Method Article

약물 치료 후 간세포암 오르가노이드의 생성 및 단세포 전사체 분석

DOI:

10.3791/70511

⸱

May 26th, 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 간세포암 오가노이드를 생성하고, 약물 치료를 적용하며, 치료 전후로 단세포 RNA 시퀀싱을 수행하여 치료 관련 전사 변화를 특성화하는 간소화된 방법을 제시합니다.

Abstract

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간세포암은 전 세계적으로 암 관련 사망률의 주요 원인이며, 현저한 종양 내 이질성이 특징으로 치료 반응의 변동, 종양 재발, 질병 진행에 기여합니다. 따라서 약물 치료 전후로 종양 세포가 전사 수준에서 어떻게 변화하는지에 대한 더 깊은 이해는 치료 전략 개선에 필수적입니다. 그러나 오가노이드 기반 약물 치료와 하위 단세포 전사체 프로파일링을 연결하는 실질적인 실험적 워크플로우는 여전히 제한적입니다. 본 연구에서는 간세포암 오르가노이드 생성, 정의된 약물 치료 적용, 치료 전후 샘플에 대한 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 표준화된 워크플로우를 개발하였습니다. 프로토콜에는 오르가노이드 재생 및 증식, 치료 전 품질 평가, 약물 노출, 단세포 해리를 위한 오르가노이드 준비, 라이브러리 구축, 그리고 단세포 전사체 데이터의 기본 비교 분석이 포함됩니다. 재현성과 샘플 품질 향상을 위한 중요한 기술적 주의 조치가 제공됩니다. 이 워크플로우는 간세포암 오르가노이드에서 약물 치료와 관련된 세포 구성과 전사 변화를 병행하여 특성화할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 견고하고 확장 가능하며 다양한 오가노이드 시스템에 적응할 수 있어 단일 세포 해상도에서 치료 관련 유전자 발현 변화를 연구할 수 있는 실용적인 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

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간세포암(HCC)은 성인에서 가장 흔한 원발성 간암이며, 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인입니다 1,2,3. 임상 결과가 좋지 않은 이유는 종양 내 이질성이 크기 때문이며, 이는 치료 내성과 재발로 이어집니다. 최근 연구에 따르면, FOXM1/CEBPB 축과 같은 주요 전사 프로그램에 의해 발생하는 발달 다양성과 세포 상태 가소성이 HCC5의 치료 내성에 기여한다고 밝혔습니다. 이러한 발견은 종양 세포 집단이 지속적인 치료 압력 하에서 어떻게 적응하고 상태 간 전이가 되는지를 이해할 필요성을 강조합니다. 그러나 대부분의 전임상 모델은 이러한 치료 관련 상태 전이의 역동적이고 연속적인 특성을 충분히 포착하지 못해 종양 적응과 치료 실패에 대한 기전적 연구를 제한합니다.

환자 유래 오가노이드(PDO)는 원래 종양의 중요한 유전체 변형과 세포 이질성을 보존하기 때문에 이 목적에 유용한 플랫폼을 제공합니다

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Protocol

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인간 조직을 이용한 연구는 광저우 의과대학 연구 윤리심사위원회(승인 번호)에서 검토 및 승인되었습니다. GYZL-2024-KY31). 인간 표본을 이용한 모든 절차는 기관의 인간 연구 지침에 따라 수행되었습니다. 임상 표본을 의학 연구에 사용할 수 있도록 모든 환자로부터 서면 동의를 받았습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

이 작업 흐름에는 냉동 보존된 간세포 암종 오가노이드의 회수 및 증식이 포함되며, 하위 치료 교란과 단세포 RNA 시퀀싱에 대한 소규모 적응도 포함됩니다. 목표는 후속 약물 치료 실험을 위해 충분한 품질과 일관성을 가진 오가노이드 배양을 생성하는것입니다.

1. HCC 환자 유래 오가노이드의 확립 및 확대

  1. 냉동 보존 오가노이드의 해동 및 회수
    1. 해동 전 준비
      1. 물 목욕을 37°C로 미리 데워주세요. 도금 전에 24웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 최소 1시간 이상 예비평형으로 만듭니다.
      2. 사전에 완전한 오가노이드 ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1 은 간세포암(HCC) 오가노이드의 생성 및 특성 분석을 개괄합니다. 그림 1A에서는 환자 유래 종양 조직을 사용하여 조직학적 분석 및 치료 연구를 위한 오가노이드 배양을 구축하였습니다. 그림 1B 는 회복 후 1일차와 6일차에 오가노이드의 밝시야 이미지를 보여주며, 표준 3차원 배양 조건에서 생존과 확장을 보여줍니다. 첫째 날에는 오가노이드가 작고 조밀한 구조로 나타나지만, 6일째에는 크기가 커지고 형태가 명확해집니다. 그림 1C 는 확장되는 과정에서 오가노이드의 밝은 영역 및 헤마톡실린 및 이오신 염색과 EPCAM, AFP, SOX9, HNF4A, ALB에 대한 면역 염색을 보여주어 간세포 계통 특성을 확인한다. 이러한 관찰은 지속적인 성장, 형태.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

