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방법 논문

약물 치료 후 간세포암 오르가노이드의 생성 및 단세포 전사체 분석

495 조회수

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DOI:

10.3791/70511

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2026년 5월 26일

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 간세포암 오가노이드를 생성하고, 약물 치료를 적용하며, 치료 전후로 단세포 RNA 시퀀싱을 수행하여 치료 관련 전사 변화를 특성화하는 간소화된 방법을 제시합니다.

초록

간세포암은 전 세계적으로 암 관련 사망률의 주요 원인이며, 현저한 종양 내 이질성이 특징으로 치료 반응의 변동, 종양 재발, 질병 진행에 기여합니다. 따라서 약물 치료 전후로 종양 세포가 전사 수준에서 어떻게 변화하는지에 대한 더 깊은 이해는 치료 전략 개선에 필수적입니다. 그러나 오가노이드 기반 약물 치료와 하위 단세포 전사체 프로파일링을 연결하는 실질적인 실험적 워크플로우는 여전히 제한적입니다. 본 연구에서는 간세포암 오르가노이드 생성, 정의된 약물 치료 적용, 치료 전후 샘플에 대한 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 표준화된 워크플로우를 개발하였습니다. 프로토콜에는 오르가노이드 재생 및 증식, 치료 전 품질 평가, 약물 노출, 단세포 해리를 위한 오르가노이드 준비, 라이브러리 구축, 그리고 단세포 전사체 데이터의 기본 비교 분석이 포함됩니다. 재현성과 샘플 품질 향상을 위한 중요한 기술적 주의 조치가 제공됩니다. 이 워크플로우는 간세포암 오르가노이드에서 약물 치료와 관련된 세포 구성과 전사 변화를 병행하여 특성화할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 견고하고 확장 가능하며 다양한 오가노이드 시스템에 적응할 수 있어 단일 세포 해상도에서 치료 관련 유전자 발현 변화를 연구할 수 있는 실용적인 플랫폼을 제공합니다.

서론

간세포암(HCC)은 성인에서 가장 흔한 원발성 간암이며, 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인입니다 1,2,3. 임상 결과가 좋지 않은 이유는 종양 내 이질성이 크기 때문이며, 이는 치료 내성과 재발로 이어집니다. 최근 연구에 따르면, FOXM1/CEBPB 축과 같은 주요 전사 프로그램에 의해 발생하는 발달 다양성과 세포 상태 가소성이 HCC5의 치료 내성에 기여한다고 밝혔습니다. 이러한 발견은 종양 세포 집단이 지속적인 치료 압력 하에서 어떻게 적응하고 상태 간 전이가 되는지를 이해할 필요성을 강조합니다. 그러나 대부분의 전임상 모델은 이러한 치료 관련 상태 전이의 역동적이고 연속적인 특성을 충분히 포착하지 못해 종양 적응과 치료 실패에 대한 기전적 연구를 제한합니다.

환자 유래 오가노이드(PDO)는 원래 종양의 중요한 유전체 변형과 세포 이질성을 보존하기 때문에 이 목적에 유용한 플랫폼을 제공합니다. HCC 오가노이드는 주요 조직 특징7을 유지하면서 장기 배양 시 유지할 수 있어 치료 반응 연구에 특히 적합합니다. 또한, 오가노이드 기반 연구들은 간암 오가노이드를 약물 시험에 활용하고 환자 간 및 종양 내 치료 민감도의 차이를 포착하는 데 활용하는 가능성을 입증하여, 치료 반응 연구의 전임상 모델로서의 가치를 뒷받침했습니다 8,9. 그러나 대부분의 오가노이드 기반 약물 연구는 여전히 주로 종말 생존 가능성 측정에 의존하거나 대량 표현형 반응에 집중하여 이질적인 세포 반응과 치료 관련 전사 변화에 대한 제한된 정보만 제공합니다. 동시에 HCC에 대한 RNA 기반 치료 전략의 빠른 개발은 단일 세포 해상도10으로 치료 반응을 정확히 예측하고 기전적으로 분석할 수 있는 전임상 시스템의 필요성을 더욱 강조합니다.

