약용 식물에서 트로판 알칼로이드의 정량을 위한 효율적이고 빠른 HPLC-QQQ-MS 방법

요약

이 연구는 고성능 액체 크로마토그래피와 삼중 사중극 질량분석법(HPLC-QQQ-MS) 방법을 결합하여 Anisodus tanguticus 내 트로판 알칼로이드(히오시아민, 아니소다민, 스코폴라민)를 식별하고 정량하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 약용 식물의 고처리량 분석에 있어 신속하고 정확하며 신뢰할 수 있음이 입증되었습니다.

초록

아니소두스 탕구티쿠스 는 중요한 티베트 약용 식물입니다. 히오시아민, 아니소다민, 스코폴라민과 같은 트로판 알칼로이드(TA)는 상당한 진통제 및 진정 약리학적 활성을 보여 이 종은 이러한 생리활성 화합물 추출에 귀중한 자연 공급원이 됩니다. 그러나 A. tanguticus 의 화학적 조성은 매우 복잡합니다. 이 과정은 명확히 밝혀지지 않은 다수의 화합물을 포함하므로, 활성 성분의 체계적 식별과 구조적 특성 규명이 특히 중요합니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 이 식물에서 추출물을 분리하는 데 널리 사용되고 있지만, 스펙트럼 데이터베이스 매칭을 통해서도 정확히 식별하는 데 여전히 많은 미지의 성분이 남아 있습니다.

이 연구는 고성능 액체 크로마토그래피와 삼중 쿼드러폴 질량분석법(HPLC-QQQ-MS)을 결합한 분석 방법을 확립하여 A. tanguticus에서 트로판 알칼로이드를 결정하는 방법을 확립하였습니다. 이 방법은 표준화된 시료 준비, 질량분석파라미터 구성, LC 예평형화, 방법 확립, MS 데이터 획득, 다단계 질량분석(MSⁿ) 스캔, 수동 데이터 해석 등 일련의 체계적인 절차를 포함합니다. 이 전략을 사용하여 A. tanguticus에서 대표적인 트로판 알칼로이드 세 가지인 히오시아민, 아니소다민, 스코폴라민을 성공적으로 확인했습니다. 또한, 확립된 HPLC-QQQ-MS 방법의 정밀도를 검증하여, 이 방법이 A . tanguticus 에서 트로판 알칼로이드(TA)의 정량적 결정에 빠르고 민감하며 실현 가능하고 정확함을 확인했습니다. 확립된 접근법은 우수한 다재다능성과 신뢰성을 보여주며, A. tanguticus 및 기타 약용 식물에서 트로판 알칼로이드의 고처리량 식별 및 정량에 적합합니다.

서론

전통 한의학(TCM)의 치료 효능은 주로 알칼로이드, 플라보노이드, 테르페노이드 및 기타 활성 성분과 같은 2차 대사산물에 달려 있습니다 ^1,2,3. 따라서 이러한 복잡한 혼합물에서 특정 표적 대사산물에 대한 정밀하고 민감한 정성·정량적 분석은 TCM의 품질을 보장하고, 효능의 물질적 근거를 밝히며, 현대 연구를 발전시키는 데 핵심적인 단계입니다^. 그러나 TCM 성분의 다양성과 복잡성, 그리고 많은 주요 활성 성분의 극히 낮은 농도는 효율적이고 정확한 검출에 상당한 도전을 제기합니다.

