방법 논문

지방 기질 혈관 분율에서 반사광을 이용한 노화 검출

171 조회수

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DOI:

10.3791/70588

⸱

2026년 6월 5일

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 지방 조직에서 분리된 기질 혈관 분획에서 노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-β-gal) 활성을 객관적이고 단일 세포로 검출하기 위한 반사광 공초점 현미경을 제시합니다. 이 방법은 면역세포화학과 호환되며, 정량 평가를 위한 pH 조절을 포함하고, 기존의 SA-β-갤 염색보다 더 민감하고 주관적인 대안을 제공합니다.

초록

세포 노화는 영구적인 세포 주기 정지와 조직 기능에 영향을 미치고 노화 및 대사 질환에 기여하는 독특한 분비 프로필의 발달이 특징인 스트레스 유발 상태입니다. 노화 관련 β-갈락토시다제(SA-β-gal) 활성은 노화 세포의 표지자로 널리 사용되며; 그러나 기존의 SA-β-gal 검사는 주관적인 시각적 평가에 의존하며 제한된 정량적 정보를 제공합니다. 이러한 한계는 지방 조직에서 유래한 기질 혈관 분획(SVF)과 같은 1차 인간 세포 집단에서 특히 두드러지며, 여기에는 전지방세포, 면역 세포, 내피 세포가 혼합된 이질적인 혼합물이 포함되어 있습니다. 여기서는 인간 SVF 세포에서 SA-β-갤런 활도를 고해상도, 정량적으로 검출하기 위한 최적화된 반사광 공초점 현미경 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜은 SA-β-갤 활성의 객관적 단일 세포 분석을 가능하게 하며, 추가 노화 또는 계통 마커의 다중화 검출을 위한 동시 면역세포화학을 가능하게 하고, pH 일치 대조군을 통합합니다. 이러한 특징을 결합함으로써, 이 방법은 이질적인 인간 1차 세포 집단에서 세포 노화를 연구하는 민감하고 재현 가능하며 정량적인 접근법을 제공합니다. 이는 기존의 SA-β-갤런 염색보다 개선된 대안을 제공합니다.

서론

세포 노화는 DNA 손상, 텔로미어 소멸, 종양유전자 활성화 등 다양한 스트레스에서 발생할 수 있는 다면적인 반응입니다. 이는 항세포자멸사 단백질의 유도에 의해 부분적으로 촉진되는 세포 주기의 안정적인 정지와 함께 세포자사에 대한 저항성을 증가시킵니다. 노화는 조직 무결성 보존이 필수적인 상황, 예를 들어 수리 및 유지 관리와 같은 상황에서 세포 생존율 향상과 연관되어 있습니다 3,4. 노화는 조직 항상성 역할 외에도, 배아 패턴을 형성하여 정상 발달에 기여하며(5,6), 손상되거나 잠재적으로 악성 세포의 제거를 촉진하여 종양 형성을 막는 역할을 합니다(7,8,9). 노화가 유익한 기능을 할 수 있지만, 여러 연구에서 노화 세포가 염증성 분비 프로필을 획득하여 국소 대사를 방해하고 주변 조직을 손상시키며 심지어 종양 진행을 지원할 수 있다는 대조적인 측면이 강조되었습니다 10,11,12,13.

노화는 여러 조직의 다양한 세포 유형에서 검출되었으며, 노화, 질병, 조직 기능 장애 또는 암과 자주 연관되어 있습니다. 간에서는 간별 세포의 노화가 분비 인자를 통해 대사 항상성을 변화시켜 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다14,15. 간세포16 또는 전간 생검17을 조사한 연구들은 이들 세포의 노화가 대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환 및 기능장애 관련 지방간염과 같은 대사 동반 질환에 기여할 수 있음을 시사합니다. 더욱이, 제2형 당뇨병과 노화 간의 관계는 지난 10년간 큰 관심을 받고 있으며, 노화가 췌장 β세포, 간세포16, 지방세포 18, 19, 20, 21의 당뇨병 관련 합병증과 연관되어 있다는 증거가 있습니다. 이 발견들은 대사 조직 내 노화 세포를 정확히 식별하는 것의 중요성을 강조하며, 이들의 축적과 이질성이 질병 진행과 치료 표적에 기여하는 경우를 보여준다22.

