플랫폼; 페어드 엔드 시퀀싱 (150 bp 판독 길이), 시퀀싱 깊이 100×, ≥6 GB 원시 데이터 생성 (Q20>90%)
저속 원심분리기	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE	DT5-2
마우스 단일클론 항-플래그 항체	Sigma	F1804	1차 항체, 희석 비율 1:200; 플래그 태그 융합 단백질 IFA 탐지에 사용
마우스 단일클론 항-GAPDH 항체	Sigma	G8795	1차 항체, 희석 비율 1:2000; 웨스턴 블로팅 로딩 컨트롤로 사용
무지방 우유 (5%)	Beyotime	P0216	웨스턴 블로팅용 차단 버퍼; 1시간 동안 상온 또는 1박 동안 4°C에서 차단
파라포르말데하이드 (4%)	Merck KGaA	30525	세포 고정 용액; 30분 동안 상온에서 고정
PBS	Solarbio	P1010
페니실린-스트렙토마이신 (100×)	Yeasen	60162ES76	세포 배양용 항생제; 미생물 오염 억제
Percoll (DG 그라데이션 스톡)	GE Healthcare	17-0891-09
페놀:클로로포름:아이소아밀 알코올 (25:24:1)	Merck KGaA	77617	게놈 DNA 추출 중 단백질 제거용 시약
단백질 로딩 버퍼 (6×)	Beyotime	P0015F	단백질 전기영동 로딩 버퍼; 조성: 100 mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% 글리세롤, 6 M 우레아; 사용 전에 50 μL 2 M DTT와 50 μL 5% 브로모페놀 블루를 혼합
단백질분해효소 K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg을 10 mL ddH2O에 용해, 게��