방법 논문

24웰 랙을 이용한 중간 처리량 컬럼 DNA 추출

DOI:

10.3791/70553

⸱

2026년 7월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Systems Biology and Medicine of Rospotrebnadzor, 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, 3Moscow Institute of Physics and Technology, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 추출을 가속화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 표준 스윙 버킷 플레이트 로터와 호환되는 맞춤형 3D 프린팅 랙을 활용함으로써, 연구자들은 캡이 있는 최대 48개의 스핀 컬럼 또는 캡 없이 최대 116개의 스핀 컬럼을 동시에 처리할 수 있어 수동 마이크로 원심분리기 방식에 비해 취급 시간을 크게 줄일 수 있습니다.

초록

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실리카막 스핀 컬럼 추출은 고품질 DNA 정제의 표준이지만, 노동 집약적이고 소규모 배치 이상의 수작업 확장이 어렵습니다. 기존의 자동화된 액체 취급 로봇은 중소규모 실험실에는 여전히 너무 비싼 경우가 많습니다. 이 논문은 표준 원심분리판 로터에 맞는 맞춤형 3D 프린팅 랙을 활용한 간소화되고 반자동화된 접근법을 제시합니다.

제안된 시스템은 최대 116개의 표준 상업용 스핀 컬럼을 병렬 처리할 수 있게 합니다. 랙 설계는 '중첩된' 구성을 수용하여, 단일 원심분리 단계에서 용해액 정액(여과 컬럼을 통해)과 DNA 결합(실리카 컬럼을 통해)을 동시에 수행할 수 있습니다. 또한, 설계에는 공유 폐기물 저장소가 포함되어 있어 세척 단계에서 개별 튜브에서 배출물을 버릴 필요가 없습니다.

이 방법은 표준 수동 프로토콜과 비교할 만한 DNA 수율과 순도를 달성하지만, 24개 이상의 샘플 배치의 경우 총 처리 시간을 약 50–70% 줄여줍니다(120–180분 대신 60–90분). 분해액 여과, 세척, 폐기물 폐기 등 단계에 소요되는 총 시간은 처리된 샘플 수와 관계없이 5분에서 10분 정도 단축됩니다. 이 오픈 소스 하드웨어 접근법은 수동 미니프렙과 고가의 자동화 사이의 간극을 메워줍니다.

서론

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규소 매트릭스를 이용한 핵산 분리는 1979년 Vogelstein과 Gillespie에 의해 처음 밝혀졌으며, 이들은 고농도의 혼동성 염, 특히 아이오다이드 나트륨1 존재 하에서 DNA 조각을 유리 분말에 흡착하는 기초 원리를 확립했습니다. 이 돌파구는 당시 지배적이었던 독성 페놀-클로로포름 추출법과 번거로운 세슘 클로라이드 구배 초원심분리법에 대한 더 안전하고 효율적인 대안을 제시했다. 이후 Boom과 공동 저자들은 주요 카오트로픽 제제로 구아니디늄 티오시아네이트(GuSCN)를 도입하여 이 방법론을 크게 최적화했습니다. 이 혁신은 매우 중요했는데, GuSCN은 용해 세포에 강력한 단백질 변성제이자 RNase 및 DNase의 강력한 억제제로 작용하여 초기 추출 단계에서 핵산의 무결성을 유지합니다.

이 고체 상 추출 기술, 흔히 '붐 방법'으로 알려진 기술은 시작 이래로 광범위한 개선을 거쳤습니다. 이 기술은 박테리아 플라스미드3 , 유전체 DNA4 부터 진핵생물 미토콘드리아5 , 고분자량 유전체 DNA에 이르기까지 점점 더 복잡한 생물학적 행렬에서 핵산을 분리하는 데 적응되어 왔습니다. 더 나아가, 이 기술은 임상 및 법의학적 응용 분야로 확장되었으며, 혈장에서 세포 자유 순환 DNA 6분리, 폴리페놀 7이 풍부한 불안정한 식물 DNA 및 RNA추출, 바이러스 핵산8 정제 등이 포함됩니다. 스핀 컬럼을 사용하는 상업용 키트도 많이 구할 수 있습니다.