노화와 관련된 신호 전달 및 단백질 발현 변화는 종종 세포 및 조직 특이적이며; 그러나 노년 세포의 여러 특징은 대체로 특징적입니다. 가장 널리 사용되는 표지 중 하나는 pH 6.0에서 β-갈락토시다제의 효소 활성 증가로, 노화 연관 β-갈락토시다제(SA-β-gal)23이라고 합니다23. β-갈락토시다아제는 모든 세포에 존재하는 리소좀 가수분해제로, 일반적으로 산성 pH(~4.5–5.0)에서 활성하며, 당화 기질의 분해에 기여합니다. SA-β-gal의 특징은 최적의 pH 조건이 낮은 상태에서도 β-갈락토시다제 활성이 유지된다는 점입니다. 고전적 분석법에서는 pH 6.0에서 합성 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(X-gal)와 함께 세포를 배양하며, 대부분의 세포에서는 효소 활성이 감소하지만 노화 세포에서는 감지 가능합니다. 이로 인해 현미경으로 관찰할 수 있는 불용성 청색 침전물이 형성됩니다24.

이 분석법은 널리 채택되었지만, X-갤 침전물의 검출은 전통적으로 밝은 필드 현미경에 의존해 왔습니다. 밝은 영역 검출은 청색 침전물의 시각적 식별에 의존하므로 저준위 신호와 초기 노화 상태에 대한 민감도는 제한적입니다. 반면, 반사광 영상은 X-갤 침전물의 광학 밀도를 포착하여 더 넓은 동적 범위에서 정량적 검출을 가능하게 합니다. 최근에는 감도를 높이기 위해 형광 생성 기판이 개발되었습니다. 그러나 이러한 접근법은 일반적으로 고전적인 pH 의존적 SA-β-갤 정의를 유지하지 않는 조건에서 β-갈락토시다제 활성을 측정합니다. 그 결과, 신호 강도는 증가할 수 있지만 노화에 대한 특이성을 감소시킬 수 있습니다. 반면, X-갤 침전물의 고유한 불투명성 덕분에 공초점 반사광 이미징을 통해 검출할 수 있어, SA-β-gal26의 원래 효소 정의를 유지하면서 더 민감하고 정량적인 판독을 제공합니다.

수년간 사이클린 의존성 키나제 억제제인 P16과 P21의 발현 증가와 세포주기 정지 및 기타 노화 프로그램을 조절하는 전사인자 P53의 발현 증가 등 노화의 추가 특징들이 확인되었습니다 (27,28,29,30,31,32,33). 이러한 발전은 노화의 보다 견고한 정의를 이끌었으며, 일반적으로 여러 마커의 결합된 존재를 기준으로 세포를 분류합니다. 그러나 실제로는 이러한 마커들이 서로 다른 방식으로 측정되는 경우가 많습니다. P16과 P21과 같은 핵 마커는 일반적으로 형광 기반 기법으로 검출되는 반면, SA-β-gal 활성은 전통적으로 밝시야 현미경으로 평가되어 왔습니다. 이러한 분리는 동일한 세포 내에서 여러 노화 특징을 평가하는 능력을 제한했습니다. 반사광 영상은 SA-β-갤 검출과 형광 기반 마커를 단일 영상 워크플로우 내에서 직접 통합할 수 있게 하여 이러한 한계를 극복하여, 이질적인 세포 집단에서 노화를 보다 견고하고 생물학적으로 의미 있는 평가를 가능하게 합니다.

Dedic와 동료들은 전통 SA-β-갤 영상의 감도 향상, 객관적 임계값 측정을 위한 pH 일치 대조군 사용, 면역세포화학과의 적합성 등 여러 한계를 다루고 있지만, 그들의 반사광 공초점 방법은 분리된 성숙 지방세포에 특별히 최적화되었다26. 그러나 지방 조직의 노화는 지방세포에만 국한되지 않으며, 기질 혈관 분획(SVF)을 통해 추가 정보를 얻을 수 있습니다. SVF는 전지방세포, 내피세포 및 섬유아세포 집단, 다양한 면역 세포로 구성되어 있으며, 이들 모두 노화를 겪으며 지방 재형성, 염증, 대사 신호 전달 변화에 기여할 수 있습니다. 따라서 이 이질적인 구획 내에서 노화를 특성화하는 것은 세포 유형 특이적 과정을 조직 수준 및 전신 결과와 연결하는 데 중요합니다.

여기서는 반사광 SA-β-갤런 검출을 SVF 세포로 확장하여 여러 지방 조직 세포 유형에 적용할 수 있게 합니다. 이 접근법과 면역세포화학을 결합함으로써, 1차 인간 샘플에서 SA-β-갤 활성과 계통 및 기능 마커를 통합하여 단일 세포 분석을 가능하게 합니다.