단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 오르가노이드 모델내에서 세포 구성과 전사 상태를 고해상도로 특성화할 수 있게 합니다. 처리 전후에 수집된 오가노이드에 적용할 때, scRNA-seq는 유전자 발현 변화, 세포 집단의 변화, 그리고 대량 분석법으로는 포착되지 않는 이질적 반응을 드러낼 수 있습니다. 따라서 이 접근법은 HCC 오가노이드에서 치료 관련 전사 재형성을 연구하는 실용적이고 강력한 전략을 나타냅니다. 그러나 HCC 오가노이드 배양, 약물 치료, 치료 전후 단세포 RNA 시퀀싱을 통합하는 실용적이고 재현 가능한 워크플로우는 여전히 부족합니다. 이러한 워크플로우는 약물 노출 시 오가노이드 무결성을 유지하고 하위 단일 세포 프로파일링을 위한 충분한 생존 세포가 회수될 때 가장 효과적입니다. 다른 오가노이드 기반 접근법과 마찬가지로, 중요한 한계는 종양 미세환경의 기질, 혈관, 면역 구성 요소의 불완전 표현과 장기간 시험관 배양 시 선택 편향 가능성 등이 있습니다.

HCC 오가노이드 생성, 정의된 약물 처리 적용, 단세포 RNA 시퀀싱을 위한 오르가노이드 샘플 처리 전후 처리 과정을 통합한 실험 워크플로우가 기술되어 있습니다. 이 워크플로우에는 오가노이드 부활 및 확장, 치료 전 품질 평가, 통제된 약물 노출, 그리고 일치한 샘플의 단세포 RNA 시퀀싱이 포함됩니다. 이 접근법은 HCC 오가노이드에서 단일 세포 해상도로 처리와 관련된 세포 구성 및 유전자 발현 프로그램 변화를 비교할 수 있는 실용적인 틀을 제공합니다.

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프로토콜

인간 조직을 이용한 연구는 광저우 의과대학 연구 윤리심사위원회(승인 번호)에서 검토 및 승인되었습니다. GYZL-2024-KY31). 인간 표본을 이용한 모든 절차는 기관의 인간 연구 지침에 따라 수행되었습니다. 임상 표본을 의학 연구에 사용할 수 있도록 모든 환자로부터 서면 동의를 받았습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

이 작업 흐름에는 냉동 보존된 간세포 암종 오가노이드의 회수 및 증식이 포함되며, 하위 치료 교란과 단세포 RNA 시퀀싱에 대한 소규모 적응도 포함됩니다. 목표는 후속 약물 치료 실험을 위해 충분한 품질과 일관성을 가진 오가노이드 배양을 생성하는것입니다.