이 과정의 물리화학적 메커니즘은 카오트로픽 이온에 의한 물 구조의 파괴에 의존합니다. 높은 이온 강도와 낮은 pH가 존재할 때, 핵산 인산염 골격과 규소 표면을 둘러싼 수화 껍질이 제거됩니다(탈수). 이로 인해 실리카 표면의 음전하를 띤 실라놀기와 핵산의 인산기 사이에 양이온 다리(일반적으로 Na+ 또는 카오트로픽 양이온에 의해 매개됨)가 형성됩니다. 핵산형(DNA vs. RNA)과 조각 길이에 대한 선택성은 완충 화학의 정밀한 조절을 통해 달성됩니다. 예를 들어, 특정 염 농도와 pH 수준은 긴 게놈 가닥의 결합을 짧은 올리고뉴클레오타이드보다 촉진하거나 RNA와 DNA를 구분하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 이 기술의 현대적 버전은 특정 핵산 종의 차등 흡착 등온성을 향상시키기 위해 변형된 실리카 표면을 자주 사용합니다.

규소 기반 핵산 정제의 표준 작업 흐름은 네 가지 뚜렷한 단계를 거칩니다: (1) 생물학적 출발물질을 균질화하고 세포 구조를 분해하는 과정(종종 알칼리성 조건이나 세제를 사용함)(SDS/Triton); (2) 정화: 세포 찌꺼기, 침전된 단백질, 다당류를 제거하여 컬럼 막힘을 방지하는 작업; (3) 상원액을 카오트로픽 염과 에탄올로 조절하여 실리카 막에 흡착을 촉진하는 결합; 그리고 (4) 세척: 막에 결합된 핵산을 알코올 기반 완충제로 헹구어 잔류 염과 억제제를 제거한 후 저이온 강도 완충제에서 용출하는 방법.

이 공정의 화학적 특성은 견고하지만, 개별 스핀 컬럼의 기계적 처리는 중간 처리량(24–100개 샘플)에서 여전히 중요한 병목 현상으로 남아 있어 수동 처리와 고가의 자동화 액체 취급 시스템 사이에 간극이 생깁니다. 수동 컬럼 기반 핵산 추출을 단순화하는 기존 접근법으로는 진공 매니폴드와 자동 정제용 로봇 워크스테이션9, 10, 11, 12가 있습니다.

진공 매니폴드는 일반적으로 원심 컬럼용 20–24 루어 플러그 어댑터가 장착된 랜덤 액세스 구성이거나, 96웰 플레이트 사용을 위한 설계로 제공됩니다. 20–24개 샘플을 사용할 수 있는 진공 매니폴드는 원심분리에 비해 DNA 정제 중 컬럼 세척 단계를 가속화하며, 로터에서 컬럼을 제거할 필요가 없게 합니다. 이 방법은 편리하지만, 컬럼 배수 팁이 진공 매니폴드의 루어 입구에 닿아 교차 오염이 발생할 수 있습니다. 컬럼에서 DNA가 루어 개구부에 들어오면, 이후 다체 사용 시 다른 샘플 컬럼으로 옮길 수 있습니다. 오염 방지를 위해 제조사는 추가 액세서리10,13; 하지만 이들은 추출 장치 조립을 복잡하게 하여 종종 생략됩니다.

96웰 포맷에 설계된 진공 매니폴드는 다른 구조를 가지며, 마이크로 원심분리기 컬럼이 아니라 실리카 막을 포함하는 호환 가능한 96웰 DNA 추출 플레이트를 위한 것입니다. 이 경우 DNA 추출은 96웰 형식의 DNA 분리 키트14를 사용하여 수행됩니다. 이 키트들은 높은 처리량을 제공하지만, 96개 미만의 샘플 처리는 종종 비현실적이어서 적용 범위가 제한적입니다.