프로토콜

모든 실험은 헬싱키 선언 규정에 따라 수행되었다. 이 연구는 스톡홀름 지역 윤리 위원회(DNR 2012/50-31)에서 승인되었습니다.

1. 세포 준비

  1. 콜라겐제 소화를 통해 인간 지방 조직에서 분리한 기질 혈관 분획(SVF) 세포를 사용하세요.
    참고: 세포 수율은 생검 크기와 조직 구성에 따라 다릅니다; 하지만 지방 조직 10g당 약 1.0 ×10 6 SVF 세포가 일반적으로 얻어집니다.

2. X-갤 염색 및 슬라이드 준비

  1. 세포를 1mL 2% 파라포름알데히드(PFA)에 고정하고, 1.5mL 마이크로 원심분리관에 실온(RT)에서 20분간 고정합니다.
  2. 600 × g에서 10분간 원심분리기를 하고 상원액을 제거하세요.
  3. 제조사의 지침에 따라 노화 β-갈락토시다제 염색 키트를 사용해 X-gal 염색 용액을 준비하세요.
  4. 염색 용액을 3개의 튜브(각각 1mL)로 나누고, 1M HCl과 1M NaOH를 사용해 pH를 5, 6, 8으로 조절합니다. 보정된 pH 측정기를 사용해 pH를 측정하세요.
  5. X-갤런 용액을 0.5× 106 셀에 첨가하여 상태를 높이고,CO2 없이 37°C에서 24시간 배양합니다.
  6. 600 × g에서 10분간 원심분리한 후 상원액을 제거하세요.
  7. PBS(pH 7)로 세포를 세척하고, 600 × g에서 10분간 원심분리한 후 상원액을 제거합니다.
  8. 5% 정상 당나귀 혈청(NDS)에 1차 항체 용액(CD31 [1:200] 또는 IgG 대조제[1:333])을 준비합니다. 세포를 4°C에서 하룻밤 배큐합니다.
  9. 세척 셀을 3회 PBST(0.1%)에 10분간 RT 시술로 흔들어 놓습니다.
  10. 2차 항체 용액(항생쥐 알렉사 플루어 555 [1:500])과 밀 생아 응집체(WGA [1:200])를 5% NDS에 준비합니다. RT에서 1시간 동안 안경 위에 올려 부양하세요.
  11. 600 × g에서 원심분리기를 10분간 하고 2차 항체 염색액을 제거하세요.
  12. RT에서 10분간 PBST(0.1%)로 셀을 3번 세척하세요.
  13. 600 × g에서 10분간 원심분리기를 하고 상원액을 제거하세요.
  14. 안티페이드 마운트에 세포를 재현탁하세요.
  15. 세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫으로 옮기세요.
  16. 마운팅 배지를 RT에서 하룻밤 경화시켜 세포를 고정시키세요.
  17. 100% 글리세롤 100 μL을 넣고, 커버 슬립을 위에 올려놓은 뒤 매니큐어로 밀봉하세요.

3. 현미경

참고: 반사광 검출용으로 구성된 공초점 현미경을 사용한 영상 세포. 반사광 신호는 제조사에서 제공한 빔 스플리터나 이색성 거울 구성을 사용하여 여기 파장 근처에서 수집해야 합니다. 모든 실험에는 실리콘 오일(수치 구경 1.05)을 넣은 30× 대물렌즈를 사용하세요.

  1. 현미경 소프트웨어 내에서 T90/R10 빔 스플리터 설정을 선택하세요.
  2. 633nm 여기를 사용해 635–645nm 반사광을 수집합니다.
  3. 405 nm 여기를 이용해 호에스트(Hoechst) 신호를 획득하세요.
  4. 488 nm 여기를 이용해 WGA 신호를 획득하세요.
  5. 555 nm 여기를 이용해 CD31 신호를 획득하세요.
  6. Z 스텝 크기를 시스템 최적(0.74 μm)으로 설정하고, 막 신호를 기반으로 Z 스택을 정의하여 전체 세포 부피를 포착합니다.
  7. 모든 샘플에 대해 동일한 획득 설정을 사용하여 이미지를 획득하세요. 압축 없이 네이티브 현미경 형식(예: .oir)으로 파일을 저장하세요.

4. 이미지 분석

참고: ImageJ와 CellProfiler를 사용하여 이미지를 분석하세요.