Anisodus tanguticus (Maxim.) 파셔는 약리학적으로 활성하는 트로판형 화합물의 풍부한 함량으로 알려진 트로판 알칼로이드(TAs^)의 주요 식물학적 공급원입니다^. 주요 특징 알칼로이드로는 아니소다민, 스코폴라민, 히오시아민이 있으며, 이들은 공통의 트로판 코어를 공유하지만 뚜렷한 기능기 치환을 보여 약리학적 프로필 ^6,7,8을 이룬다(그림 1). 구조적 유사성이 크로마토그래피 해상도를 다소 복잡하게 만들지만, 식물화학적 및 대사 연구를 비교하는 데 유용한 모델을 제공합니다. 최근 연구들은 대사체학과 네트워크 약리학 접근법을 사용하여 A. tanguticus의 화학적 조성과 지리적 변이를 조사했습니다. ^9,10. 현재 A. tanguticus 대사산물에 대한 분석 방법은 주로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의존하고 있습니다¹¹. 그럼에도 불구하고 묘목 단계의 A. tanguticus에서 트로판 알칼로이드 수치는 0.01%(만 개당 1)까지 낮을 수 있으며, 기존 HPLC 방법은 해상도, 감도, 분석 처리량의 한계로 인해 제약을 받는 경우가 많습니다. 이러한 한계는 구조적으로 유사한 알칼로이드 상동체의 완전한 분리를 방해하고, 미량 성분의 검출을 방해하여 분석 정확도를 저해하고 더 고급 연구 응용 지원에 제한을 줍니다. 최근 몇 년간 HPLC의 발전과 탠덤 질량분석법의 결합으로 이러한 분석 병목 현상을 해결할 수 있는 강력한 도구가 제공되었습니다. 특히 고성능 액체 크로마토그래피-삼중사중극 질량분석법(HPLC-QQQ-MS)은 현저히 향상된 크로마토그래피 해상도, 분리 효율, 그리고 뛰어난 감도를 제공합니다 12,13,14. 이 기술은 TCM에서 2차 대사물 조사를 위한 최첨단 플랫폼으로 등장하여, 복잡한 생물학적 행렬 11,15,16,17 내에서 미량 표적 분석물의 효율적이고 정확한 정량 및 검증을 가능하게 합니다. 따라서 A. tanguticus와 같은 약용 식물의 포괄적인 화학적 프로파일링 및 품질 평가를 위한 견고한 기술적 기반을 제공합니다. 본 연구에서는 A. tanguticus에서 트로판 알칼로이드 검출에 있어 지속적인 어려움을 다루며, 미량 구성 성분의 정확한 식별과 정량화에 중점을 둡니다. 크로마토그래피 및 질량분석 조건을 체계적으로 최적화함으로써, 우리는 여러 주요 트로판 알칼로이드를 동시에 측정할 수 있는 새로운 HPLC-QQQ-MS 방법을 개발하고 검증하였습니다. 최적화된 접근법은 감도, 선택성, 방법론적 견고성을 크게 향상시켜, 미량 알칼로이드 화합물 분석 시 흔히 발생하는 감도 부족, 매트릭스 효과, 공용체 간섭 등 기존 질량분석법 기반 분석법의 일반적인 한계를 극복합니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 표준 용액 준비
   1. 히오시아민, 아니소다민 하이드로브롬마이드, 스코폴라민 하이드로브로마이드 기준 기준액 각각 10.0mg을 10,000분의 1 분석 저울로 정확히 계량하여 각각 10 mL 부피 플라스크에 담습니다.
