현탁 T 세포 및 3D 세포 모델에서 저입력 CRISPR 유전체 편집 및 mRNA 트랜스펙션을 위한 디지털 마이크로유체 전기천공 플랫폼

요약

이 프로토콜은 디지털 마이크로유체 전공 플랫폼인 'DMF-ection'을 사용하여 원차 인간 T 세포에서 TCRα/β 수용체의 소형화된 CRISPR–Cas9 유전체 편집을 설명합니다. 이 방법은 병렬, 저입력 유전자 편집을 높은 생존율로 가능하게 하며, 다세포 3D 구형체에 mRNA 전달에도 추가적으로 적응할 수 있습니다.

초록

디지털 마이크로플루이딕(DMF) 전기천공은 포유류 세포의 정밀하고 저용량 유전적 조작을 가능하게 하며, 세포 입력을 최대 100배까지 최소화하고 생존 가능성을 유지합니다. 본 연구는 1차 인간 현탁 T 세포에서 TRAC 유전자의 CRISPR 매개 녹아웃과 3차원 HEK293T 구체의 mRNA 형질전환을 위한 고처리량 DMF 기반 트랜스펙션 워크플로우를 제시합니다. 공간적으로 침착된 CRISPR 가이드 RNA와 카트리지 내 리보핵단백질(RNP) 조립을 사용하여, CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포 집단에서 조건당 10,000개의 세포만으로 효율적인 TRAC 유좌 파괴가 달성되었으며, 후편집 생존율은 85%를 초과하였습니다. 유동 유도 및 테일러 분산 분석을 이용한 생물물리학적 특성 분석 결과, 고분자 첨가제가 전기천공 완충 조건에서 Cas9–sgRNA 복합체를 안정화하여 서브 마이크로리터 부피에서의 재현 가능한 편집을 지원한다는 사실이 밝혀졌습니다. 이 워크플로우는 3D 응용에 맞게 EGFP mRNA를 온전한 HEK293T 구상체에 전달하여 구형 성장이나 형태를 저해하지 않으면서도 견고하고 공간적으로 균일한 형광을 구현했습니다. 이 결과들은 DMF 전기천공이 현탁 면역세포와 다세포 구체 모두에서 효율적인 게놈 편집과 mRNA 전달을 가능하게 함을 보여줍니다. 이 플랫폼은 CAR-T 세포 치료, 기능적 유전체학, 고급 3D 세포 모델 응용을 위한 확장 가능하고 저입력 솔루션을 제공합니다.

서론

1차 인간 세포에서의 유전자 편집은 면역공학, 희귀질환 모델링, 기능 유^{전체학 등} 치료 개발과 기초 연구 모두에서 점점 중심적인 역할을 하고 있습니다. 전기천공은 매우 효율적인 게놈 편집을 가능하게 하지만, 기존의 쿠벳 기반 시스템은 일반적으로 한 질환당 수백만 개의 세포를 필요로 하여 환자 유래 샘플과 희귀 면역 집단에 대한 사용이 제한됩니다². 또한, 처리량, 자동화, 시^{약 소비의} 한계로 인해 대규모 스크리닝에는 적합하지 않습니다.

마이크로유체 전기포공은 저입력 유^{전체 편집에} 유망한 접근법으로 부상했습니다. 그러나 대부분의 기존 플랫폼은 복잡한 유체 처리, 제한된 시약 혼합 유연성, 그리고 상대적으로 높은 조건별 셀 요구사항을 포함하는 연속 흐름 구조에 의존하고 있습니다. 반면, 디지털 마이크로플루이딕스(DMF)는 평면 전극 배열 위 내 이산 나노리터 규모의 물방울을 능동적으로 조작할 수 있게 하여 반응 조성, 타이밍, 공간 위치 지정을 정밀하게 제어할 수 있게 합니다. 이 플러그 앤 플레이 드롭렛 기반 형식은 1차 세포와 시약의 보존^{이 필수적인} 저부피, 고처리량 워크플로우에 매우 적합합니다.

최근 연구는 삼중 방울 전기천공 구조를 이용한 DMF 기반 세포내 전달의 실현 가능성을 입증했으며, 이는 국소적이고 저전류의 전기장을 생성하여 효율적인 RNP와 mRNA 전달을 가능하게 하면서 열 및 전기화학적 스트레스를 최소화하는 방식입니다. ^6,7,8. 이 기반 위에 48개의 독립적으로 주소 지정 가능한 반응 부위, 완전 자동화 호환성, 확장 가능한 카트리지^{제조 9}(그림 1)을 갖춘 차세대 DMF 전기천공 플랫폼인 'DMF-ection'이 개발되었습니다. DMF 카트리지는 하단 PCB 플레이트와 플라스틱 상단 플레이트로 구성되며, 가스켓으로 분리되어 있으며, 정렬 스냅으로 단일 올바른 방향으로 조립됩니다(그림 1A). 48-plex 레이아웃은 8개의 동일한 계열(그림 1A–H)으로 구성되며, 각 계열은 6개의 독립적으로 주소 지정 가능한 전기천공 부위를 포함하고 있으며, 카트리지당 최대 48개의 병렬 편집 조건을 지원합니다(그림 1B). 가이드 RNA 라이브러리는 카트리지 조립 전에 음향 디스펜서를 사용해 기판 표면에 증착됩니다. 48개 부위 모두에서 위치 정확도가 확인되었으며, 드롭 위치는 전극 중간점에서 서브밀리미터 편차(그림 1C) 내에 모여 신뢰성 있는 카트리지 내 RNP 조립을 지원하였습니다. 장전 후 셀과 액체 전극 방울이 카트리지에 작동하여 삼액 전기공 기하학을 형성합니다(그림 1D). 전기천공 후 세포는 배양 플레이트로 분리되어 회수 및 후속 분석(플로우 사이토메트리, 시퀀싱, 현미경 등)을 포함합니다(그림 1E). 이 시스템은 표준 큐벳 기반 방법에 비해 최대 100배 적은 세포로 고효율 게놈 편집을 가능하게 하여, 저입력 및 고처리량 응용 분야에서 게놈 공학의 접근성을 크게 확장합니다.

이 연구는 mRNA와 CRISPR–Cas9 리보핵단백질(RNP) 복합체를 포함한 여러 생체분자 화물을 전달하여 플랫폼의 성능을 평가하여 효율적인 형질전환과 유전자 교란을 달성합니다. 1차 T 세포 외에도, DMF-ection은 핵산을 복잡한 다세포 구조에 전달하는 일반화 가능한 틀을 제공합니다. 3차원(3D) 구형체와 오르가노이드 모델은 구조와 취약성 때문에 시약 침투에 상당한 장벽을 두며, 기존의 전기천공 방식은 형태학을 방해하거나 이질적인 전달을 유발하는 경우가 많습니다. T세포 편집에 사용되는 동일한 소형 전기천공 원리가 구조화된 조직에도 적용되는지 평가하기 위해, DMF 워크플로우를 3D HEK293T 구상체에 적용하였습니다. 이 실험들은 DMF 기반 전기습윤이 삼액 형상 내에서 온전한 구체를 부드럽게 위치시키고, 구조와 성장을 보존하면서 균일한 mRNA 전달을 지원할 수 있음을 입증했습니다. 이 결과들은 여기서 설명한 주요 T-세포 프로토콜 밖에 있지만, 신약 발견 및 질병 모델링과 관련된 신흥 3D 세포 시스템에 프로그래밍 가능한 DMF 전기천공이 더 널리 적용될 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 1차 인간 T 세포는 상업 공급자로부터 사전 동의 하에 제공되었으며, 관련 기관, 윤리, 규제 지침을 준수하였습니다. 인간 유래 생물학적 물질의 모든 취급은 기관 생물안전 프로토콜에 따라 이루어졌습니다. 이 프로토콜을 시행하는 연구자는 1차 인간 세포 사용이 지역 기관 심사 위원회(IRB) 또는 윤리 위원회 요건, 적용 생물안전 규정, 그리고 인간 생물학적 물질 사용을 규율하는 관련 국가 또는 지역 법률을 준수하는지 책임이 있습니다. 이 연구에 사용된 세포 물질에는 환자 식별 가능한 정보가 없었습니다.

