곡물에서 식물-미생물 상호작용 연구를 위한 식물 그노토바이오틱 성장 시스템 조립 및 활용

요약

이 프로토콜은 곡물을 수용하도록 설계된 새로운 식물 그노토바이오틱 성장 시스템의 조립 및 사용을 설명하며, 밀과 옥수수에서 검증되었습니다. 이 식물 그노토바이오틱 시스템은 멸균 성장 조건, 관개 관리, 다양한 토양 기반 기질과의 호환성을 제공함으로써 통제된 식물-미생물 실험을 가능하게 합니다.

초록

현장에서 일관되게 작동하는 미생물 기반 농업 개성제를 개발하려면 식물-미생물 상호작용의 분자 메커니즘에 대한 이해가 필요합니다. 이러한 근본 상호작용 메커니즘을 연구하려면 환경적으로 제어되고 그노토바이오틱 조건(즉, 식물과 상호작용하는 모든 미생물이 알려져 있으며, 세균 없는 미생물 군집, 또는 자연 군집 등)에서 식물을 재배할 수 있는 능력이 필요합니다. 현재 이용 가능한 식물 그노토바이오틱 시스템은 곡물과 같은 농업적 관련 대형 식물 연구에는 적합하지 않습니다. 게다가 대부분의 시스템은 관개 관리 능력이 부족합니다. 여기서는 관개 관리 능력을 가진 곡물 식물을 수용하기 위해 설계된 새로운 그노토바이오틱 시스템인 GNOVA를 소개합니다. 이 새로운 시스템은 3D 프린팅된 베이스와 상업적으로 이용 가능한 재료로 구성된 접근성 높은 플랫폼입니다. 이 프로토콜은 시스템 조립과 실험 설치 단계별 안내를 제공합니다. 더 나아가, GNOVA와 그노토바이오틱 백 시스템의 성능 비교도 제시합니다. GNOVA는 봉지 시스템에서 식물 성장 기간을 2주에서 밀은 17주, 옥수수는 4주로 연장했습니다. GNOVA 내에서 두 작물의 발아율도 밀은 66%에서 100%, 옥수수는 75%에서 100%로 증가했습니다. GNOVA 내에서 재배된 밀은 경운기를 발달시켰는데, 이는 봉지 시스템 내 같은 나이의 식물에는 없었습니다. GNOVA에서 재배된 옥수수의 신선한 무게는 백 시스템보다 594% 높았습니다. 또한, GNOVA 시스템 내에서 옥수수의 줄기 높이와 뿌리 길이는 각각 백지 내 옥수수보다 89%, 57% 더 높았습니다. GNOVA 시스템은 과학자들이 묘목 단계를 넘어 식물-미생물 상호작용을 탐구할 수 있는 도구 상자를 확장하여 성장 공간 확대와 관개 관리를 제공합니다.

서론

미생물 기반 농업 처리는 식물 성장과 환경 스트레스에 대한 회복력을 향상시켜 작물 생산성을 향상시킬 잠재력 때문에 지난 수십 년간 큰 관심을 받았습니다. 동시에, 이러한 생물자극제의 분자 작용 기전은 아직 잘 이해되지 않아 토양, 장소, 환경 조건 전반에 걸쳐 결과가 일관되지 않는 데 기여할 수 있습니다 ^1,2. 기존 미생물 기반 치료의 효능 향상과 신기술 개발을 위해서는 식물-미생물 상호작용의 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 이해가 필요합니다. ^3,4. 그러나 자연 미생물 군집의 복잡성 때문에 이러한 메커니즘을 해부하는 것은 여전히 어렵습니다. ^5,6. 식물의 이점을 이끄는 미생물 효과자와 상호작용을 규명하기 위해, 환경 조건과 미생물 군집을 제어할 수 있는 합성 미생물 군집(SynComs)을 성장 시스템 내에 활용하여 자연 시스템의 복잡성을 줄일 수 있습니다. 정의된 미생물 군집과 관련된 숙주를 연구하는 Gnotobiology(⁷)는 연구자들이 무균 숙주와 알려진 미생물 군집에 정착된 숙주를 비교하여 미생물 기능과 식물 표현형⁸을 연결할 수 있게 합니다.