핵산 추출을 위한 자동화 로봇 워크스테이션은 조작자의 개입이 최소화되어 연구자의 시간을 절약하고 오염과 같은 확률적 요인을 최소화할 수 있어 DNA 정제에 가장 편리한 방법입니다. 안타깝게도 대부분의 추출 스테이션은 범용성이 부족하여 전용 키트만으로 운영됩니다. 이 워크스테이션들은 주로 진단 실험실에서 사용되지만, 대부분의 중소규모 학술 실험실에서는 비용 효율적이지 않습니다.

따라서 1시간 이내에 12개에서 96개 샘플을 처리할 수 있는 중간 처리량 DNA 추출 방법에 대한 실험실 실무에는 공백이 존재합니다. 캡이 있는 스핀 컬럼을 사용하면 최대 48개의 샘플과 캡이 없는 스핀 컬럼을 사용하면 최대 116개의 샘플을 수동으로 분리할 수 있는 24웰 랙을 제공합니다. 스윙 버킷 플레이트 로터와 고정 각도 마이크로 원심분리기가 추가 장비로 사용됩니다. 플라스미드 DNA 정제 절차는 24웰 랙을 사용하는 예로 제시되는데, 플라스미드 DNA 분리에는 용해된 세포 잔해를 제거하는 정화 단계가 포함되어 있어 자동화가 어렵기 때문입니다. 그럼에도 불구하고, 이 랙들은 사실상 모든 컬럼 기반 핵산 추출 방법에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

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1. 3D 프린팅 장비 준비

  1. 0.4mm 노즐이 장착된 퓨즈 필라멘트 3D 프린터로 랙을 출력하세요. 100% 인필 소재의 일반 PLA, PETG, 또는 ABS 필라멘트를 사용하세요. 레이어 높이를 0.1 mm로 설정하고 표면 부드러움을 활성화하세요. 방수성과 기계적 안정성을 보장하기 위해 인쇄 설정을 조정하세요.
    참고: 랙 구성 요소에 대한 STL 파일은 보충 파일 1에 제공됩니다. 베이스 저장소에 지정된 인쇄 매개변수를 따르세요. 사용 전에 70% 에탄올로 저수지를 채우고 원심분리기를 점차 1, 2, 5, 10, 30분 동안 점차 테스트하여 누출이나 구조적 손상이 없음을 확인하세요.
  2. 베이스 저장소 부품들을 접착제로 붙여 밀폐된 유닛을 만듭니다.

2. 박테리아 배양 및 용해

  1. 대 장균 을 적절한 항생제가 포함된 LB 배지 3–5mL로 접종합니다. 37°C에서 12–16시간 동안 진동시키며 배양합니다.
  2. 세포는 2,000 × g 에서 원심분리하여 10분간 채취합니다. 상원액은 버리세요.
    참고: 셀 펠릿은 가공 전에 −20 °C에서 보관할 수 있습니다.
  3. 펠릿에 250 μL 부유 버퍼(RNase A가 포함된 버퍼 P1)를 추가합니다. 보텍스(vortexing)나 피펫팅으로 완전히 재현탁하세요.
  4. 용해 버퍼 250 μL(버퍼 P2)을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 4–6번 뒤집어 섞으세요.
    참고: 유전체 DNA 절단을 방지하기 위해 격렬한 혼합을 피하십시오.
  5. 중화 버퍼 350 μL(버퍼 N3)을 추가합니다. 즉시 반전(inversion)으로 완전히 섞으세요.
    참고: 흰색 침전물이 형성되어야 하며, 이는 성공적인 중화 효과를 나타냅니다.

3. 여과 장치 조립

  1. 랙의 컬럼홀더 층에 DNA 결합 컬럼을 배치합니다.
  2. 원심분리 중에 고정할 수 있도록 컬럼 뚜껑을 지정된 슬롯에 위치시킵니다.
  3. 명료화/필터 열을 제본열 바로 위에 필터 열에 배치하세요.
    참고: 필터 컬럼이 없으면 용해액을 마이크로튜브 내에서 원심분리하고 상청액을 결합 컬럼으로 옮기십시오.