1. 1차 인간 T 세포의 준비 및 활성화

1. 37 °C 수욕에서 1차 인간 CD3⁺ T 세포를 빠르게 냉동 보존합니다. 세포를 예열된 기저 T세포 배지로 옮기고 180 × g 에서 10분간 원심분리합니다. 상원액을 버리고 펠릿을 새 배지에 다시 부탁하세요.
2. 자동 세포 계수기를 사용해 세포 농도와 생존 가능성을 측정합니다.
3. 1×¹⁰ 6 세포/mL 용량의 T세포 배양 배양지에 재현탁하며, 공급업체 지침에 따라 용해성 사양체 항체 CD3/CD28 T세포 활성화 자극제와 200 IU/mL IL-2를 보조합니다. 세포를 37°C, 5% CO₂에서 72시간 배양합니다.
   참고: 활성화 시 세포 밀도를 0.5–2 × 10⁶ cells/mL 사이로 유지하세요. U-bottom 96-웰 플레이트에서 활성화를 수행하여 세포와 활성화자 간 접촉 및 활성화 효율을 최적화합니다.

2. DMF 기판 내 가이드 RNA 스팟 준비(음향 디스펜서 스포팅)

1. 핵효소가 없는 물에서 100 μM의 재고 농도로 동화된 sgRNA를 재구성합니다. 별도의 튜브에서 100 mg/mL의 폴리-L-글루탐산 재고(PGA, 나트륨염, MW 15,000–50,000 Da)를 뉴클레아제 무첨가물에 준비합니다. sgRNA와 PGA 재고를 5:4 부피비(sgRNA: PGA)로 결합하면 최종 sgRNA 농도는 55.6 pmol/μL, 최종 PGA 농도는 44.4 mg/mL로 나옵니다. 1,000 g 에서 잠시 원심분리× 30초간 소용돌이로 하며, 일회용 부피로 나누어 사용하지 않은 분량은 −80°C에서 최대 6개월간 보관합니다.
   참고: 반복되는 동결-해동 사이클은 피하세요.
2. 가이드-PGA 혼합물을 원하는 반응 부위 배치에 대응하는 웰의 저죽음 음향 소스 플레이트에 추가합니다.
3. 보정된 음향 디스펜서를 사용하여 가이드-PGA 혼합물의 40 nL(2.2 pmol sgRNA에 해당)을 DMF 기판의 각 표적 스포팅 영역에 전달합니다.
   참고: 55.6 pmol/μL에서 40 nL은 부위당 2.2 pmol sgRNA를 제공합니다(55.6 × 0.040 = 2.22 pmol). 건조된 가이드는 액적 합류 시 카트리지에서 재구성됩니다; 완전한 재정지는 사이트 간 일관된 편집 효율성으로 확인됩니다.
4. 생물학적 안전 캐비닛에서 점액이 있는 방울을 상온에서 완전히 자연 건조하여 보이는 액체가 사라질 때까지 약 5분간 기다립니다.
   참고: 강제 공기 흐름이나 열은 가이드 RNA를 떨어뜨리거나 분해할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
5. DMF 카트리지를 조립하세요.
   1. 생물학적 안전 캐비닛에서는 상단 플레이트를 반점 기판 위에 정렬시키고, 상단 플레이트의 비대칭 플라스틱 스냅 기능과 하단 플레이트의 홈을 맞추도록 합니다. 짧은 가장자리에 고르고 동시 압력을 가해 뚜렷한 기계적 스냅 소리가 느껴지면 잠금 기능이 완전히 맞물리는 것을 확인합니다.
      참고: 탄환은 단일 올바른 방향으로 설계되었으며; 잘못된 조립은 스냅 소리를 내지 않습니다. 기질을 항상 가장자리로 잡아 오염이나 손상을 방지하고, 기질이 서로 미끄러지면 표면 코팅이 긁힐 수 있습니다.
   2. 체크포인트: 기계식 스냅으로 올바른 조립을 확인하세요.
      참고: 코팅 무결성을 미리 측정하는 전기적 표시기가 없습니다; 부적절한 조립으로 인한 기능 실패는 자동으로 감지되어 실행 후 품질 관리 보고서에 보고됩니다.
      일시정지: 사용하지 않은 조립된 카트리지를 밀봉된 포장에 흡습제(실리카 젤 봉지)와 함께 실온에서 최대 48시간 보관하세요.

3. 세포 준비

1. 각 사용 전에 DMF 호환 전기천공 버퍼와 제공된 생체 적합성 비이온 계면활성제를 20:1(v/v) 비율로 결합하여 1mL의 완전 transfection 버퍼를 새로 준비하여 최종 계면활성 농도는 0.05%(v/v)를 만듭니다. 부드럽게 섞고 얼음 위에 보관하세요.
   참고: 여기서 사용된 DMF 호환 트랜스펙션 버퍼는 저전도도, 등장성 완충제(전도도: 3.5 mS/cm, 삼투압: 305 mOsm/L)입니다. 대체 버퍼를 사용하는 연구자는 DMF 작동과 세포 생존 가능성과의 적합성을 검증해야 합니다. 생체적합성 비이온 계면활성제는 방울 핀을 줄이는 역할을 합니다; 제공된 계면활성제가 사용되지 않는다면, 적절한 대체물로 사용한다.
2. 활성화된 T 세포를 변속 버퍼(계면활성제 없음)로 한 번 세척합니다. 180 × g 에서 5분간 원심분리하고, 상원액을 흡인한 후 세포 펠릿을 계면활성제 함유 1.0 × 10^{7 셀/} mL로 카트리지당 100 μL 용량으로 재현탁합니다. 얼음 보관하세요.
3. 카트리지에 장전하기 직전에 Cas9 뉴클레아제를 100 μL T-셀 현탁액에 직접 첨가하고 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다; 얼음 보관하세요.
   참고: 1차 T 세포의 경우 Cas9는 100 μL 카트리지 부피당 42 pmol(0.42 pmol/μL)으로 적재됩니다. 각 전기천공 부위는 약 1 μL의 세포 현탁물을 처리하며, 편집당 0.42 pmol Cas9를 전달합니다. 다른 면역 세포 유형에 적응할 때는 이 용량을 최적화하세요( 표 1 참조).