재현성, 효율성, 고품질 단일 세포 전사체 분석을 보장하기 위해 이 워크플로우의 여러 기술적 단계가 신중한 관리가 필요합니다. 환자 유래 HCC 오가노이드의 부활 및 확장 과정에서의 일관성은 필수적이며, 씨앗 밀도, 기저막 기질 조성, 배양 시기의 변동이 오가노이드 형태, 성장 및 후속 처리 반응에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다13,14. 또한, 해리 과정에서의 높은 세포 생존률은 scRNA-seq에 매우 중요한데, 거친 효소 소화나 과도한 기계적 교란은 스트레스 관련 전사 인공물을 유발하고 데이터 품질을 저하시킬 수 있기 때문입니다. 저온 또는 냉활성 효소 조건을 포함한 최적화된 해리 전략은 민감한 오가노이드 샘플에서 세포 구성 보존에 도움이 될 수 있습니다15.

이 프.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가자연과학기금(82303022; 82122048; 82372714; 82203380), 광둥기초응용연구재단(2023A1515011416), 광저우기초응용기초연구재단(2024A04J6575)의 지원을 받았습니다. 일부 회로 요소는 Home for Researchers(https://www.home-for-researchers.com)를 사용해 제작되었으며, 저자들이 이를 수정했습니다. 도면 삽화는 Figdraw(https://www.figdraw.com)를 사용해 제작되었으며, 저자들이 각색했습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-가스트린 I 인간머크G9145
1.5 mL 마이크로튜브머크AXYMCT150LC
1X 적혈구 용해 버퍼써모피셔 사이언티브00-4333-57
2.0ml 내부 나사산 냉동 바이알둥지607001
A8301 (TGFb 억제제)토크리스 생명과학2939
AFP 다클론 항체단백질 기술14550-1-AP
항알부민 항체 [ALB/2144]ABCAMAB236492
항-HNF-4-알파 항체 [EPR16885] - ChIP 등급ABCAMAB181604
항전알부민 항체 [EPR3219]ABCAMAB92469
항-소크스9 항체 [EPR14335-78]ABCAMAB185966
비타민 A 제외 B27 보충제(503)써모피셔 사이언티브12587010
세포 회복 용액, 100 mL코닝354253재도금 또는 후속 처리 전에 기저막 매트릭스를 용해하고 오가노이드를 회수하는 데 사용되는 시약입니다
세포티터-글로&레그; 그리고 nbsp; 3D 세포 생존 가능성 분석프로메가G9681
CHIR99021머크SML1046
크롬 넥스트 GEM 단일셀 3' GEM, 라이브러리 & 젤 비드 키트 v3.110배 유전체학CG000227
코닝 셀 스트레이너, 40 & 뮤; m, 블루, S, IND, 1/50코닝431750
Costar 24-웰 투명 평평 바닥 초저 부착 다중 웰 플레이트, 개별 포장, 멸균코닝3473
컬트렉스 감소 성장 인자 BME, 타입 2 경로 정리(BME)머크3533-005-023차원 오가노이드 배양과 돔 형성을 지원하는 세포외 기질
DMSO머크C6164약물 재고 용액 및 차량 제어에 사용되는 용매
둘벡코의 개조 이글 미디엄/햄의 F-12써모피셔 사이언티브12634028고급 DMEM/F-12
E7080 (렌바티닙)셀렉S1164오가노이드 치료 및 치료적 교란에 사용되는 티로신 키나제 억제제
태아 소 혈청 가치 FBS깁코A5256701
포스콜린토크리스 생명과학1099
글루타맥스 보충제써모피셔 사이언티브35050061
헤마톡실린 및 이오신 염색 키트비요타임C0105S
HEPES, 1 M써모피셔 사이언티브15630080
라이카 DM6 B 형광 모터화 현미경라이카해당 없음
N2 보충 자료 (1003)써모피셔 사이언티브17502048
N-아세틸시스테인머크A0737-5MG
니코티나마이드머크N0636
Nunc 15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리관써모피셔 사이언티브339651
페니실린/스트렙토마이신 (10,000 U/mL)써모피셔 사이언티브15140122
인산 완충 식염수GENOM BIOGNM20012오가노이드 세척 및 후속 처리를 위한 샘플 준비에 사용되는 완충제입니다
재조합 인간 EGF페프로텍AF-100-15
재조합 인간 FGF10페프로텍100-26
재조합 인간 HGF페프로텍100-39
재조합 인간 노긴페프로텍120-10C
로 키나제 억제제 Y-27632 이하이드로클로라이드머크Y0503해동 또는 통과 후 오가노이드 생존을 촉진하는 데 사용되는 ROCK 억제제
R-스포딘1-조건 매질(Broutier 외)해당 없음세포주 분비
트리판 블루 스테인, 0.4% 멤브레인 필터링, 0.85% 생리식염수로 준비깁코15250061
TrypLE Express 효소 (1x), 페놀 레드 없음써모피셔 사이언티브12604013트립신 대체물
Wnt-3a 조건 매체(Broutier 외)해당 없음세포주 분비

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