4. 용해물 제거 및 DNA 결합

  1. 2.5단계에서 중화된 용해물을 여과 컬럼으로 옮깁니다.
  2. 조립된 랙을 스윙 버킷 플레이트 로터에 넣습니다.
    주의: 동일한 질량과 동일한 구성의 카운터웨이트 랙을 사용하여 적절한 균형을 맞추기 위해 주의하세요.
  3. 2,000 × g 에서 실온에서 1분간 원심분리기를 사용하세요.
  4. 원심분리기에서 랙을 분리하세요.
  5. 필터 컬럼 층을 제거하고 버립니다.

5. 세탁

  1. 저수지에서 배출된 물을 폐기통으로 버리세요. 바인딩 기둥으로 랙을 다시 조립하세요.
  2. 멀티채널 피펫을 사용해 각 결합 컬럼에 500–700 μL의 워시 버퍼를 추가합니다.
  3. 2,000 × g에서 원심분리기를 1분간 사용하세요.
  4. 저수지에서 나오는 흐름을 버리세요.
  5. 각 컬럼에 워시 버퍼를 추가하고 2,000 × g 에서 1분간 원심분리하여 세척을 반복합니다.
    참고: 컬럼은 세척 후 실온 또는 4 °C에서 보관할 수 있습니다.

6. 건조 및 용출

  1. 결합 컬럼을 선반에서 제거하여 2mL 수집관으로 옮깁니다.
  2. >10,000 × g에서 원심분리기로 막을 1분간 건조시킵니다.
  3. 1.5 mL 튜브를 세척하기 위해 컬럼을 옮깁니다.
  4. 50 μL 용출 완충제 또는 물을 막에 직접 첨가합니다. 상온에서 1분간 배양하세요.
  5. >10,000 g × 원심분리기를 1분간 사용해 DNA를 용출합니다.

7. 선택사항: 이산화티타늄과의 공동 침전

  1. 용해 완충제와 이산화티타늄 분말을 2:1 부피 대 질량 비율로 혼합합니다.
  2. 용해액에 이산화티타늄 현탁액 250 μL을 첨가합니다. 반전으로 믹싱하세요.
  3. 중화 버퍼 350 μL을 추가하고 완전히 혼합합니다.
  4. 2,000 g × 원심분리기를 1분간 사용하세요.
  5. 침전물을 건드리지 않고 상정액을 수집하세요.
  6. 상정액을 결합 기관으로 옮기세요.

결과

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래치 변형
우리는 다양한 원심분리기 모델에 적합한 네 가지 버전의 랙을 개발하여 다양한 실험실 환경에서 이용 가능한 자원을 활용하고 사용자 선호를 수용할 수 있도록 했습니다. 모든 랙은 24웰 형식을 갖추고 있지만, 버전에 따라 기둥을 위한 추가 좌석 위치가 포함되어 있습니다. 상세 치수와 호환성은 보충 파일 2 에 제공되어 있습니다.조립된 랙의 고해상도 이미지는 보충 그림 S1에 제공되어 있습니다.

기본 랙 버전(그림 1)이 가장 생산적인 구성입니다. 이 장치는 네 부분으로 구성되어 있으며, 크기는 88 × 130 × 77 mm입니다. 대문자가 있는 열을 사용할 경우 최대 48열, 대문자가 없는 열을 사용할 경우 최대 116열까지 동시에 사용할 수 있습니다. 이 랙 부품은 사용이 편리하고 원심분리 중 원치 않는 영향을 최소화하도록 설계되었습니다. 스핀 컬럼은 캡 삽입용 홈이 있는 컬럼 레이어에 배치됩니다; 이 홈들은 캡 없는 기둥도 수용할 수 있습니다. 기둥층은 저수지 위에 위치해 있습니다. 기둥의 배수 개구부는 저수지 절개구 위에 위치해 있어 인접한 기둥 간 물보라를 줄이는 데 도움을 줍니다. 액체는 컷아웃 바닥의 구멍을 통해 저장소로 빠져나갑니다. 저류층 용량은 약 100mL로, 높은 컬럼 부하를 가진 두 개의 세척 단계를 수용할 수 있습니다. 필터 컬럼 레이어는 필요할 때 컬럼 레이어 위에 배치할 수 있으며, 필터 컬럼은 바인딩 컬럼 위와 접촉 상태로 위치합니다. 캡은 필터나 결합 컬럼을 포함하는 층을 밀봉하여 원심분리기 회전 중 공기 흐름을 제한합니다. 기본 랙 버전은 A-2-DWP 버킷 로터(예: Eppendorf 5804), 로터 1770(예: HETTICH Rotina 380) 또는 이에 상응하는 시스템과 호환됩니다.