구성 요소	편집 각 최종 농도
Cas9	0.42 pmol ⁉ μL 방울
sgRNA	2.1 pmol (40 nL 스팟에서)
PGA	스포팅 믹스에 44.4 mg/mL 스톡
계면활성제	0.05% (v/v)
셀 입력	~10,000 셀

표 1: 각 트랜스펙션 드롭의 최종 농도 요약표.

4. DMF 생성 플랫폼에서의 트랜스펙션

1. 멀티채널 피펫을 사용해 8개의 셀 로딩 포트 각각에 10 μL의 T-셀/Cas9 혼합물을 투여하고, 16개의 액체 전극 로딩 포트에 10 μL의 완전한 트랜스펙션 버퍼를 분사합니다( 그림 1 참조).
2. 전압을 500V, 펄스 시간을 3ms, 펄스 수를 2로 설정하세요. 플랫폼 지침에 따라 전기천공 시퀀스를 시작하세요.
   1. 체크포인트: 달리기 직후 QC 보고서를 검토하세요. 산발적인 실패(<10%)는 개입이 필요하지 않습니다. 고장이 체계적으로 발생하면 카트리지를 제공된 QC 보드로 교체하고, 시스템 건강 점검(~2분)을 실행한 후 문제가 계속되면 기술 지원에 연락하세요.

5. 편집된 T 세포의 오프로드 및 회복

1. 액체 핸들러를 사용해 각 반응 부위에서 전기천공된 세포를 96웰 U-바닥판으로 옮기며, 이 배지에는 150 μL의 예열된 기저 T-세포 배양지와 200 IU/mL IL-2가 보충됩니다.
2. 세포를 37°C, 5% CO₂에서 72시간 동안 배양하여 단백질 교체와 표면 수용체 발현 변화를 허용합니다.

6. TRAC 녹아웃의 유세포검사 분석

1. 세척 사이의 세포 손실을 줄이기 위해 멸균된 96웰 원뿔형 바닥판으로 세포를 옮깁니다. 400 × g 에서 원심분리하여 5분간 원심분리하고 원뿔형 바닥판을 부드럽게 뒤집어 상원액을 제거하여 플로우 사이토메트리 버퍼(1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA)로 세포를 두 번 세척합니다. 세포는 플레이트 내에 남아있습니다.
2. 제조사 권장 농도로 유동 세포 차단기 버퍼에서 항-CD4, 항-CD8, 항-TCRα/β 항체를 포함한 표면 염색 마스터 믹스를 준비합니다. 우물당 마스터 믹스 25 μL을 추가하고 4 °C에서 빛을 차단한 상태로 20분간 배양합니다. 1× PBS(FBS 제외)로 400 × g 에서 원심분리기로 5분간 두 번 세척하세요. 생존 염료가 포함된 1× PBS 100 μL에 세포를 재현탁하고, 빛으로부터 보호된 상온에서 10분간 배양합니다.
   참고: 원뿔형 바닥판은 세포 펠릿에 효과적입니다; 모든 단계에서 세포가 잘 재현탁되어 있는지 점검하세요.
3. 유동 세포분석 버퍼로 세포를 두 번 세척한 후 샘플당 150–200 μL에 재현탁하여 채취합니다.
4. 세포계는 사용되는 형광색소에 맞는 적절한 레이저 라인과 필터 세트로 구성하세요(예: 생존성 염료는 488nm 여기, 표면 마커는 405nm 또는 488nm). 단일 염색 보상 조절과 염색되지 않은 샘플을 사용하여 전압을 설정합니다. 샘플당 최소 5,000건의 라이브 싱글렛 이벤트를 수집하세요. 순차적으로 게이트: 살아있는 세포→ 산란 단일 입자(생존 염료 음성) → → TCRα/β 발현을 .
   참고: 표준 조건에서는 세포가 증식한 시간이 있었기 때문에 세척과 염색 과정에서 손실된 후 샘플당 5,000에서 10,000 이상의 생체 반응이 발생할 수 있습니다.
5. CD4⁺ 및 CD8⁺ 집단 내에서 TCRα/β음성 세포의 빈도를 측정하여 TRAC 유전자 교란을 규명합니다. 각 하위 집합에 대해 살아있는 싱글렛 게이트에 비해 TCRα/β 음성 세포의 비율로 녹아웃 효율을 보고합니다.

결과

예상 결과
10,000개의 활성화된 T 세포를 전기천공하면 일반적으로 형질인화 후 72시간 후 >85%의 TRAC 녹아웃 효율과 >95%의 생존율을 보입니다. 유세포 검사 결과, TRAC 표적 조건에서 비표적 sgRNA 대조군(NTC)과 전기장에 노출되지 않은 대조군에 비해 TCRα/β 염색이 명확히 소실되어 있음을 확인할 수 있습니다. 별도 명시가 없는 한, n은 별도의 날에 수행되는 독립적인 DMF 실험 실행을 나타냅니다. 동일한 카트리지 연속에서의 기술적 복제는 통계 분석 전에 평균을 내어 n에 독립적으로 기여하지 않습니다. 여기서 보고된 모든 T 세포 실험은 단일 건강한 기증자로부터 얻은 냉동 보존 세포를 사용하여 수행되었습니다. 같은 플랫폼을 사용한 기증자 간 변동성은 추가로⁹.

음이온 고분자 첨가제로 인해 전기천공 조건에서 Cas9–sgRNA 리보핵단백질 안정성이 향상됨
디지털 마이크로플루이딕스의 핵심 설계 요구사항 중 하나는 전기습윤 동안 물방울이 자유롭게 미끄러질 수 있도록 하는 매우 소수성 표면입니다. 이 특성은 방울 운동과 정밀한 작동에 필수적이지만, 시약 로딩에는 어려움을 초래합니다. 배열 스크리닝 응용 분야에서는 사용자 정의 페이로드 라이브러리를 카트리지 표면에 직접 전달할 수 있어야 합니다. 이로 인해 시약 레이아웃이 사용자의 라이브러리 설계를 반영할 수 있고, 디지털 마이크로플루이딕 워크플로우가 추가적인 전송이나 수동 개입 없이 배열된 실험을 원활하게 수행할 수 있습니다. 음향 디스펜서를 통한 나노 디스펜서는 이 작업에 매우 적합하며, 큰 배열에서 다양한 표면에 높은 위치 정확도로 나노리터 부피를 전달할 수 있습니다. 하지만 소수성 카트리지 표면에 비말이 닿으면 튕기거나 구슬이 생기거나 균일하게 퍼지지 않아 침착과 회수가 불규칙하게 발생합니다. 이 변동성은 40 nL에서 120 nL 사이의 중간 액적에서 가장 뚜렷하게 나타납니다(그림 2A, 조건당 n = 3, *** p 값 < 0.01). 이때 방울의 운동 에너지는 반동을 일으킬 만큼 높지만, 표면 접착력은 액체를 고정시키기에 충분하지 않다고 가정합니다. 따라서 더 높은 페이로드 용량에서 직접 온카트리지 침착은 추가 수정 없이는 신뢰성이 떨어질 수 있습니다. 이 효과를 완화하기 위해 시약에는 바이오세이프 폴리머인 폴리-L-글루탐산(PGA)이 보조되었습니다. PGA는 생분해성 음전하를 띠는 폴펩타이드로, 제약 제형에서 안정제로 널리 사용되며, 생세포 워크플로우에 매우 적합합니다. 전하를 띤 골격은 방울 접촉각을 낮추고 더 균일한 확산을 촉진하여 반동을 줄이고 표면 접착력을 개선하는 것으로 추정됩니다. PGA가 있을 때, 침착된 형광 부피는 흡광도에 따라 선형적으로 증가했고, 카트리지 간 분산이 현저히 줄어들었습니다. 통계 분석 결과, PGA는 40, 90, 120 nL 스포팅 부피(***p < 0.001, ****p < 0.0001)에서 재현성을 유의미하게 개선했으며, 매우 작은 방울(10–20 nL)은 낮은 운동 에너지에서 반동이 덜 뚜렷해 차이가 거의 없음을 확인했습니다.