1. HCC 환자 유래 오가노이드의 확립 및 확대

  1. 냉동 보존 오가노이드의 해동 및 회수
    1. 해동 전 준비
      1. 물 목욕을 37°C로 미리 데워주세요. 도금 전에 24웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 최소 1시간 이상 예비평형으로 만듭니다.
      2. 사전에 완전한 오가노이드 배양 배양지를 준비하고, 사용 전까지 기저막 추출물(BME)을 얼음에 보관하세요. 전체 오가노이드 배양 배지의 조성은 보충표 1에 제공되어 있습니다.
    2. 오가노이드의 해동
      1. 액체 질소 저장 상태에서 냉동 HCC 오가노이드가 포함된 크라이오바이얼을 제거하여 즉시 37°C 수조에 넣으세요.
      2. 작은 얼음 결정만 남으면 바이알을 살짝 흔들고 해동을 멈추세요.
    3. 냉동 보호 제거
      1. 녹은 현탁액을 한 번 부드럽게 피펫으로 돌려 내용물을 다시 현탁하세요.
      2. 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 3–5mL 완전 오가노이드 배양 배양액을 넣습니다.
      3. 300 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리기. 상청액을 조심스럽게 흡입하고 제거하면서 펠릿을 흔들지 마세요.
  2. 오르가노이드의 임베임드 및 재도금
    1. 회수 혼합물 제조
      1. 오가노이드 펠릿을 완전한 오가노이드 배양 배지에 재현탁합니다. 전체 오가노이드 배양 배지의 조성은 보충표 1에 제공되어 있습니다.
      2. 같은 양의 얼음처럼 차가운 BME와 부드럽게 섞어 플레이트 혼합물을 만듭니다.
        참고: 조기 중합을 방지하기 위해 혼합물을 얼음 위에 보관하세요.
    2. 오가노이드 돔의 도금
      1. 미리 예열된 24웰 플레이트의 각 웰에 50 μL의 오가노이드-매트릭스 혼합물을 투여합니다.
      2. 37°C에서 30분간 배양하여 매트릭스 응고를 기다립니다.
      3. 각 웰 벽을 따라 각 웰에 500 μL 완전 오가노이드 배양 배지를 20 μM Y-27632를 보조합니다.
        참고: Y-27632는 해동 또는 통과 후 처음 2-3일 이내로 사용하도록 제한하세요. 각 돔이 우물 바닥에 단단히 붙어 있으면서도 바깥쪽으로 퍼지지 않도록 하세요.
  3. 오르가노이드 배양과 확장
    1. 회복 배양 조건
      1. 오가노이드를 37°C, 5%CO2로 유지하세요.
      2. 해동 후 처음 2–3일 동안 20 μM Y-27632가 함유된 배지를 사용하세요.
    2. 중간 대체
      1. 배양지를 3–4일마다 부드러운 흡인으로 교체하세요.
      2. 각 우물 벽을 따라 신선한 매체를 추가하여 매트릭스 돔을 손상시키지 않도록 하세요.
      3. 동일한 실험 내 모든 우물에서 동일한 매질 교체 일정을 유지하세요.
    3. 성장 모니터링
      1. 일관된 영상 설정을 갖춘 밝야 현미경을 사용하여 오가노이드 회복과 확장을 모니터링합니다.
      2. 복구 및 확장 과정에서 지정된 시점에 대표적인 이미지를 기록하세요.
      3. 대부분의 구조물이 온전하게 남아 있고, 오가노이드가 둥글고 타원형에 매끄러운 경계를 가지며, 시간이 지남에 따라 점진적으로 확대되고, 최소한의 잔해나 붕괴된 구조물이 존재할 때 성공적인 회복을 확인한다.
      4. 온전한 오가노이드가 10개 미만인 우물은 하위 정량 분석에서 제외합니다.
    4. 통과 및 확장 기준
      1. 안정 팽창 후 통과하는 오가노이드가 관찰됩니다.
      2. 형태가 보존된 상태에서 오르가노이드 크기 또는 전체 면적의 재현 가능한 증가로 안정적인 확장을 확인한다.
      3. 실험 전반에 걸쳐 일관된 영상 간격, 배율, 포함 기준을 사용하세요.
      4. 오가노이드 면적이나 개체수를 기반으로 대표성 성장 곡선을 생성하여 안정성을 확인하세요.
    5. 하위 실험 기준
      1. 안정적인 3차원 성장을 보이고, 오염이나 광범위한 붕괴가 없으며, 병렬한 실험 조건에서 충분한 수율을 제공하는 오가노이드 선을 사용하세요.
      2. 해동 후 최소 7–10일 또는 회복 완료와 한 번의 확장 주기까지 배양을 유지하세요.
      3. 복제 우물 전반에 걸쳐 일관된 형태를 보이는 오르가노이드 라인만 전진.