미니 랙 버전(그림 2)은 다양한 원심분리기 버킷 로터에 적합합니다. 이 부품은 세 부분으로 구성되어 있으며, 최소 크기는 82.5 × 128 × 58 mm(필터 컬럼 층 포함)입니다. 대문자가 있는 최대 48개의 열, 또는 대문자 없는 최대 90개의 열을 사용할 수 있습니다. 이 버전의 기하학적 구조는 기본 레일과 유사하지만, 열 위치의 바깥쪽 행은 제거되고 열캡용 홈으로 대체되었습니다. 저수지 용량은 인쇄된 버전에 따라 다릅니다. 가장 작은 저장소(20mL)는 약 30개의 컬럼에 대해 한 번의 세척 단계를 수용할 수 있습니다; 더 큰 저수지가 더 높은 처리량을 가능하게 합니다. 필터 컬럼 층은 작은 원심분리기에서 로터 버킷 이동을 허용하기 위해 둥근 모서리를 가지고 있습니다. 미니 랙 버전은 UC-124 버킷 로터(예: Accumax iFuge UC02) 또는 이에 상응하는 시스템과 호환됩니다. 필터 컬럼 레이어 없이 사용할 경우, 이 선반은 A-2-MTP 버킷 로터(예: Eppendorf 5430) 또는 이에 상응하는 제품과 호환됩니다.

저장소 없는(덮개가 드러난) 버전(그림 3)은 3D 프린팅 경험이 제한된 사용자에게 적합하며, 저장소를 피펫 팁 박스와 같은 외부 용기로 대체합니다. 이 버전은 세 부분으로 구성되어 있으며, 크기는 79 × 115 × 61.5 mm입니다. 대문자가 있는 최대 48열 또는 대문자 없는 최대 78열까지 사용할 수 있습니다. 기하학적 구조는 이전 버전과 유사하지만 통합 저장소가 없습니다. 대신 폐기물 수거에는 적합한 용기를 사용합니다. 컬럼 층과 필터층은 좌석 위치가 적으며, 필터층에는 로터 움직임을 방해하지 않도록 원뿔형 좌석이 포함되어 있습니다. 베이스는 표준 용기 안에 맞게 설계되었으며, 측면 스페이서를 사용해 안정화할 수 있습니다. 호환성은 선택한 용기에 따라 다르지만, A-2-DWP 버킷 로터(예: Eppendorf 5804), 로터 1770(예: HETTICH Rotina 380), UC-124 버킷 로터(예: Accumax iFuge UC02)가 포함됩니다.

캡 랙 버전(그림 4)은 가장 단순한 구성으로, 5 mL 또는 10 mL 24웰 딥웰 플레이트와 함께 사용됩니다. 이 장치는 73 × 109 × 4 mm 크기의 단일 부품으로 구성되어 있으며 최대 48개의 기둥을 사용할 수 있습니다. 이 버전은 해당 판 형식을 지원하는 모든 원심분리기 로터와 호환됩니다.

수율과 순도
DNA 추출은 대장균 배양에서 표준 수동 마이크로 원심분리기 프로토콜과 랙 기반 방법 모두를 사용하여 수행되었습니다. 분광광도 분석 결과, 랙을 이용해 추출한 DNA의 품질이 표준 방법과 비교할 만한 수준임이 나타났습니다. 일반적인 A260/A280 비율은 두 접근 방식 모두 1.8에서 1.9 사이였습니다. 총 플라스미드 수율(μg)은 기존 방법과 랙 구성을 이용한 추출 간에 유의미한 차이가 없었습니다(그림 5); 원시 데이터는 보충 파일 2에 제공됩니다. 플라스미드 구조도 보존되었으며, 이완, 선형화, 상코일 형태의 유사한 분포가 나타났다(그림 6).