다음으로, DMF 작업 흐름에 사용된 폴리머 첨가제의 첨가가 전기공공에 사용되는 저부피 완충 조건에서 Cas9–sgRNA 리보핵단백질(RNP) 거동에 미치는 영향을 평가하였습니다. 이를 위해 유량 유도 분산 분석(FIDA) 기술이 사용되었습니다. FIDA는 유체역학적 반경과 결합 친화도를 정확히 용액상 측정할 수 있어 실험 환경에서 사용되는 완충 조건에서 단백질-핵산 상호작용을 정량화할 수 있기 때문에 선택되었습니다. FIDA는 자유 sgRNA가 3.45 ± 0.26 nm의 유체역학적 반경(Rh)을 보이며, 이는 작고 단가닥인 RNA 종과 일치함을 입증했습니다. Cas9 조절은 Rh가 15.32 ± 0.46 nm, 서브나몰 결합 친화도(KD = 0.70 ± 0.14 nM)를 가진 안정적인 RNP 복합체를 생성했습니다(그림 2).

고분자 안정화 효과를 평가하기 위해 RNP 형성 전에 가이드 RNA에 폴리-L-글루탐산(PGA)을 첨가하였습니다. PGA의 존재는 Cas9와 sgRNA 간의 친화도를 감소시켰으며(K_D = 67.7 ± 9.5 nM), 복합체 크기를 약 10 nm로 감소시켰다(오른쪽 패널 그림 2A ). 친화도 감소는 복합체가 덜 밀접하게 연관되어 있음을 시사하지만, 더 작고 균일한 R_h 는 PGA가 과도한 RNP 조립체 형성을 방지함을 시사한다(그림 2B).

다음으로, 테일러 분산 분석을 이용한 전기천공 조건에서 RNP 안정성을 평가하였다(그림 2C). 고분자가 없으면 Cas9–sgRNA 혼합물은 넓고 적합하지 않은 테일러그램을 생성하여 응집을 나타냅니다(그림 2B). 반면, 0.0025 mg/mL PGA를 첨가하면 R_h ~ 9.6 nm의 명확한 단분산 분산 프로파일(R² = 0.999)이 나타났습니다. 이 결과들은 PGA가 응집을 방지하고 RNP의 균일성을 향상시켜 재현 가능한 나노리터 규모의 전기천공을 지원함을 보여줍니다. 이러한 안정화는 하위 T세포 실험에서 관찰되는 높은 편집 효율에 대한 메커니즘적 근거를 제공합니다.

일차 T 세포의 용량 의존적 편집 효율

FIDA 실험에서 PGA가 RNP 조립 효율을 감소시키는 것으로 나타났지만, 전기천공은 일반적으로 Cas9에 비해 과도한 가이드 RNA로 수행되므로 기능적 편집 결과는 덜 영향을 받을 것으로 가정되었습니다. 따라서 PGA–RNP 입력량이 TRAC 좌위의 1차 인간 T 세포에서 녹아웃 효율에 미치는 영향을 평가하였습니다(그림 2D). 네 가지 카트리지에서 편집 효율은 40 nL(2.1 pmol), 20 nL(1.05 pmol), 10 nL(0.53 pmol) RNP 입력에서 일관되게 높았으며(>75–80%)를 보였으며, CD4⁺ 와 CD8⁺ 하위 집합 간 변동은 거의 없었다. 5 nL(0.26 pmol) 상태에서도 편집은 견고하게 유지되었으나, 높은 용량에 비해 약간의 감소가 관찰되었습니다. 가장 낮은 용량(2.5 nL, 0.13 pmol)에서는 편집 효율이 크게 감소하여 약 ~60% TRAC KO에서 정체되었습니다. 대조군은 편집의 특이성을 확인했는데, 무전기천공 웰(0V)과 오프 카트리지 조절(OCC)은 배경 녹아웃만을 보였다. 오프-카트리지 대조군(OCC) CD8⁺ 집단에서 관찰된 높은 TCR 음성 주파수는 활성화 후 기증자 특이적 TCR 하향 현상을 반영하는 것으로 보이며, 전기천공이나 유전자 편집과는 무관하게, 이들 세포는 카트리지에 노출되지 않았습니다. 이 결과들은 DMF-ection이 나노리터 규모의 RNP 입력에서 CRISPR 매개 편집을 효율적으로 가능하게 함을 보여줍니다. 중요한 점은 CD4⁺ 와 CD8⁺ T 세포 간 편집 결과가 유사하다는 점으로, 이 플랫폼이 T 세포 하위 집합에 적용할 수 있음을 강조하고, 녹아웃 효율을 저해하지 않으면서도 RNP 사용을 100배 이상 줄일 수 있음을 시사했습니다.

미니어처화된 DMF 추출을 이용한 1차 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서의 효율적인 유전자 교란
DMF 추출 워크플로우의 성능을 더 깊이 검증하기 위해, CRISPR–Cas9 매개 TRAC 위치 녹아웃을 1차 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에서 각 조건당 10,000개의 활성화 세포만을 사용하여 평가하였습니다. 세 가지 실험군이 포함되었습니다: TRAC 표적 가이드 조건(TRAC KO), RNP 전달의 비특이적 효과를 고려하는 비표적 대조군(NTC), 그리고 처리되지 않고 조작되지 않은 세포에서 기초선 TCRα/β 발현을 확립하는 오프-카트리지 대조군입니다. 표준 게이팅 전략을 적용해 생 싱글렛을 식별한 뒤, CD4⁺ 및 CD8⁺ 소집합과 TCRα/β 발현을 분석했습니다(그림 3A). TRAC 좌위의 고효율 유전자 파란은 40회의 독립 전기천공 실행 후 두 T세포 소집합에서 달성되었습니다. CD4⁺ T 세포에서 TRAC 녹아웃 효율은 88.4± 4.9%였으며, NTC에서는 3.2± 4.7%, OCC 조건에서는 9.8± 5.1%에 비해 낮았습니다. CD8⁺ T 세포에서도 유사한 결과가 관찰되었으며, TRAC KO는 89.8± 4.2%에 도달했으며, NTC는 4.2± 7.4%, OCC는 20.2± 4.9%에 달했습니다(그림 3B, 왼쪽). 중요한 점은, 전기천공은 조건 간에 상당한 세포독성을 발생시키지 않았다는 것입니다. 모든 그룹에서 생존율이 96%를 초과했으며, TRAC KO(97.1 ± 1%), NTC(96.8 ± 1%), OCC(97 ± 1%) 조건 간 유의한 차이는 없었다(그림 3B, 오른쪽). 이 데이터를 종합해 보면, DMF 전기천공이 여러 독립적인 실행 간에 세포 생존성을 유지하면서 견고하고 효율적인 TRAC 교란을 가능하게 함을 보여줍니다. 1차 인간 T 세포는 상업적 출처에서 기증자 동의를 받고 기관 및 공급업체의 윤리 지침에 따라 획득되었습니다.