  1. ImageJ에서 채널을 분할하여 각 채널(405, 488, 555, 633)에 대해 Z-스택을 생성합니다.
  2. Z 프로젝트 함수를 사용해 합산 강도 투영을 생성하고 16비트 TIFF 파일로 내보내세요.
  3. 자동 세포 분할과 세포별 반사광 세기 정량화를 위해 CellProfiler(버전 4.2.8)에 이미지를 가져오세요(보조 그림 1 및 보조 그림 2).
  4. 강도 측정값을 스프레드시트로 내보내 후속 분석을 수행합니다.

5. SA-β-gal 점수 부여

  1. SA-β-gal 양성의 임계값을 pH 8 조건의 평균 반사광 세기에 3 표준편차를 더한 값으로 정의합니다.
  2. pH 6 조건에서 이 임계값보다 강한 세포를 SA-β-갤런 양성으로 분류합니다.

결과

인간 SVF 세포에 대한 반사광 SA-β-갤 염색은 세 가지 pH 제어 조건에서 명확하고 재현 가능한 패턴을 만들어냈습니다. CD31 염색을 포함하여 SVF 내 내피 세포를 식별하여 이 세포들을 다른 집단과 구별할 수 있게 했습니다. CD31 양성 세포는 소수에 불과했지만, 이 마커는 내피세포의 존재를 확인했고, 이 방법이 이질적인 1차 샘플과의 적합성을 입증했습니다.

pH 5 조건은 대부분의 세포에서 강한 신호를 생성했으며, 이는 산성 pH에서 높은 내인성 베타 갈락토시다아제의 활성과 일치합니다(그림 1Aa–Ac). pH 6에서는 SA-β-gal 활성을 평가하는 조건에서 염색 강도가 pH 5에 비해 감소했으며, 배경 신호보다 신호를 보인 세포의 일부만이 나타났습니다(그림 1Ba–Bc). 이러한 신호 강도와 주파수 변화는 분석의 예상되는 pH 의존성과 일치하며, 최적이 아닌 조건에서 SA-β-갈락토시다제 활성 보유 세포를 식별할 수 있게 합니다. pH 8 조건에서는 반사광 신호가 거의 없었으며, 대부분의 세포는 배경 수준 근처나 수준에 위치했습니다(그림 1Ca–Cc). 이 조건은 그림 1A의 빨간 점선으로 표시된 SA-β-갤런 양성의 임계값을 정의하는 데 사용되었습니다.

정량적 분석을 위해 SA-β-갤런 활성 기준은 pH 8 조건의 평균 반사광 세기와 3표준편차를 더한 값으로 정의되었습니다. pH 6 조건에서 강도 값이 이 임계치를 초과하는 세포는 SA-β-갤런 양성으로 분류되었습니다. 이 접근법은 배경 신호를 고려하고 거짓 양성 분류를 최소화하는 객관적이고 데이터 기반의 컷오프를 제공합니다.

검출 민감도와 면역세포화학과의 적합성을 평가하기 위해, 반사광과 밝은 필드 영상을 모든 pH 조건에서 비교하였다. pH 5(그림 2Aa–Ad)에서는 반사광으로 강한 X-갤런 침전물이 나타났고, 밝은 영역에서는 가장 두드러진 퇴적물만 감지되었습니다. pH 6(그림 2Ba–Bd)에서는 반사광이 밝은 영역에서 신뢰성 있게 검출되지 않는 SA-β-갤런 양성 세포를 식별했으며, 밝은 영역에서는 신호가 약하거나 확산되어 보였습니다. pH 8(그림 2Ca–Cd)에서는 반사광이 최소한의 신호를 감지하여 낮은 효소 활성과 일치하는 반면, 밝은 영역에서는 검출 가능한 침전물이 나타나지 않았습니다. 이 관측은 반사광 영상이 특히 중간 및 저활도 수준에서 X-갤 침전물 검출을 개선한다는 것을 시사합니다.

반사광 SA-β갤 분석도 96웰 플레이트에서 수행되었습니다(보완 그림 3). 이 구조는 플라스틱 표면에서 반사되어 배경 신호가 증가하여 양극과 음극 셀 간의 대비를 감소시켰습니다. 긁힘과 같은 표면 결함은 배경 반사를 더욱 증가시킵니다(보충 그림 3, 검은 화살표). 그 결과, 정량적 분석은 유리 커버슬립 영상에 비해 신뢰성이 떨어졌습니다. 플레이트 포맷이 필요한 경우, 최적의 신호 검출을 위해 유리 바닥판을 권장합니다.