교차 오염 분석
잠재적 교차 오염을 평가하기 위해 체커보드 실험이 수행되었습니다. 컬럼은 고농도 에티듐 브로마이드 용액(고역가 DNA를 모방)과 물을 번갈아 주입했습니다. 2,000 × g에서 원심분리한 후 염료 분포는 적재된 컬럼 바로 아래 폐기물 구역에 제한되었고, 인접 웰이나 인접한 컬럼 팁에서는 가시적인 신호가 감지되지 않았습니다(그림 7). 이 관찰은 랙 설계가 시험 조건에서 튀김과 교차 컬럼 이동 가능성을 줄인다는 것을 보여줍니다.

오염 상태를 추가로 평가하기 위해 실시간 PCR을 앰플리콘을 오염물질로 사용하여 수행되었습니다( 보충 문서 2 참조). 증폭은 증폭이 첨가된 컬럼에서 유출된 유루이트에서만 검출되었습니다(그림 8). 시험 조건에서는 교차 오염이 감지되지 않았으며; 하지만 작업 흐름과 샘플 유형에 따라 성능이 달라질 수 있습니다.

figure-results-1
그림 1: 랙 조립 회로도의 기본 버전. 폭발된 CAD 뷰로, (A) 캡, (B) 필터 컬럼 레이어, (C) 컬럼 홀더 레이어, (D) 베이스 저장소를 보여줍니다. 이 랙은 88 × 130 × 77 mm 크기의 네 부분으로 구성되어 있으며, 캡이 있는 최대 48개의 열, 또는 캡 없는 최대 116개의 열을 동시에 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 랙 조립 회로도의 미니 버전. 폭발된 CAD 뷰는 (A) 필터 컬럼 레이어, (B) 컬럼 홀더 레이어, (C) 베이스 저장소를 보여줍니다. 이 버전은 기본 버전과 기하학적으로 유사하지만, 두 줄의 기둥 좌석이 제거되고 기둥 캡용 홈으로 대체되었습니다. 이 도구는 세 부분으로 구성되어 있으며, 최소 크기는 82.5 × 128 × 58 mm(필터 컬럼 층 포함)이며, 캡이 있는 최대 48개의 열 또는 캡 없는 최대 90개의 열 사용을 허용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