디지털 마이크로플루이딕스를 이용한 HEK293T 구형 처리
다음으로, 다세포 3차원 구조가 적용되는 응용 분야를 위한 디지털 마이크로유체 전기천공 워크플로우를 평가하였습니다. 속이 빈 HEK293T 구형체는 저부착 마이크로플레이트에 우물당 약 100개의 세포를 시딩하고 24시간 배양하여 구형 형성을 가능하게 하여 형성되었습니다(그림 4A). 형성된 구체는 이후 수집되어 재현탁된 후 디지털 마이크로플루이딕 카트리지에 적재되어 전기천공을 진행했습니다. 처리 후, 구형은 96웰 플레이트에 하류 영상 및 성장 분석을 위해 분리되었습니다.

전기천공 후 유정당 평균 1개의 구체를 회수하기 위해, 취급 및 이송 중 재료 손실을 보상하기 위해 카트리지에 과도한 수의 구체체를 의도적으로 적재했습니다. 약 192개의 구형이 100 μL 전기천공 버퍼에 재현탁되어 카트리지에 장전되었다. 각 반응 계열은 ~9.3 μL의 현탁액을 받았으며, 이는 ~18개의 구형에 해당하며, 개별 방울에는 ~1 μL(1–2개의 구상체)가 포함되어 있었습니다. 카트리지 작동 중 약 절반의 구체가 장전 포트에 남아 있었기 때문에, 이 장전 전략은 삼방울 전기공공 부위당 평균 ~1개의 구체를 생산할 수 있게 되었습니다.

구형 회수 분석 결과, 전기천공 후 우물당 약 4–6개의 구체가 회수되는 것으로 나타났습니다(그림 4B 왼쪽 패널). 이 회수는 이론적 최대치보다 낮으며, 세척 중 발생하는 손실, 상정액 흡입, 로딩 포트 내 구형 잔류를 반영합니다. 이러한 손실은 구형 직경이 작음(~100 μm)과 현탁 내에서 비단일 세포 구조의 균일한 분포를 유지하는 데 본질적인 어려움 때문으로 설명됩니다. 그 결과 일부 구체는 고르게 분포하지 않거나 삼액상 영역에 들어가지 못합니다. 과도한 수의 구체를 적재함으로써 대부분의 전기천공 부위에 적어도 하나의 구체가 존재하여, 마이크로플루이딕스 카트리지에서 DAPI 염색된 구체의 현미경 영상을 통해 일관된 후속 분석을 가능하게 했습니다(그림 4B, 오른쪽 패널). 추가 공정 최적화는 동등한 회수를 달성하는 데 필요한 구형 수를 줄일 수 있습니다. 이러한 처리 손실에도 불구하고, 작업 흐름은 삼액 전기천공 형상 내에서 온전한 구체를 부드럽게 위치시킬 수 있게 했습니다.

EGFP mRNA 전달과 HEK293T 구상체에서의 생존 가능성
전기천공(구형당 50 ng의 GFP mRNA) 후 EGFP mRNA가 HEK293T 구상체로 효율적으로 전달되는 것이 관찰되었습니다. 전기천공 후 24시간 후 실시된 형광 현미경 검사에서는 전기천공된 구형 전반에 걸쳐 견고하고 공간적으로 균일한 GFP 발현이 확인되었으나, 0V 또는 카트리지 외 제어 조건에서는 검출 가능한 형광이 관찰되지 않았습니다(그림 4C, 왼쪽 패널). 구형 면적별 정규화 평균 형광강도(MFI)의 정량 분석 결과, 두 전기천공 매개변수 집합 모두에서 성공적인 형질전환이 확인되었습니다(그림 4C, 중간 패널). 구체적으로, 500 V, 2 ms, 2 펄스에서 전기공공된 구형체는 ^10-5 ± 3.50 × ^10-5× 6.96 MFI를 보였으며, 375 V, 6 ms, 1 펄스로 전기천공된 구형체는 ^10-5 × 3.29 ± ^10-5× 5.05 MFI를 보였다. 대조군 조건(0 ± 0)에서는 측정 가능한 형광이 검출되지 않았습니다. 두 전기천공 조건 모두 대조군에 비해 유의하게 높은 형광(p < 0.05)을 발생시켰으며, 펄스 매개변수 간 통계적으로 유의미한 차이는 없었습니다. 전기천공이 구형 성장이나 구조적 완전성에 부정적인 영향을 미치는지 평가하기 위해, 치료 후 5일 동안 매일 구형 직경을 측정하였다. 전기포공된 구체는 처리되지 않은 대조군과 유사한 성장 속도를 보였으며, 이는 mRNA 형질전환이 구상체 생존력이나 증식 능력을 저해하지 않음을 나타냈다(그림 4C, 오른쪽 패널). 이 결과들은 디지털 마이크로유체 전기천공이 구조적 완전성과 성장을 유지하면서 mRNA를 온전한 다세포 구형체에 효율적으로 전달할 수 있음을 보여주며, 이 플랫폼을 3차원 세포 모델로 확장하는 가능성을 뒷받침합니다.

데이터는 평균± 표준편차로 제시됩니다. 통계적 유의성은 Tukey의 사후 보정을 적용한 일방향 ANOVA를 사용하여 다중 비교에 대해 유의치 임계값 p < 0.05로 산출하였다. N 값은 그림에 명시된 독립적인 생물학적 복제체(별도의 기증자 또는 독립 카트리지 런)를 나타냅니다.