   2. 표시된 선에 크로마토그래피 등급 메탄올을 추가하고, 초음파 처리를 이용해 1.0 mg/mL 농도의 단일 표준 용액을 준비하여 완전히 용해합니다.
   3. 기존 용액을 갈색 시약병에 옮겨 어두운 곳에서 4°C에 보관하세요.
      참고: 사용되는 알칼로이드는 매우 독성이 강합니다. 표준 샘플을 다룰 때는 안전 수반을 철저히 하세요. 모든 용액은 분석 전에 신선하게 준비되어 분해를 방지하기 위해 4°C 온도에서 어두운 곳에 보관되었습니다.
2. 혼합 작업 용액의 준비
   1. 앞서 언급한 각 스톡 용액 100 μL를 10 mL 부피 플라스크에 피펫 넣고, 크로마토그래피 등급 메탄올로 표시된 선까지 희석하여 10 μg/mL의 혼합 표준 중간 용액을 만듭니다.
   2. 선형 범위 요구사항에 따라 중간 용액을 메탄올로 단계별로 희석하여 일련의 혼합 작업 용액을 얻습니다.
   3. 각각 50 μL, 200 μL, 500 μL을 가져가세요. 0.5 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL의 농도를 얻습니다. 사용 전에 신선하게 준비하세요.
   4. 10 μg/mL 중간 용액 100 μL을 1 mL 부피 플라스크에 옮겨 1 μg/mL 희석 용액을 준비합니다.
   5. 그 후 1 μg/mL 용액 100 μL을 또 다른 1 mL 부피 플라스크에 옮기고 메탄올로 희석합니다.
3. 샘플 전처리
   1. Sophora flavescens의 신선한 재료를 동결건조한 후 고속 분쇄기를 사용해 균질한 분말로 분쇄합니다.
   2. 분말을 0.25mm 표준 체에 걸러주세요. 이 가루 20mg을 정확히 계량하여 100 mL 부피 플라스크에 옮긴 후 크로마토그래피 등급 메탄올을 거의 표시된 선에 넣으세요.
   3. 상온에서 30분간 초음파 추출을 수행하세요. 추출 후에는 부피 플라스크를 꺼내 실온에서 25°C까지 식힌 후, 크로마토그래피 등급 메탄올을 100 mL 표시선까지 보충한 후 2분간 보텍스 혼합합니다.
   4. 위 추출물 1mL를 100mL 부피 플라스크에 피펫팅하고, 메탄올로 표시된 선까지 희석합니다(100배 희석). 흔들림 후 HPLC 주입의 모체 용액 역할을 합니다(그림 2).
      참고: 고속 연삭기를 조작할 때는 보호 고글과 방진 마스크를 착용하는 것이 필수적입니다; 과열을 방지하기 위해 분쇄량과 시간을 조절하세요.
4. 샘플 여과 및 저장
   1. 1 mL 일회용 바늘 없는 주사기(크로마토그래피 특수, 비흡착)와 0.22 μm 유기상 미세다공성 막을 준비합니다.
   2. 주입할 때 모체 용액 1.2mL를 흡입한 후 천천히 밀어 여과하세요.
   3. 이후 여과액을 내부 삽입물이 있는 2mL 샘플 바이알에 모아 뚜껑으로 단단히 밀봉합니다.
      참고: 초음파 세척기의 주파수는 40kHz로 고정되어 있습니다. 추출 시 용매 휘발을 방지하기 위해 부피 플라스크 캡을 느슨하게 하지 마세요. 사전 실험에서 샘플 피크 반응에 따라 희석 계수를 조정하여 목표 피크 면적이 표준 곡선의 선형 범위 내에 있도록 합니다. 모든 샘플은 즉시 4°C의 냉장고에 보관해야 합니다.