이 결과들은 강하게 양성된 pH 5 조건, pH 6에서의 중간 신호, 그리고 pH 8에서의 최소 배경 상태 사이에 명확한 구분이 있음을 보여준다. 이 패턴은 분석의 예상 동작과 일치하며, 이질적인 1차 세포 집단에서 SA-β-gal 활성을 검출하기 위한 반사광 영상 사용을 뒷받침합니다.

figure-results-1
그림 1: SVF 셀에서 pH 의존성 반사광 SA-β-갤런 검출.
WGA(Aa, Ba, Ca)와 반사광 영상(Ab, Bb, Cb)은 pH 5, 6, 8 조건에서 X-갤 침전물을 감지합니다. 신호는 pH 5에서 가장 강하고, pH 6에서는 감소하며, pH 8에서는 최소한입니다. 반사광 강도(Ac, Bc, Cc)의 정량화는 각 조건에서 β-갈락토시다아제 활성의 분포를 보여줍니다. 각 점은 단일 세포를 나타내며, 빨간 점선은 SA-β-gal 양성 세포를 분류하는 임계값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: SVF 셀에서 반사광과 밝은 필드 SA-β-갤런 검출 비교. pH 5, 6, 8에서 X-gal 염색된 SVF 세포의 확대 이미지에서는 WGA 염색(Aa, Ba, Ca), CD31 염색(Ab, Bb, Cb)으로 내피 세포 식별, 반사광 영상(Ac, Bc, Cc)으로 X-gal 침전물을 검출하고, 이에 대응하는 밝은 시야 이미지(Ad, Bd, Cd)가 나타납니다. 반사광 영상은 여러 조건에서 X-갤런 침전물을 감지하는 반면, 밝은 영역은 주로 고강도 퇴적물을 드러내며 낮은 신호 수준에서는 제한적인 탐지를 제공합니다. CD31 염색은 pH 5와 pH 6 조건 모두에서 관찰되어 내피 세포를 식별할 수 있게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: CellProfiler 파이프라인 개요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 핵 및 세포 분할 워크플로우. (A) 호에스트 염색된 핵과 (B) 해당 핵 분할의 대표 이미지. (C) 막 염색을 기반으로 한 세포 분절. (D) 핵과 세포 경계의 겹침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 3: 플라스틱 바닥 96웰 플레이트에서의 반사광 SA-β-갤런 영상. (A) 표준 플라스틱 바닥 96웰 플레이트에서 X-갤 염색된 SVF 셀의 WGA 염색 및 (B) 반사광 영상. 유리 표면의 이미징에 비해 배경 신호가 증가하는 것이 관찰되며, 이는 플라스틱 표면에서 빛이 반사되어 SA-β-갤 검출의 대비를 감소시킵니다. 표면 긁힘(검은 화살표)은 배경 신호(B)를 더욱 증폭시킵니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

노화 관련 β-갈락토시다제는 노화 세포를 식별하는 데 가장 널리 사용되는 표지 중 하나입니다; 하지만 전통적인 밝은 영역 검출 방법은 낮은 감도와 높은 주관성으로 인해 제한을 받습니다. X-갤로 염색된 SVF 세포의 반사광 이미징은 단일 세포 수준에서 SA-β-갤런 활성을 측정하는 보다 민감하고 재현 가능한 접근법을 제공하며, 형광 항체 염색과도 호환됩니다. 이 방법을 SVF에 최적화함으로써 SA-β-gal 활성을 CD31과 같은 세포 특이적 마커와 함께 검출할 수 있어, 세포 분류 없이도 이질적인 1차 세포 집단을 분석할 수 있습니다.

신뢰할 수 있는 구현을 위해서는 여러 기술적 매개변수가 매우 중요합니다. X-갤 염색 용액의 정확한 pH 보정은 매우 중요하며, 작은 편차가 효소 활성을 변화시키고 신호 검출에 영향을 줄 수 있습니다. pH 미터는 표준 버퍼(예: pH 4.0, pH 7.0)와 함께 사용하기 직전에 교정해야 하며, 염색액의 pH는 준비 후 검증되어야 합니다. 또한, Z-스택 획득은 전체 셀 부피를 포착해야 하는데, 불완전한 커버리지는 반사광 세기를 과소평가하게 만듭니다. 레이저 출력과 검출기 이득을 포함한 영상 파라미터는 포화 없이 신호를 최대화하고 샘플 전반에 걸쳐 일관성을 유지하도록 최적화되어야 합니다.