그림 1. DMF 전기천공 플랫폼 아키텍처 및 워크플로우. (A) DMF 탄환 사진. (B) 조립된 48플렉스 카트리지 레이아웃의 주석 도식(중앙 이미지), 8개의 동일한 계열이 (A–H) 조직되어 있으며, 각 계열은 6개의 독립적으로 주소 지정 가능한 전기천공 부위를 포함하고 있으며, 액체 전극 로딩 포트, 셀 로딩 포트, 양극, 음극, 나노 스팟 영역이 라벨링되어 있습니다(왼쪽 삽입 이미지). 적재 포트, 하역 포트, 조립 스냅 등 주요 특징이 라벨링되어 있습니다. 카트리지는 두 판을 하나의 올바른 방향으로 스냅 맞추어 조립하여 뚜렷한 기계적 접촉이 느껴질 때까지 진행합니다. 오른쪽 이미지: 액체 핸들러 디스펜스 지도로, 적재 포트(빨간색), 하역 포트(분홍색), 목표 영역 탐지(파란색)의 색상 구분 위치를 보여줍니다. (C) 왼쪽: 48개 부위 전반에 걸쳐 음향 분사의 위치 정확도를 보여주는 이미지(n = 48)와 전극 중간점(mm)에 대한 낙하 위치가 표시되어 있습니다. 이 촘촘한 클러스터링은 서브밀리미터 증착 정확도를 확인시켜 줍니다. 오른쪽: 세포 방울에 의해 재수화되기 전(위쪽)과 재수화 과정에서 방울이 가이드가 있는 곳으로 왕복되어 재현탁되는 모습(아래, 빨간 화살표)을 보여주는 대표적인 사진들입니다. (D) 이산 전기천공 영역의 상단 모습으로, (i) 침착된 가이드 RNA를 따라 방울을 앞뒤로 셔틀하여 페이로드의 재수화, (ii) 양극과 음극 사이의 전기천공 부위로의 이동, 여기서 셀 방울이 양옆 액체 전극 방울과 연결되어 펄스되는 과정, 그리고 (iii) 액체 취급자가 회수하기 전에 전체 트라이 드롭이 하역 포트로 이동하는 것. (E) 엔드 투 엔드 워크플로우 도식. 가이드 RNA는 음향 디스펜서를 사용하여 카트리지 기판에 증착됩니다. 셀과 페이로드는 자동 액체 취급 장치를 통해 준비되어 카트리지에 적재됩니다. 전기천공은 DMF 플랫폼에서 수행됩니다. 세포는 96웰 플레이트에 분리되어 인큐베이터로 옮겨져 회수합니다. 하위 분석은 유세포분석, 현미경, 차세대 시퀀싱 또는 기타 적절한 측정을 사용하여 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2. 고분자 보완이 침착 및 RNP 조립에 미치는 영향. (A) 폴리머 보충제는 음향 증착 충실도를 향상시킵니다. 폴리-L-글루탐산 유무 여부와 관계없이 네 개의 독립 카트리지에 걸쳐 침착 및 재구성된 후 형광 흡수. PGA가 존재하는 중간 부피(40–120 nL)에서 분산이 감소했습니다. 
(B) PGA가 Cas9–sgRNA 조립에 미치는 영향. PGA가 없을 때(왼쪽 패널) 또는 존재할 때(오른쪽 패널) 중 유체역학적 반지름(Rh)을 측정하는 FIDA 친화성 결합 곡선. 자유 sgRNA는 Rh가 3.45 ± 0.26 nm였고, Cas9 적정 시 RNP 복합체 크기는 15.32 ± 0.46 nm(Kd = 0.70 ± 0.14 nM)를 보였다. PGA 첨가는 복합체 크기를 감소시키고 결합 친화도를 농도에 따라 약화시켰습니다. 0.005 mg/mL PGA를 첨가하면 자유 sgRNA는 4.31 ± 0.07 nm의 Rh를 보였고, Cas9 적정 시 RNP 복합체 크기는 10.21 ± 0.38 nm(K)를 기록했습니다_d = 67.7 ± 9.5 nM). 실험은 0.05% 플루로닉 F-68을 사용한 저전도도 전기천공 분석 버퍼에서 수행되었습니다. 통합 LED 모듈을 사용해 480nm에서 형광을 검출했습니다. 모든 실험에는 영구 코팅된 모세관(Ø 75 μm, L = 100 cm)이 사용되었습니다. 폴리 아니이온 폴리머가 RNP 조립에 미치는 영향을 시험하기 위해, PGA를 0.0025 mg/mL 및 0.005 mg/mL 농도의 분석 혼합물에 첨가하였다. 이러한 조건들은 디지털 마이크로플루이딕스, 전기습윤 및 전기천공 버퍼에 사용되는 범위를 모델링하기 위해 선택되었습니다. 직접 결합 분석에서는 TRAC 유전자좌를 표적으로 하는 10 nM FAM 표지 sgRNA를 형광 지표로 사용하였습니다. Cas9 뉴클레아제의 농도가 증가하는 것(최대 500 nM)을 CapMix 분석법에서 지표에 대해 조절하여 복합 형성을 위한 분산 프로파일을 생성하였습니다. 모든 실험은 25°C에서 수행되었으며, 각 데이터포인트는 40 nL Indicator와 ~12 μL의 분석물(Cas9)을 소비했습니다. 실험은 다음과 같은 순서로 진행되었습니다: (1) 3,500 mbar에서 0.1% 인산으로 30초간 플러싱; (2) 3,500 mbar에서 30초 동안 분석 버퍼를 사용한 플러싱; (3) 3,500 mbar에서 분석물로 모세관을 20초간 채우고; (4) 50 mbar에서 10초간 지시기를 주입; (5) 400 mbar에서 분석 물질을 동원 및 측정하여 180초 동안 측정. 유체역학적 반지름은 추출한 최대 높이의 절반 지점에서 추출한 피크 폭과 해리 상수(K)를 사용하여 계산되었습니다_D) 는 1:1 결합 모델에 비선형 회귀 적합을 통해 결정되었습니다. (C) PGA가 RNP 안정성에 미치는 영향. 500 nM Cas9 뉴클레이스와 50 nM FAM 태그 sgRNA를 사용하여 PGA가 있는 것과 없는 Cas9–sgRNA 복합체의 테일러 분산 프로파일. PGA가 없을 때는 안정적인 복합체가 관찰되지 않았으며, 이는 시간이 지남에 따라 큰 집합체 형성이 증가하고 복합체에서 신호가 감소하는 것으로 나타났다(왼쪽). 0.0025 mg/mL PGA를 추가하면 R을 측정하는 최소한의 집합을 가진 명확한 단분산 테일러그램을 얻었습니다_h ~ 9.6 nm (R² = 0.999, 오른쪽). 복합체 안정성은 표준 전기천공 조건(500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA)에서 0.0025 mg/mL PGA가 있든 없든 평가하였다. 샘플은 미리 혼합되어 입구 샘플 트레이에서 4°C로 유지되었으며, 주입은 몇 시간에 걸쳐 10분 간격으로 이루어졌습니다. 실험은 다음과 같은 순서로 진행되었습니다: (1) 3,500 mbar에서 0.1% 인산으로 30초간 플러싱; (2) 3,500 mbar에서 30초 동안 분석 버퍼를 사용한 플러싱; (3) 3,500 mbar에서 분석물(분석 완충제)으로 모세관을 20초간 채우기; (4) 50 mbar에서 10초간 지시기를 주입; (5) 400 mbar에서 분석 물질을 동원 및 측정하여 180초 동안 측정. 불안정한 복합체 형성은 큰 집합체(테일러그램의 스파이크)와 신호 감소를 통해 나타났다. 안정 복합체는 잘 적합한 단분산 테일러그램(R)으로 확인되었다² > 0.99), 그리고 R_h 값은 적합 프로파일에서 추출되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. TCR 알파/베타 제거 효율과 1차 인간 T 세포의 생존 가능성. (A) 살아있는 싱글렛, CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포 소집합, 그리고 대조군(비표적 sgRNA) 및 실험적(TRAC sgRNA) 조건에서의 TCRα/β 발현에 대한 대표적인 유세포측 게이팅 전략. 세포는 TCRα/β 표면 발현 평가 전에 FSC/SSC, 싱글렛, 생존 가능성, CD4⁺ 또는 CD8⁺ 집단에 대해 순차적으로 게이트링되었습니다. (B) 왼쪽: TRAC KO, 비표적 제어(NTC), 오프카트리지 제어(OCC) 세 가지 조건에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-셀 하위 집합에서 TCRα/β 넉아웃 효율. CD4⁺: TRAC KO = 88.4 ± 4.9% (n = 40), NTC = 3.2 ± 4.7% (n = 24), OCC = 9.8 ± 5.1% (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89.8 ± 4.2% (n = 40), NTC = 4.2 ± 7.4% (n = 24), OCC = 20.2 ± 4.9% (n = 18). 오른쪽: 모든 조건에서 전기천공 후 생존 가능성, 싱글렛에 게이트됨. 유효성: TRAC KO = 97.1 ± 1% (n = 40), NTC = 96.8 ± 1% (n = 24), OCC = 97 ± 1% (n = 18). 개별 데이터 포인트는 평균과 SD로 표시되어 있습니다. n은 여러 카트리지와 일에 걸친 독립적인 전기천공 작업입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4. DMF 추출을 이용한 효율적인 mRNA를 HEK293T 구상체로 전달합니다 . (A) 구형 형성 및 구형 형질전환 과정을 설명하는 워크플로우 다이어그램. 특수 구형 마이크로플레이트에 100개의 HEK293T 세포를 적재하여 24시간 배양하여 직경 100 μm 구형 구체를 형성합니다. 구형(192)은 오프로드되어 100 μL 형질전환 버퍼에 재현탁됩니다. 이 서스펜션은 적절한 탑재량을 가지고 가이드 스포팅 DMF-ection 카트리지에 패밀리당 9.3 μL로 장전됩니다. 전기천공이 이루어지면, 시료는 96웰 플레이트로 하류 분석을 위해 오프로드됩니다. (B) 왼쪽: DMF 추출 카트리지에서 가족당 오프로드된 구형 수와 수동 피펫 분리 카트리지 제어와 비교. 중간: 삼각방울의 형광 이미지로, 더 큰 빨간 사각형이 삼방울을 윤곽 짓고, 빨간 타원이 구형체를 원형으로 감싼다. 오른쪽: 로딩 포트에 로딩된 구체(파란 원)를 보여주는 형광 이미지. (C) 왼쪽 패널: 전기천공 전 온전한 HEK293T 구체의 밝시야 이미지와 EGFP mRNA 전기천공 후 24시간 후 구상체의 형광 이미지, 0V 및 카트리지 외 대조군과 비교. (D) 상단 패널: 두 번의 전기천공 조건(500 V, 2 ms, 2 펄스; 375 V, 6 ms, 1 펄스)에서 구상 면적에 정규화된 평균 형광 강도의 정량화. 전기공공 조건 간 유의미한 차이는 없으나, 모든 전기공공 조건은 0 V 및 오프 카트리지 제어(500 V 2 ms 2 펄스: 6.955 × ^10-5 ± 3.502 × ^10-5, 375 V 6 ms 1 펄스: 5.045 × ^10-5 ± 3.294 × ^10-5, 0 V: 0 ± 0, 오프 카트리지 제어: 0 ± 0 (*p < 0.05)과 유사합니다. 이미지는 FIJI 이미지 처리 패키지¹⁰을 사용해 처리되었습니다. (500 V, 2 ms, 2 펄스: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 펄스: n = 4; 오프 카트리지 제어: n = 3; 0 V 제어: n = 3). (D) 하단 패널: 전기천공 후 5일간의 구체 직경. 직경은 역현미경으로 20배 배율로 촬영한 위상 협상 이미지를 FIJI로 측정했습니다. (500 V, 2 ms, 2 펄스: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 펄스: n = 4; 오프 카트리지 제어: n = 3; 0 V 제어: n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜은 나노리터 규모의 방울을 이용해 1차 인간 T 세포에 효율적인 세포 내 전달을 가능하게 하는 소형 디지털 마이크로유체 전기천공 워크플로우를 설명합니다. 이 방법의 핵심 장점은 반응당 10,000개의 세포만으로 CRISPR–Cas9 게놈 편집을 수행할 수 있어 기존 전기천공에 비해 재료 요구량을 크게 줄인다는 점입니다. 드롭렛 기반 아키텍처는 자동화를 지원하여 여러 병렬 사이트에서 시약 처리 및 반응 조립이 재현 가능하도록 보장합니다.