2. 치료적 교란을 위한 오가노이드 준비

  1. 사전 치료 품질 평가
    1. 형태학 기반 평가
      1. 오르가노이드가 형태가 둥글거나 타원형임을 확인하세요.
      2. 오가노이드가 매끄럽고 명확한 경계를 보인다는 것을 확인하세요.
      3. 돔 내 세포 잔해가 최소화된 것을 확인하세요.
      4. 광범위한 단편화, 어두운 루멘, 광범위한 붕괴 또는 명백한 오염이 있는 배양은 제외합니다.
    2. 팽창 상태 평가
      1. 회복을 완료하고 안정적인 증식에 들어간 오르가노이드 배양만 사용하세요.
      2. 시간이 지남에 따라 점진적으로 커지는 것을 확인하세요.
      3. 복제 우물 간 형태가 일관되어 있음을 확인하세요.
  2. 약물 치료를 위한 오르가노이드 재도금
    1. 기질에서 오가노이드 회수
      1. 유기체 돔을 얼음 위에 1mL의 얼음 냉각 세포 회수 용액을 15–20분간 녹인다.
      2. 배양 기간 동안 5분마다 부드럽게 피펫을 사용하세요.
      3. 원심분리기로 회수된 현탁은 300 × g에서 4 °C에서 5분간 유지했습니다.
      4. 완전한 오가노이드 배양 배양지에 펠릿을 재현탁합니다.
    2. 재도금 전 표준화
      1. 약물 치료 전에 우물 전반에 걸쳐 시작 오가노이드 부하를 표준화하세요.
      2. 가능할 경우 부분 해리 후 생존 가능한 세포 수를 결정합니다.
      3. 샘플을 웰당 입력 셀 수와 동일한 수로 정규화하세요.
      4. 24웰 형식으로 유정당 약 1,000–5,000개의 생존 가능한 셀을 도금합니다.
      5. 직접 셀 수가 수행되지 않는 경우, 우물당 형태학적으로 온전한 오가노이드의 수와 그룹 간 크기가 비슷하도록 하여 정규화합니다.
      6. 각 단계별로 초기 오가노이드 수와 기초 형태를 처리 전 단계별로 기록하세요.
      7. 동일한 실험 내 모든 웰에서 동일한 포함 기준과 플래팅 전략을 사용하세요.
    3. 약물 치료를 위한 재도금
      1. 회수된 오가노이드와 얼음처럼 차가운 기저막 기질을 최종 농도는 30%–50%로 혼합합니다.
      2. 24웰 플레이트의 각 웰에 50 μL 돔을 분배합니다.
      3. 중합을 위해 37°C에서 30분간 배양하세요.
      4. 우물 벽을 따라 각 우물당 500μL의 완전 오가노이드 배양물을 추가합니다.
        참고: 각 돔이 우물 바닥에 밀착되어 밖으로 퍼지지 않도록 주의하세요. 동일한 실험 내 모든 우물에서 동일한 돔 부피와 매트릭스 농도를 사용하세요.
  3. 약물 치료 전 회복
    1. 재도금 후 회복
      1. 표준 배양 조건에서 오가노이드가 하룻밤 동안 회복되도록 허용하세요.
      2. 재도금된 돔 내에서 형태가 온전히 복원된 후에만 처리를 시작하세요.
    2. 약물 치료 입학 기준
      1. 재판 후 오가노이드가 온전하게 유지되고, 광범위한 붕괴나 과도한 이물질이 없으며, 오가노이드 부하가 각 웰에서 유사할 때만 약물 치료를 시작하세요.
      2. 치료 전 모든 실험군에 대해 기초 밝방야 이미지를 기록하세요.
      3. 모든 대조군과 처리된 웰에서 동일한 시작 오가노이드 부하, 재도판 후 회복 시간, 처리 시작 시간을 동일하게 유지해야 합니다.
  4. 안전 고려사항
    1. 인간 유래 오가노이드와 관련된 모든 시술은 적절한 개인 보호 장비와 생물안전 관행을 사용하여 수행하십시오.
    2. 효소 해리 시약은 피부나 눈 노출을 피하기 위해 조심스럽게 다루세요.
    3. 기관 생물안전 규정에 따라 액체 및 고체 생물 폐기물을 처리합니다.