대체 노화 분석과 비교할 때, 반사광 영상은 여러 가지 장점을 제공합니다. 밝은 필드 SA-β-갤 검출은 침전물의 시각적 식별에 의존하므로 감도가 제한적이며 다중화 분석과 쉽게 호환되지 않습니다. 반면, 반사광 영상은 X-갤런 침전물의 광학 밀도를 검출하면서도 pH 의존적 효법적 정의인 SA-β-갤런을 유지합니다. 이를 통해 SA-β-gal 활성과 형광 기반 마커를 동시에 검출할 수 있어, 개별 세포 내 여러 특징을 이용해 노화를 평가할 수 있습니다.

이러한 장점에도 불구하고, 이 방법에는 한계가 있습니다. 반사광 영상은 X-갤 침전물의 광학 밀도를 감지하지만, 이 신호를 다른 고밀도 세포 내 구조와 명확히 구별할 수 없으므로 pH 조절 조건이 필수적입니다. pH 8 조건은 배경 반사광의 기준선을 제공하며, 특정 신호와 비특이적 신호 구분을 지원합니다. 또한 적절한 반사광 검출 기능을 갖춘 공초점 현미경이 필요하며, 모든 시스템에서 이를 제공하지는 않을 수 있습니다. 또한 영상 표면의 특성도 신호 품질에 영향을 줄 수 있습니다: 플라스틱 바닥판은 반사로 인해 배경이 증가하고 대비를 감소시키는 반면, 유리 표면은 더 신뢰할 수 있는 검출을 제공합니다.

이 방법은 성숙한 지방세포에서 SA-β-gal 검출을 위한 반사광 영상을 확립한 Dedic 등의 연구를 기반으로 하며, 더 넓은세포 유형으로 접근법을 확장합니다. 갓 분리된 SVF에 적용한 결과, X-갤런 침전물의 반사광 검출이 다양한 인간 세포 집단과 호환된다는 것이 입증되었습니다. SA-β-gal 검출과 CD31과 같은 계통 마커를 결합하는 능력은 이질적인 조직 내에서 정의된 하위 집단의 분석을 더욱 가능하게 합니다.

1차 인간 샘플에서 기증자 간 변동성이 예상되지만, 본 연구의 목적은 생물학적 변이를 특성화하는 것이 아니라 방법의 기술적 구현을 확립하는 데 있습니다. 향후 여러 생물학적 샘플이나 실험 조건에 걸친 적용에는 적절한 통계 분석이 포함되어야 합니다. 또한, 확립된 노화 유도 모델에서의 검증과 직교 노화 마커와의 통합은 복잡한 세포 집단에서 SA-β-gal 활성의 해석을 더욱 정교하게 할 것입니다.

공개 사항

저자들은 이해 충돌이 없음을 선언한다.

감사의 글

인간 조직 생검 접근을 제공해 준 Liv Eidsmo와 Keira Melican, 샘플 처리를 도와준 Lena Appelsved에게 감사드립니다. 이 연구는 스웨덴 연구 위원회(2022-01236), 카롤린스카 연구소 당뇨병 전략 연구 프로그램(C5471162), 노보 노르디스크 재단(C5475033), 발레 재단 학자상(C5471234), 마크 재단 애스파레 보조금(C5477023), 스웨덴 암 학회(22 2420), 카롤린스카 연구소 줄기세포 및 재생 전략 연구 프로그램(C5472022), 크누트 및 앨리스 발렌베리 재단(2020.0118; 2023.0536)으로부터 KLS에 대한 지원금을 받았습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 튜브BioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mL 튜브Eppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96웰 플레이트Corning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 일차 항체AbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
반사광 기능이 있는 공초점 현미경EvidentFV-4000
커버슬립EprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
고정 버퍼Sigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
인큐베이터StuartS130HHybridization oven/shaker
현미경 슬라이드Avantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
마운팅 미디어InvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype 대조R&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
정상 당나귀 혈청Jackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH 미터MeterLabR21M002 PHM210 표준 pH 미터 
피펫 팁 (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL 필터링된 피펫 팁
피펫 팁 (200 µL)Corning4823200µL 필터링된 피펫 팁
SABG 키트Cell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
2차 항체, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
워터 배스Rowe ScientificSWB20D표준 워터 배스
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm
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참고문헌

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