이전 연구들에서 DMF-ection 플랫폼을 널리 사용되는 시스템과 직접 벤치마킹한 결과, 기존 뉴클레오펙션은 1회 편집당 10,000 세포에서 2% 미만의 GFP 양성 T 세포를 생성하는 반면, DMF-ection 플랫폼은 동일한 저입력 조건에서 >90%의 형질전환 효율을 달성했습니다. 192가지 조건으로 배열된 스크린에 대해 DMF 플랫폼은 기존 방법⁹보다 셀 수가 25배 적고, 조건당 Cas9 수가 약 50배 적게 필요했습니다. 이 비교들은 저입력 및 스크리닝 응용에서 소형 DMF 전기천공의 재료적 이점을 강조합니다

중요한 단계와 문제 해결
성공을 위해서는 여러 단계가 매우 중요합니다. 음향 액체 핸들러의 정확한 보정은 가이드 RNA를 카트리지 기판에 정밀하게 침착시키며, 이는 일관된 RNP 조립에 필수적입니다. 스팟팅이 불규칙하거나 물방울이 기판에 잘 붙지 않는 경우, 가이드-RNA 혼합물에 PGA가 올바른 농도(최종 5 mg/mL)로 포함되어 있는지, 음향 디스펜서가 특정 소스 플레이트 형상에 맞게 보정되었는지 확인하세요. 중간 부피(40–120 nL)에서의 불일정한 반점은 주로 소수성 표면에서 물방울이 반동하여 발생합니다; PGA 농도를 약간 올리거나 디스펜스 높이를 줄이면 이 문제를 해결할 수 있습니다.

적재 전에 적절한 세포 농도를 유지하는 것이 중요한데, 밀도 편차는 방울 형성을 방해하고 편집 효율을 떨어뜨릴 수 있기 때문입니다. 편집 효율이 75% 이하로 떨어지면, 먼저 T세포 활성화가 충분한지 확인하고(전기천공 전에 유세포검사로 CD25와 CD69 상향 조절을 확인), Cas9와 sgRNA가 사전에 결합된 것이 아니라 로딩 직전에 결합되었음을 확인하세요.

폴리머 첨가제는 전기천^{공 완충} 조건에서 Cas9–sgRNA 복합체를 안정화하는 데 중요한 역할을 합니다. PGA는 명목상 결합 친화도를 감소시키지만, 그 안정화 효과는 재현성을 높이고 나노리터 부피에서의 응집을 방지합니다. 이는 다른 단백질-RNA 복합체에 맞게 워크플로우를 조정하는 연구자들을 위한 조정 가능한 매개변수를 의미합니다.

문제 해결
실패한 드롭렛 브리징
각 실험 후 기기 실행 후 QC 보고서를 검토하세요. 전류가 감지되지 않으면 브리징 실패를 의미하며, 이는 드롭 부족이나 퓨즈 실패로 인해 발생했으며, 시스템은 자동으로 이를 표시합니다. 영향을 받은 부위는 같은 실행 내에서 복구할 수 없습니다. 고장이 산발적이라면(<10%)는 별도의 조치가 필요하지 않습니다; 여러 카트리지에 복제를 분산시켜 영향을 최소화합니다. 고장이 체계적이라면 QC 보드와 시스템 건강 점검을 실행하고, 문제가 계속되면 기술 지원에 연락하세요.