3. HCC 오가노이드의 약물 치료

  1. 약물 준비 및 치료
    1. 약물 준비
      1. 제조사 지침에 따라 DMSO에 렌바티닙 스톡 용액을 준비하세요.
      2. 사용 직전에 미리 가열된 배양지에 스톡 용액을 희석하여 미리 정의한 작업 농도로 바라세요.
      3. 모든 우물에서 동일한 최종 DMSO 농도(≤ 0.1%)를 유지하세요.
      4. 각 웰에 동일한 최종 처리 부피가 되도록 충분한 부피를 준비하세요.
    2. 약물 치료
      1. 각 웰 벽을 따라 렌바티닙 함유 배지(20 μM)를 추가하여 매트릭스 돔을 방해하지 않도록 합니다.
      2. 최종 DMSO 농도가 동일한 차량 대조군을 포함하세요.
      3. 표준 배양 조건에서 미리 정해진 처리 기간 동안 오가노이드를 배양합니다.
      4. 72시간을 초과하는 치료 기간은 48–72시간마다 약물 함유 배지를 교체하세요.
      5. 실험 내 모든 우물에서 동일한 매질 교체 일정을 사용하세요.
      6. 치료 전에 명야 기초 영상을 기록하세요.
      7. 동일한 현미경 설정, 배율, 시야 위치를 사용하여 치료 중 일정한 간격으로 이미지를 획득합니다.
  2. 치료 반응 평가
    1. 형태학 기반 평가
      1. 다음 이미지 기반 측정값을 사용하여 치료 반응을 평가합니다: 오가노이드 면적 성장 곡선, 평균 오르가노이드 직경, 생존 오가노이드 수.
      2. 모든 이미지에 대해 동일한 노출 설정, 배율, 분석 임계값을 사용하세요.
      3. 각 시점에서 우물 또는 필드당 총 오가노이드 면적을 계산하고 기준선으로 정규화하여 오가노이드 면적 성장 곡선을 측정합니다.
      4. 개별 온전한 오가노이드의 직경을 결정하고 우물당 평균 값을 계산하여 평균 오가노이드 직경을 측정합니다.
      5. 형태학적으로 식별 가능한 온전한 오가노이드를 세고 잔해와 붕괴된 조각을 제외하여 생존한 오가노이드 수를 결정합니다.
    2. 선택적 생존 가능성 측정
      1. 추가적인 대량 생존 가능성 평가가 필요한 경우 치료 종단지에서 3차원 발광 생존 가능성 검사를 수행하십시오.
      2. 분석은 제조사의 지침을 따르세요.
  3. 데이터 분석
    1. 오가노이드 면적 성장 곡선을 시간에 따라 그래프로 그립니다.
    2. 차량 처리군과 렌바티닙 처리군 간 평균 오가노이드 직경을 비교합니다.
    3. 처리 그룹 간 생존 오가노이드 수를 비교하세요.
    4. 재현성을 보장하기 위해 모든 그룹에 동일한 이미지 획득 일정, 오가노이드 포함 기준, 분석 매개변수를 적용하세요.