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그림 3: 저장소 없는(덮개가 드러난) 버전의 랙 어셈블리 회로도. 폭발된 CAD 뷰: (A) 필터 컬럼 레이어, (B) 컬럼 홀더 레이어, (C) 베이스, (D) 피펫 팁 박스를 보여줍니다. 이 버전은 통합 저장소를 피펫 팁 박스와 같은 외부 용기로 대체합니다. 이 도구는 세 부분으로 구성되어 있으며, 크기는 79 × 115 × 61.5 mm이며, 대문자가 있는 최대 48개의 열을 사용할 수 있으며, 대문자 없는 열은 최대 78개까지 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: 24웰 랙의 캡 버전. 위쪽 모습(왼쪽)과 아래쪽 모습(오른쪽)입니다. 이 버전은 가장 단순한 랙 버전으로, 5 mL 또는 10 mL 24웰 딥웰 플레이트와 함께 사용됩니다. 이 도구는 73 × 109 × 4 mm 크기의 단일 부품으로 구성되어 있으며, 캡 포함 또는 사용하지 않고 최대 48열을 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 5: DNA 수율과 순도 비교. 플라스미드 수율(μg/mL)의 분광광도 분석. 기존 방법과 랙 구성으로 추출한 것 사이에서 총 플라스미드 수율에 통계적으로 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 6: DNA 품질 비교. DNA 형태는 아가로스 겔 전기영동으로 시각화되었습니다. 이완, 선형화, 슈퍼코일 형태의 DNA는 표준 수동 추출과 랙 기반 추출 사이에 유사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 7: 교차 오염 평가. 원심분리 후 폐기물 저장소 모습으로, 겹치지 않는 개별 폐기물 웅덩이를 보여줍니다. 컬럼에는 고농도 에티듐 브로마이드 용액(고역가 DNA 시뮬레이션)과 물이 적재되었습니다. 원심분리 후 인접한 '물' 우물이나 인접 기둥 끝에서는 염료가 관찰되지 않아, 시험 조건에서 튀김과 교차 기둥 이동이 감소함을 나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 8: 정량적 PCR을 이용한 교차 오염 분석. 오염물질이 포함된 샘플의 증폭 곡선은 빨간색으로 표시되고, 물만 포함된 샘플은 녹색으로 표시되었습니다. 증폭은 오염물질이 포함된 샘플에서만 검출되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 랙 디자인용 3D 모델 파일. 이 파일 세트에는 기본 랙 버전, 미니 랙 버전(여러 저장소 높이 변형 포함), 저장소 없는 버전, 캡 장착 버전 등 모든 랙 구성의 STL 파일이 포함되어 있습니다. 개별 부품(예: 베이스 저장소, 컬럼 홀더 층, 필터 컬럼 층, 캡)이 3D 프린팅을 위해 제공됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: 지원 데이터 및 방법. 이 파일 세트에는 원심분리기 적합성 표, 상세한 교차 오염 검사 절차, 원시 DNA 수율 데이터셋, 오염 분석과 관련된 PCR 기기 출력 파일이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 S1: 기본 랙 버전(완전 조립). 완전 조립된 기본 랙 구성의 고해상도 이미지로, 전체 구조와 부품 배열을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 많은 분자생물학 실험실에서 발생하는 '처리량 격차'를 해결합니다. 96웰 필터 플레이트는 더 빠르지만, 개별 스핀 컬럼에 비해 결합 용량이 낮거나 최종 농도가 낮을 수 있습니다14. 표준 스핀 컬럼을 플레이트-로터 형식으로 조정함으로써, 이 방법은 컬럼의 높은 수율과 플레이트 기반 워크플로우의 속도를 결합합니다.

이 랙은 12개 이상의 샘플을 처리할 때 가장 유리합니다. 이 프로토콜의 주요 혁신은 24웰 랙의 사용으로, 상정액과 세척액의 공동 저장소를 사용하여 컬럼 기반 핵산 추출을 단순화하고 가속화합니다. 이 랙을 사용할 때, 14–116개 샘플에 대해 이 단계를 수행하는 데 필요한 시간은 2–12개 샘플과 비슷합니다. 더불어, 개별 튜브 제거, 컬럼 이송, 세척액 버려기, 캡 개방 등 반복적인 작업이 최소화되어 작업자의 노력도 줄어듭니다. 원래 키트 구성 요소(용액과 스핀 컬럼)는 변하지 않으므로 유사한 DNA 품질이 기대되며, 제시된 결과도 이를 뒷받침합니다.

24웰 랙의 3D 프린팅은 표준 장비로도 가능하지만, 기본 및 미니 버전은 경험이 필요할 수 있습니다. 저장소 없는 버전과 캡 선반 버전은 더 단순하며 최소한의 인쇄 경험으로도 제작할 수 있습니다. 융합 증착 모델링에서 중요한 고려사항은 층 간 미세 간격의 형성으로, 이는 원심분리 시 방수 성능을 저하시킬 수 있습니다. 시험 결과 100% 충전재, 저수지 벽 두께 7mm, 층 높이 0.1mm가 충분한 방수 효과를 제공함으로 나타났습니다. 프린트 베드를 가열하고 표면 매끄러운 처리를 하면 밀봉 성능이 더욱 향상되었습니다. 반면, 에폭시 수지나 유기 용매를 사용한 프린트 후 밀봉 방식은 원심분리 중 변형으로 인해 균열과 누수를 일으켜 효과적이지 못했습니다. 벽 두께가 부족하면 구조적 파손과 방수 상실이 발생할 수 있으며, 이는 원심분리기 불균형으로 이어질 수 있습니다. 따라서 인쇄된 부품의 사용 전 테스트를 권장합니다.