불규칙한 sgRNA 스포팅
분사 후에는 예상되는 모든 비말이 전극 경계 내에 위치하고 위성 비말이 없는지 육안으로 확인합니다. 다중 분산을 방지하기 위해 가이드 RNA 혼합물에 PGA를 포함하세요. 누락된 방울은 디스펜서 작동 보고서를 확인하고 필요하면 다시 조제하세요. 반월판 형성이 좋지 않을 경우, 웰당 최소 5 μL를 유지하고, 플레이트를 잠시 회전시키며, 평평한 표면을 부드럽게 두드리세요. 얼음 작업을 하고 사용하지 않을 때는 판을 밀봉해 증발을 방지하세요.

편집 효율성 감소
편집 효율이 저하된 경우, 다음 순서로 문제를 해결하세요: (1) RNP를 진행하기 전에 EGFP mRNA를 이용한 전달 조건을 검증; (2) 측정된 QC 전류가 기대 값과 일치하는지 확인; (3) 적정 세포 밀도, 가이드 RNA, Cas9 농도; (4) 로딩 직전 높은 세포 생존율 확인; (5) 시약 무결성 및 저장 상태 확인; (6) 읽기 방법이 관심 있는 셀 밀도와 목표에 적합한지 확인한다.

플랫폼을 대체 셀 유형과 모델에 맞게 조정하기
NK 세포나 조절 T 세포와 같은 다른 1차 면역 세포 유형에서는 전기천공 매개변수 최적화가 필요합니다. 세포 크기는 막 투과에 필요한 전기장 임계치를 결정하는 중요한 요소입니다. 작은 세포는 더 높은 전기장 세기를 필요로 하는 반면, 큰 세포는 낮은 전압에서 투과되는 것으로 전기공공 생물물리학에서 잘 문서화된 관계입니다. 활성화된 CD3⁺ T 세포보다 작은 세포 유형의 출발점으로, 과도한 열 스트레스를 피하기 위해 펄스 지속 시간을 짧게(2–3 ms) 유지하면서 전압을 유지하거나 약간 증가시키는 것이 좋습니다(500–550 V). 더 큰 셀의 경우, 전압을 350–400V로 낮추고, 펄스 지속 시간을 10ms를 넘지 않도록 조절하세요. 또한, 기증자 수준에서의 미세 최적화는 전기천공에서 일반적인 관행이며, 건강한 기증자 세포에서 검증된 매개변수가 병든 물질이나 환자 유래 물질에 직접적으로 적용되지 않을 수 있습니다. 혈액학적 악성 종양, 만성 감염 또는 면역결핍을 가진 기증자의 세포는 종종 생물물리학적 특성 변화를 보이므로, 특히 건강하지 않거나 임상적이지 않은 샘플을 다룰 때는 각 신규 기증자마다 편집 효율성과 생존 가능성을 재평가해야 합니다. 세포 생존성은 전기천공 후 24시간과 72시간에 평가하고 매개변수를 반복적으로 조정해야 합니다. RNP 전달 효율이 감소할 경우 Cas9 용량은 T세포 프로토콜에 비해 1.5–2× 증가해야 할 수도 있습니다.

직경 200 μm를 초과하는 오가노이드와 같은 크거나 밀도가 높은 3D 모델의 경우, 카트리지 내 가스켓은 구조 크기와 확산 장벽 증가를 수용하기 위해 개조가 필요할 수 있습니다. 이러한 응용 분야를 시도하는 사용자는 시약 침투율을 높이기 위해 외부 셀 층을 사전 해리하거나 여러 펄스 조건을 연속적으로 적용하는 것을 고려해야 합니다. 여기서 검증된 100 μm 구형 직경을 넘어서는 구조에 대해 방울 기하학과 펄스 매개변수 적응에 관한 지침을 원하시면 교신저자에게 문의하십시오.

번역적 중요성
이 워크플로우의 번역 잠재력은 단순한 녹아웃을 넘어섭니다. 이 플랫폼은 1차 T 세포의 TRAC 유전자좌에서 4 kb GFP 구조체와 기능적 항HER2 CAR의 상동 지향 수리 노크인, 그리고 CD4⁺ T 세포 소진의 새로운 조절자를 식별하는 45개 표적 배열 CRISPR 스크리닝에 적용^{되었습니다.} 이러한 응용은 임상 관련 1차 세포 모델에서 프로토콜 수준 최적화에서 기능적 발견으로의 경로를 보여줍니다. 그럼에도 불구하고 중요한 한계점이 남아 있습니다: 시퀀싱에 의한 대립유전자 파괴율, 사이토카인 분비, 생체 내 부착과 같은 기능적 결과는 현재 프로토콜에서 평가되지 않았으며, 치료적 번역을 위한 필수적인 다음 단계로 간주됩니다. 또한, 플랫폼은 카트리지당 48개의 병렬 반응을 지원하지만, 더 큰 화면에서는 다중 카트리지 병렬화가 필요합니다.

한계
모든 소형 플랫폼과 마찬가지로, 몇 가지 실질적인 제약도 인정해야 합니다. 하위 표현형 분석은 작은 반응 규모에 맞게 조정되어야 하며; 유세포검사 획득은 충분한 이벤트 수를 달성하기 위해 추가 농도 단계나 복제 웰의 풀링이 필요할 수 있습니다. 플랫폼의 전기천공 설정은 전기장에 민감한 셀 유형에 대한 최적화가 필요할 수 있으므로, 사용자는 공개된 매개변수를 보편적으로 고정된 값이 아닌 출발점으로 간주해야 합니다. 마지막으로, 여기서 제시된 구형 워크플로우에서는 전기천공 후 연장된 시점에서의 형식적 생존 염색이 수행되지 않았다; 직경 기반 성장 추적은 구조적 완전성의 대체 측정 수단으로 사용되었으며, 향후 특성 분석에 중요한 방향을 제시합니다.

전반적으로 DMF-ection은 비바이러스 형질전환 방법으로, 저입력과 고처리량 환경에서 유전체 편집과 mRNA 전달에 강력하고 유연한 접근법을 제공합니다. 원차 T 세포, 구조화된 3D 모델, 자동 액체 처리와의 호환성은 세포 치료 공학, 다중 조건 CRISPR 스크리닝, 소형화된 기능 유전체학 분야에서 기회를 확대합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	기기
1x PBS	Gibco		흐름 버퍼
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	구형 세포 프로토콜
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	구형 세포 프로토콜
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		기기
DMEM Media	Gibco	10564011	미디어 보충-구형 세포 배양
DMF compatible buffer	DropGenie		형질주입
DropGenie Transfection System	DropGenie		기기
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		흐름 버퍼
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		기기
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	미디어 보충-구형 세포 배양
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		기기
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		구형 세포 프로토콜
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T 세포 미디어 보충
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		말초 혈액, 동결 보존, 팬 CD3+ 보조 T 세포, 부정적 선택
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T 세포 활성화 미디어
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T 세포 활성화 미디어
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		기기
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	기기
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3’
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	미디어 보충-구형 세포 배양
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	100mg/ml로 사용
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		소프트웨어
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	구형 세포 프로토콜
Surfactant F	DropGenie		형질주입- DMF 호환 버퍼 1:20에 혼합하여 형질주입 버퍼 완성
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3’
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	구형 세포 프로토콜