4. 단세포 RNA 시퀀싱을 위한 오가노이드 준비

  1. 오가노이드의 선택 및 회수
    1. 해리 전 평가
      1. 광범위한 붕괴 없이 완전한 3차원 형태를 보이고, 하류 단일 세포 포획에 충분한 물질을 포함하며, 명백한 오염이 없는 일부 오가노이드 우물.
      2. 대조군과 처리된 샘플 간에 일치하는 실험 시점에서 오가노이드를 수집합니다.
      3. 샘플 전반에 걸쳐 도금 밀도, 처리 일정, 중간 교체 조건을 동일하게 유지하세요.
      4. 동일한 현미경 설정, 배율, 필드 선택 기준을 사용하여 해리 이전에 각 선정된 각 선별의 밝은 필드 이미지를 기록합니다.
    2. 행렬 제거
      1. 각 웰에서 완전히 흡입 배양지를 사용하세요.
      2. 각 웰을 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척해 잔여 매질과 이물질을 제거하세요.
      3. 각 웰에 얼음으로 차가운 세포 회수 용액 1mL를 추가하세요.
      4. 얼음 위에 20분에서 30분 정도 부화시킵니다.
      5. 배양 기간 동안 5–7분마다 부드럽게 피펫을 사용해 매트릭스 용해를 촉진합니다.
      6. 용존된 물질을 넓은 구경이나 절단된 피펫 팁을 사용해 전단 응력을 최소화하여 미리 냉각된 튜브로 옮깁니다.
      7. 기질이 거의 용해되고 최소 정도의 가시 겔 잔기가 남은 후에만 효소 해리를 진행하세요.
  2. 효소 해리 및 단세포 현탁 준비
    1. 효소 해리
      1. 회수한 오가노이드 현탁액을 300 × g에서 4°C에서 5분간 원심분리합니다.
      2. 펠릿을 건드리지 않고 상원액을 조심스럽게 제거하세요.
      3. 펠릿을 1mL의 재조합 세포 해리 효소에 재현탁합니다.
      4. 37°C에서 5–10분간 배양합니다.
      5. 피펫은 넓은 구경의 P1000 팁을 사용해 2-3분마다 8–10번 부드럽게 피펫을 사용해 해리를 촉진합니다.
      6. 대부분의 오가노이드 조각이 단일 세포로 분산되고 작은 잔류 군집만 남으면 소화를 멈춥니다.
      7. 세포 생존 능력 저하, 스트레스 관련 전사 인공물, 주변 RNA 오염 증가를 방지하기 위해 장기간 소화를 피하세요.
    2. 담냉 및 여과
      1. 소화 억제를 위해 2% 태아 소 혈청이 들어간 얼음 차가운 PBS 4mL를 추가하세요.
      2. 40 μm 셀 체를 통해 현탁물을 걸러냅니다.
      3. 잔여 효소, 응집체, 이물질을 제거하기 위해 PBS로 한 번 세척하세요.
      4. 적혈구 오염이 있을 경우 제조사의 지침에 따라 적혈구 용해를 수행하세요.
    3. 셀 준비 및 품질 관리
      1. 트리판 블루 배제를 사용해 세포 수를 세세요.
      2. 라이브러리 준비 전에 세포 생존성을 판단하세요.
      3. 생존 가능성이 85%≥ 샘플만 사용하세요.
      4. 최종 세포 농도를 700–1,200 세포/μL로 조정합니다.
      5. 과도한 잔해, 풍부한 죽은 세포, 큰 가시성 덩어리, 또는 불완전한 해리가 있는 샘플은 제외합니다.
      6. 골재가 있으면 적재 전에 다시 여과하세요.
      7. 해리 효소, 소화 시간, 피펫팅 빈도, 여과 방법, 세포 농도, 로딩 전략 등 동일한 조건에서 공정 제어 및 처리된 샘플을 수행했습니다.
  3. 단일 세포 라이브러리 준비 및 시퀀싱
    1. 단일 셀 포획 및 라이브러리 준비
      1. 제조사의 지침에 따라 준비된 단일 셀 현탁액을 액자 기반 단일 셀 포집 플랫폼에 적재합니다.
      2. 해당 단세포 3′ 워크플로우를 사용하여 역전사, cDNA 증폭, 라이브러리 구축을 수행합니다.
    2. 시퀀싱 매개변수
      1. 세포당 최소 50,000 리드 깊이의 서열 라이브러리.
      2. 로드셀을 사용해 라이브러리당 약 6,000–10,000개의 셀을 회수할 수 있습니다.
      3. 시퀀싱 화학, 측정 구조, 기기 설정을 기록하세요.
  4. 하위 분석을 위한 품질 기준
    1. 최종 준비물이 세포 생존율이 높고, 잔해가 최소화되며, 집합 부담이 적도록 하세요.
    2. 세포 이질성과 세포 상태 전이의 단세포 전사체 하위 분석에 적합한지 확인한다.