네 가지 랙 버전은 버킷 로터가 장착된 다양한 원심분리기에 적합하여, 사용자가 자신의 장비와 처리량 요구에 가장 적합한 구성을 선택할 수 있습니다. 기본 랙 버전은 가장 높은 처리량을 제공하지만 더 큰 원심분리기와 더 높은 인쇄 품질이 필요합니다. 미니 버전은 원심분리기 크기 요구량을 줄이지만, 처리량은 감소시킵니다. 저장소 없는 버전은 제작을 단순화하고 피펫 팁 박스와 같은 일반적으로 구할 수 있는 용기와 호환되지만, 호환성은 용기의 형하학적 특성에 따라 달라집니다. 캡-랙 버전은 가장 단순한 구성이지만 필터 컬럼과 함께 사용할 수 없습니다.

핵산에 결합하지 않는 필터 컬럼은 표준 결합 컬럼보다 구하기 쉬울 수 있습니다. 9. 이들이 없을 경우, 추가 설명 절차가 필요할 수 있어 전체 처리 시간이 증가할 수 있습니다. 또는 필터 피펫 팁(1000 μL)이나 이산화티타늄 프로토콜을 사용할 수도 있습니다.

추출 랙은 표준 DNA 추출 워크플로우9 의 기계적 보조 장치로 기능하며, 버퍼 조성이나 컬럼 화학을 변경하지 않습니다(이산화티타늄 변형 제외). 따라서 DNA 품질에 대한 실질적인 영향은 예상되지 않으며, 이는 아가로스 겔 전기영동 및 수율 비교에서 표준 방법과 유사한 플라스미드 형태와 양을 보인 결과와 일치합니다.

공유 폐기물 저장소 사용은 교차 오염 위험을 초래하지만, 시험 조건에서는 관찰되지 않았습니다. 주요 설계 특징은 기둥 출구의 '굴뚝' 형태로, 기둥 끝과 폐액 표면 사이의 분리를 유지합니다. 이 분리를 유지하기 위해 저수지를 과도하게 채우지 않아야 하며, 각 흐름이 완전히 흐른 후 비우는 것이 권장됩니다.

이 방법의 한 가지 한계는 스윙 버킷 로터의 최대 속도(일반적으로 2,000 × g)입니다. 이 속도는 결합 및 세척 단계에는 충분하지만, 완전한 막 건조에는 충분하지 않습니다. 따라서 고정 각도 마이크로 원심분리기에서 마지막 고속 원심분리 단계가 필요합니다. 이러한 추가 조치에도 불구하고, 24개 이상의 샘플을 초과하는 배치에서는 전체 시간 절감이 여전히 상당합니다.

공개 사항

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저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 러시아 국가 임무 번호 125041005130-8의 지원을 받고 있습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3D 프린터 필라멘트NIT, 러시아-PETG 또는 PLA 권장
버퍼 N3Qiagen, 네덜란드19064
버퍼 P1Qiagen, 네덜란드19051
버퍼 P2Qiagen, 네덜란드19052
Creality Ender-3 S1 ProCreality, 중국
용출 버퍼 Qiagen, 네덜란드19086
Eppendorf 원심분리기 5702Eppendorf, 독일22626001고정각 로터
Eppendorf 원심분리기 5804 REppendorf, 독일22625080스윙 버킷 플레이트 로터
에티듐 브로마이드 Biolabmix, 러시아EtBr-10
1000 μL 필터 파이펫 팁GenFollower, 중국E-FTB1000필터 칼럼의 일부 
미니프레퍼 필터 배리어 스핀 칼럼JVLAB, 중국-필터 칼럼의 일부 
페놀 레드Lenreactiv, 러시아200125
PrusaSlicerPrusa Research, 체코 공화국
QIAprep 2.0 스핀 미니프레퍼 칼럼Qiagen, 네덜란드27115
RNase AQiagen, 네덜란드19101
워시 버퍼Qiagen, 네덜란드19065
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