2. HPLC 사전 실행, 방법 확립 및 실체 획득

1. 이동상 준비
   1. 이동상 A를 준비하세요: 초순수 1000mL를 측정하고, 크로마토그래피 등급의 개산(부피 비율: 0.1% v/v)을 1.0mL 첨가한 후, 자기 교반기로 10분간 균등하게 혼합합니다.
   2. 이동형 B 단계 준비: 추가 처리 없이 크로마토그래피 등급 메탄올을 직접 사용하세요.
   3. 이동상 A와 B를 각각 초음파 탈기 장치에 부어 40kHz에서 15분간 초음파 탈기를 수행합니다.
   4. 탈기 후 즉시 탈기된 이동상을 용매 병에 옮기고, 밀봉한 후 HPLC 시스템의 해당 A, B 용매 라인에 연결하세요.
      참고: 모든 용매는 크로마토그래피 등급이며, 사용 전에 0.45 μm 유기 상 미분다공성 막을 통과해야 합니다. 시스템 압력을 정기적으로 모니터링하세요. 압력 변동이 ±±5%를 초과하면 파이프라인 내 컬럼 막힘이나 공기 방울이 있는지 확인하세요.
2. HPLC 조건 설정
   1. 크로마토그래피 분리에는 C₁₈ 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 2.7 μm)을 사용하세요. 사용 전 30분 동안 메탄올:물 = 80:20 (v/v)로 컬럼을 평형시키고, 평형 과정 동안 유량은 0.3 mL/분으로 유지합니다. 컬럼 오븐 온도를 30°C로 설정하고, 10분 전에 예열을 시작하세요.
   2. 다음과 같이 그라디언트 용출 프로그램을 최적화합니다: 0–10.0분, 5%에서 10% B; 10.0–15.0분, 10%에서 35% B; 15.0–20.0분, 35%에서 60% B; 20.0–25.0분, 60%에서 95% B. 유속을 0.60 mL/min, 주입 부피를 2 μL, 검출 파장을 210 nm로 설정.
3. 질량분석 조건
   1. 양 이온화 모드(ESI+)로 작동하는 전기분무 이온화(ESI) 소스가 장착된 삼중쿼드러폴(QQQ) 질량분석기를 사용하여 질량분석(MS) 검출을 수행합니다.
   2. 작동 매개변수를 다음과 같이 설정하세요: 네뷸라이저 압력: 15 psi; 모세관 전압: 4000 V; 가스 온도: 300 °C; 가스 유량: 분당 11 L.
   3. 각 분석제의 MS/MS 파라미터를 체계적으로 최적화합니다.
      1. 먼저, MS2 SCAN 모드에서 개별 표준 용액을 직접 주입하여 전구체 이온을 식별합니다.
      2. MS2 SIM 모드를 사용하여 각 전구자 이온의 프래그먼터 전압을 최대 신호 강도로 최적화합니다.
      3. 그 다음, 생성물 이온 스캔 모드를 사용하여 특성적인 생성물 이온을 결정합니다. 전구체 이온의 충돌 에너지(CE)를 체계적으로 최적화하여 생성물 이온 신호 강도를 극대화합니다.
      4. 정량화를 위해 가장 강한 생성물 이온을 선택하고, 정성적 확인을 위해 두 번째로 강한 이온을 사용하세요.
         참고: MS2 SCAN 모드에서 개별 표준 용액을 직접 주입하여 전구체 이온을 식별합니다. 표준 용액 농도가 적절한지 확인하여 신호 포화를 방지하세요. 파라미터 드리프트를 피하기 위해 기기를 정기적으로 보정하세요.
4. 메서드 검증
   1. 특이성
      1. 빈 용매(메탄올), 혼합 표준 작업 용액, 샘플 추출물을 각각 주입한 후 크로마토그램을 비교합니다.
      2. 다음 요구사항을 충족하는지 확인하세요: 빈 용매 내에 간섭 피크가 없어야 합니다; 샘플 내 목표 성분의 보존 시간은 표준과 일치합니다(편차≤ ±±0.1분); 정량자 이온과 적정자 이온의 피크 면적 비율은 표준(편차≤ ±±10%)과 일치합니다.
   2. 선형성
      1. 1.1단계에서 준비된 혼합 작업 용액 시리즈(0.1, 0.5, 2, 5, 10 μg/mL)를 앞서 언급한 HPLC-MS 조건 하에서 순차적으로 3회 주입하여 농도당 3회 주입합니다.
      2. 각 성분의 농도(x, μg/mL)를 아브시사로, 양화자 이온의 평균 피크 면적(y)을 정렬 값으로 표준 곡선을 그립니다. 상관계수 (R²) ≥ 0.995가 필요한 선형 회귀분석을 수행한다.
   3. 정밀도와 정확성
      1. 일중 정밀도(반복성): 하루 동안 3가지 농도(2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL)의 품질 관리(QC) 샘플 6회 복제를 분석하고 상대 표준편차(RSD%)를 계산합니다.
      2. 중간 정밀도: 동일한 건조 식물 원료 배치에서 독립적으로 QC 샘플을 추출하여 서로 다른 작업자가 3일 연속으로 분석합니다. RSD%를 계산합니다. 두 가지 모두 RSD% ≤ 10%로 설정하세요.
      3. 스파이크-리커버리 테스트를 사용하여 정확도를 평가하고, 회복률(%)로 표현합니다. 저농도, 중도, 고농도의 평균 회복률을 85%에서 115% 사이로 유지하며, RSD%≤ 5%로 맞추세요.
         참고: 선형 범위는 실제 시료(저농도, 중농도, 고농도 포함)에서 목표 성분의 예상 농도 범위를 포함해야 하며, 이는 실용적 적용을 반영해야 합니다. 모든 검증 실험은 3분으로 수행되었으며, 결과는 평균값으로 표현되었습니다.

3. 데이터 수집

1. 다중 반응 모니터링(MRM) 모드에서 데이터 수집을 수행합니다. 각 분석물에 대한 최적화된 MRM 매개변수(전구체 이온, 생성물 이온 전이, 분편자 전압, 충돌 에너지(CE)는 표 1 을 참조하십시오.
2. 각 크로마토그래피 피크마다 적절한 데이터 포인트 수를 확보하고 적절한 주기 시간을 유지하기 위해 잔류 시간을 계산합니다.