5. 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터의 기본 처리 및 품질 관리

  1. 1차 처리
    1. 카운트 행렬의 생성
      1. 선택한 플랫폼에 권장되는 파이프라인을 사용하여 원시 시퀀싱 데이터를 처리합니다.
      2. 유전자 단위 세포별 행렬을 생성하세요.
      3. 기록 소프트웨어 버전, 참고 유전체 빌드, 전사 주석 릴리스.
    2. 초기 도서관 수준의 품질 평가
      1. 각 라이브러리별로 총 리드 수, 회수 추정 세포 수, 세포당 중앙값 유전자, 세포당 중앙값 UMI, 그리고 염기서열 포화도(해당되는 경우) 등을 요약하세요.
      2. 모든 샘플에서 동일한 참조 유전체 및 주석 설정을 사용하세요.
  2. 셀 수준 품질 관리
    1. 저품질 셀의 필터링
      1. 각 세포별로 검출된 유전자 수, 총 UMI 수, 미토콘드리아 전사체 비율, 그리고 이중항 또는 다중유 증거를 평가합니다.
      2. 유전자 수가 극히 적거나, UMI 수가 극히 낮거나, 미토콘드리아 전사체 분획이 비정상적으로 높은 세포는 제외합니다.
      3. 데이터셋 분포를 기반으로 필터링 임계값을 정의하세요.
      4. 매칭된 치료 그룹 간에 동일한 임계값을 적용하세요.
    2. 추정 더블릿 제거
      1. 적절한 계산 방법을 사용하여 가능한 이중형을 식별합니다.
      2. 플랫폼 호환 탐지 워크플로우를 사용하여 더블렛을 제거하세요.
      3. 모든 샘플에 동일한 더블릿 검출 전략을 적용하세요.
  3. 정규화, 군집화 및 주석
    1. 데이터 정규화
      1. 필터링된 카운트 매트릭스를 표준 단일 세포 RNA-seq 워크플로우로 정규화합니다.
      2. 모든 샘플에 동일한 정규화 절차를 적용하세요.
    2. 차원 축소와 클러스터링
      1. 차원 축소를 수행하세요.
      2. 주요 전사 집단을 식별하기 위해 비감독 군집 분석을 수행합니다.
      3. UMAP과 같은 저차원 임베딩 기법을 사용하여 셀 상태를 시각화할 수 있습니다.
    3. 마커 유전자 식별
      1. 클러스터 간 차등 발현 분석을 통해 마커 유전자를 식별합니다.
      2. 주요 상피 세포 상태에 대한 생물학적 해석을 마커 발현에 따라 부여합니다.
  4. 치료 조건의 비교 분석
    1. 메타데이터 통합
      1. 각 세포에 치료 상태, 환자 유래 오가노이드 라인, 처리 배치를 주석으로 기재합니다.
      2. 모든 샘플에서 일관된 메타데이터 구조를 유지하세요.
    2. 치료 관련 변화 분석
      1. 대조군과 처리된 샘플을 비교하세요.
      2. 치료 관련 전사 재형성을 규명합니다.
      3. 세포 상태 조성의 변화를 식별합니다.
      4. 치료 적응과 관련된 후보 세포 집단을 식별합니다.
      5. 형태학 기반 및 생존 가능성 판독과 함께 결과를 해석합니다.
  5. 데이터 분석 결과
    1. 품질 관리된 유전자 단위 유전자 수 매트릭스를 생성하세요.
    2. 전사적으로 구별되는 집단의 저차원 시각화를 생성합니다.
    3. 주요 군집의 마커 유전자를 식별하세요.
    4. 참조 유전체 내 모든 샘플에 대한 일관성을 유지하고, 전처리 워크플로우, 필터링 기준, 클러스터링 전략, 주석 기준을 유지합니다.
    5. 표준 워크플로우에서 벗어난 샘플 특화 현상을 문서화하세요.

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결과

그림 1 은 간세포암(HCC) 오가노이드의 생성 및 특성 분석을 개괄합니다. 그림 1A에서는 환자 유래 종양 조직을 사용하여 조직학적 분석 및 치료 연구를 위한 오가노이드 배양을 구축하였습니다. 그림 1B 는 회복 후 1일차와 6일차에 오가노이드의 밝시야 이미지를 보여주며, 표준 3차원 배양 조건에서 생존과 확장을 보여줍니다. 첫째 날에는 오가노이드가 작고 조밀한 구조로 나타나지만, 6일째에는 크기가 커지고 형태가 명확해집니다. 그림 1C 는 확장되는 과정에서 오가노이드의 밝은 영역 및 헤마톡실린 및 이오신 염색과 EPCAM, AFP, SOX9, HNF4A, ALB에 대한 면역 염색을 보여주어 간세포 계통 특성을 확인한다. 이러한 관찰은 지속적인 성장, 형태...

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토론

재현성, 효율성, 고품질 단일 세포 전사체 분석을 보장하기 위해 이 워크플로우의 여러 기술적 단계가 신중한 관리가 필요합니다. 환자 유래 HCC 오가노이드의 부활 및 확장 과정에서의 일관성은 필수적이며, 씨앗 밀도, 기저막 기질 조성, 배양 시기의 변동이 오가노이드 형태, 성장 및 후속 처리 반응에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다13,14. 또한, 해리 과정에서의 높은 세포 생존률은 scRNA-seq에 매우 중요한데, 거친 효소 소화나 과도한 기계적 교란은 스트레스 관련 전사 인공물을 유발하고 데이터 품질을 저하시킬 수 있기 때문입니다. 저온 또는 냉활성 효소 조건을 포함한 최적화된 해리 전략은 민감한 오가노이드 샘플에서 세포 구성 보존에 도움이 될 수 있습니다15.

이 프...

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공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학기금(82303022; 82122048; 82372714; 82203380), 광둥기초응용연구재단(2023A1515011416), 광저우기초응용기초연구재단(2024A04J6575)의 지원을 받았습니다. 일부 회로 요소는 Home for Researchers(https://www.home-for-researchers.com)를 사용해 제작되었으며, 저자들이 이를 수정했습니다. 도면 삽화는 Figdraw(https://www.figdraw.com)를 사용해 제작되었으며, 저자들이 각색했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
[Leu15]-가스트린 I 인간머크G9145
1.5 mL 마이크로튜브머크AXYMCT150LC
1X 적혈구 용해 버퍼써모피셔 사이언티브00-4333-57
2.0ml 내부 나사산 냉동 바이알둥지607001
A8301 (TGFb 억제제)토크리스 생명과학2939
AFP 다클론 항체단백질 기술14550-1-AP
항알부민 항체 [ALB/2144]ABCAMAB236492
항-HNF-4-알파 항체 [EPR16885] - ChIP 등급ABCAMAB181604
항전알부민 항체 [EPR3219]ABCAMAB92469
항-소크스9 항체 [EPR14335-78]ABCAMAB185966
비타민 A 제외 B27 보충제(503)써모피셔 사이언티브12587010
세포 회복 용액, 100 mL코닝354253재도금 또는 후속 처리 전에 기저막 매트릭스를 용해하고 오가노이드를 회수하는 데 사용되는 시약입니다
세포티터-글로&레그; 그리고 nbsp; 3D 세포 생존 가능성 분석프로메가G9681
CHIR99021머크SML1046
크롬 넥스트 GEM 단일셀 3' GEM, 라이브러리 & 젤 비드 키트 v3.110배 유전체학CG000227
코닝 셀 스트레이너, 40 & 뮤; m, 블루, S, IND, 1/50코닝431750
Costar 24-웰 투명 평평 바닥 초저 부착 다중 웰 플레이트, 개별 포장, 멸균코닝3473
컬트렉스 감소 성장 인자 BME, 타입 2 경로 정리(BME)머크3533-005-023차원 오가노이드 배양과 돔 형성을 지원하는 세포외 기질
DMSO머크C6164약물 재고 용액 및 차량 제어에 사용되는 용매
둘벡코의 개조 이글 미디엄/햄의 F-12써모피셔 사이언티브12634028고급 DMEM/F-12
E7080 (렌바티닙)셀렉S1164오가노이드 치료 및 치료적 교란에 사용되는 티로신 키나제 억제제
태아 소 혈청 가치 FBS깁코A5256701
포스콜린토크리스 생명과학1099
글루타맥스 보충제써모피셔 사이언티브35050061
헤마톡실린 및 이오신 염색 키트비요타임C0105S
HEPES, 1 M써모피셔 사이언티브15630080
라이카 DM6 B 형광 모터화 현미경라이카해당 없음
N2 보충 자료 (1003)써모피셔 사이언티브17502048
N-아세틸시스테인머크A0737-5MG
니코티나마이드머크N0636
Nunc 15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리관써모피셔 사이언티브339651
페니실린/스트렙토마이신 (10,000 U/mL)써모피셔 사이언티브15140122
인산 완충 식염수GENOM BIOGNM20012오가노이드 세척 및 후속 처리를 위한 샘플 준비에 사용되는 완충제입니다
재조합 인간 EGF페프로텍AF-100-15
재조합 인간 FGF10페프로텍100-26
재조합 인간 HGF페프로텍100-39
재조합 인간 노긴페프로텍120-10C
로 키나제 억제제 Y-27632 이하이드로클로라이드머크Y0503해동 또는 통과 후 오가노이드 생존을 촉진하는 데 사용되는 ROCK 억제제
R-스포딘1-조건 매질(Broutier 외)해당 없음세포주 분비
트리판 블루 스테인, 0.4% 멤브레인 필터링, 0.85% 생리식염수로 준비깁코15250061
TrypLE Express 효소 (1x), 페놀 레드 없음써모피셔 사이언티브12604013트립신 대체물
Wnt-3a 조건 매체(Broutier 외)해당 없음세포주 분비

참고문헌

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  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

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