4. 데이터 분석

1. 정성적 분석 소프트웨어를 실행하고, 파일 > 데이터 가져오기를 클릭 한 후 수집된 모든 데이터 파일(.d 형식)을 가져오세요.
2. 추출된 이온 크로마토그램(EIC) 추출: 정량 모듈에서 MRM 전이를 선택하고 각 성분의 전구체 이온-생성물 이온 쌍을 입력한 후 해당 EIC를 추출합니다.
3. 피크 검증 및 통합: 각 EIC에서 목표 피크의 피크 대칭성과 보존 시간 일관성(표준 대비 편차≤ ±±0.1분)을 점검합니다.
4. 소프트웨어는 기본적으로 자동 통합을 수행합니다; 기준선 드리프트나 간섭 피크가 존재한다면, 정확한 적분을 위해 적분 매개변수(적분 시작점과 종료점)를 수동으로 조정하세요.
5. 표준 곡선을 사용하여 미지의 샘플에서 각 성분의 농도를 계산합니다. 보고서를 > 생성 버튼을 클릭하고, Excel 형식을 선택하여 보고서를 내보내세요. 보고서에는 화합물 이름, 잔류 시간, 피크 면적, 농도, RSD% 등이 포함되어 있습니다.

결과

HPLC-QQQ-MS 크로마토그래피 분리 및 TA 식별
표준 혼합물과 A. tanguticus 뿌리 추출물 분석을 통해 얻어진 전형적인 MRM 크로마토그램은 그림 3과 그림 4에 제시되어 있습니다. 최적화된 HPLC 조건 하에서 3가지 표적 트로판 알칼로이드인 히오시아민, 아니소다민, 스코폴라민이 20분 이내에 성공적으로 분리되어 개발된 방법의 높은 효율성을 입증했습니다. 스코폴라민과 아니소다민 간 해상도(Rs)는 8.67로, 아니소다민과 하이오시아민 간 해상도는 11.58로 확인되었다. 모든 해상도 값은 기준선 분리 기준인 1.5를 상당히 초과하여 크로마토그래피 간섭이 없음을 나타내고 정확한 정량 분석에 적합함을 확인했습니다. 모든 화합물은 날카롭고 대칭적인 피크 형태를 보였으며, 최소한의 매트릭스 간섭으로 우...

토론

식물 2차 대사산물에 대한 관심이 높아지면서 알칼로이드 검출을 위한 분석 기법이 큰 관심을 받고 있습니다. 트로판 알칼로이드(TA) 분석을 위한 기초 크로마토그래피^{시스템이 확립}되었으나, 모세관 전기영동(CE) 도입, GC–MS 및 HPLC–MS에서의 기기 성능 향상, 그리고 콘폴바인 및 트로피논 유사 독소를 포함한 새로운 구조 화합물의 확인과 같은 최근 발전은 이러한 알칼로이드에 대한 현재 크로마토그래피 방법론에 대한 체계적 검토의 필요성을 강조합니다^{. 19, 20, 21, 22}. TA에 대한 분석 요구사항은 상황에 따라 다릅니다: 식물 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agilent MassHunter 소프트웨어	Agilent Technologies
Agilent ZORBAX SB-C18 컬럼	Agilent Technologies	880975-902	C18 역상 컬럼, 4.6 × 250 mm, 5 μm
아니소다민 하이드로브로마이드	청두 글립 바이오테크놀로지 유한공사	101-31-5	HPLC>98%
포름산	Sigma-Aldrich	5.33002
동결 건조기	EYELA, 도쿄, 일본	FDU-2110
고속 범용 분쇄기	타이사이트 인스트루먼트 유한공사, 중국 톈진	6010210100	FW-100, 24,000 rpm, 100 g 용량, 80 메쉬
히오스시아민	청두 글립 바이오테크놀로지 유한공사	55449-49-5	HPLC>98%
메탄올	써모피셔 사이언티픽	022909.K2
0.22μm 미세공 멤브레인	밀리포어	SLGV033RB
밀리-Q Direct 8 정수 시스템	밀리포어시그마, 버링턴, MA, 미국	ZRQSVP0JP
스코폴라민 하이드로브로마이드	청두 글립 바이오테크놀로지 유한공사	114-49-8	HPLC>98%