초기 그노토바이오틱 시스템은 유리 시험관^{9, 10, 11, 12}와^{병 13}을 사용해 제작되었습니다. 그 이후로 식물을 비토바이오틱적으로 연구하기 위한 새로운 시스템이 빠르게 개발되었습니다. 오늘날 가장 널리 사용되는 시스템으로는 페트리 접시¹⁴, 시험관^{15, 16}, 유리병¹⁷, 마젠타 박스¹⁸, 밀봉 백¹⁹, 수경재배²⁰, 플로우팟과 그노토팟²¹, 마이크로플루이딕스 시스템²², 에코FAB²³ 등이 있습니다. 이러한 진전에도 불구하고, 대부분의 시스템은 영상²² 또는 출출물^{수집 17,20}에 최적화되어 있거나, 소형 모델 종 14,18,21에 맞게 설계되어 있습니다. 많은 곳이 관개 제어와 실험 시간을 제한하는 폐쇄 시스템입니다. 이러한 제약은 곡물과 같이 추가 공간, 공기 흐름, 수분 관리가 필요한 대형 농작물 연구에 도전 과제를 제기합니다.

더 큰 식물과 장기 연구를 수용할 수 있는 시스템의 필요성을 인식하여, EcoFAB 3.0이 최근 개발되어 그노토바이오틱 재배를 더 큰 식물로 확장했습니다²⁴. EcoFAB 3.0은 더 큰 뿌리와 헤드스페이스 부피를 제공하여 수수 바이컬러 의 최대 4주간 성장을 지원하고, 삼출물 수집과 뿌^{리 영상 촬영}을 가능하게 합니다. 이 새로운 시스템은 농작물에 그노토바이오틱 시스템을 확장하는 유망한 사례이지만, 실험실 전반에 걸쳐 쉽게 채택되고 다양한 실험 워크플로우와 호환되는 접근성 높고 다재다능한 플랫폼이 여전히 필요합니다. 이러한 이유로 우리는 GNOVA(다목적 식물 응용을 위한 GNotobiotic 시스템)를 개발했는데, 이는 그노토바이오틱 조건 하에서 곡물 작물을 수용할 수 있도록 설계된 시스템입니다. 여기서는 GNOVA를 조립하고 운영하는 상세한 프로토콜을 제공하며, 우리 실험실에서 일상적으로 사용되는 Gnotobiotic 백 시스템과 비교했을 때 그 성능을 시연합니다. 이 새로운 시스템 개발을 통해 이전의 폐쇄 시스템에 비해 더 넓은 재배 공간과 내장 관개를 제공하여 밀과 옥수수를 무균 환경에서 재배할 수 있는 능력을 향상시켰습니다. GNOVA의 성능은 EcoFAB 3.0과 비슷하여, 비모델 곡물 작물에서 식물-마이크로바이옴 상호작용을 분석하는 도구의 범위를 확장합니다. 더불어, GNOVA의 단순한 설계, 상업적으로 이용 가능한 재료 사용, 그리고 연구자들이 연구와 예산 요구를 조정하기 위해 재료와 설계를 변경할 수 있도록 하는 3D 객체 파일 덕분에 식물 그노토바이오틱스의 다재다능함과 적응성이 향상됩니다.

프로토콜

참고: 기지용 3D 프린팅 파일은 보조 자료에서 찾을 수 있으며, Dryad(https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc)에서 공개되어 있습니다. 속도와 비용 효율성을 위해 지역 상업용 3D 프린팅 서비스 제공업체에서 대량 인쇄를 권장합니다.

1. 근로생물계의 조립

1. 포트 조립을 시작하세요(반복 실험 사용 전에 한 번 수행).
   1. 스테인리스 스틸 와이어 메시 원을 폴리카보네이트 튜브 한쪽 끝에 올려놓고 호스 클램프로 원을 고정하여 냄비 바닥을 닫습니다(그림 1A).
   2. 폴리카보네이트 튜브의 개방 끝 상단에서 1.5cm 떨어진 곳에 1/4인치(6.35mm) 간격의 관개 개구부를 뚫어 관개구를 뚫으세요. 첫 번째 구멍에서 3cm 떨어진 곳에 1/8인치(3.18mm) 슬롯 두 개를 드릴링하는데, 하나는 가장자리에서 1cm, 다른 하나는 상단 슬롯에서 2cm 떨어져 있습니다.
      참고: 필요하다면 같은 과정을 따라 화분 상단 가장자리에 추가 튜브 라인을 추가할 수 있습니다.
   3. 관개 튜브는 1/4인치 구멍을 통해 짧은 실리콘 튜브 구간을 삽입하여 설치하세요.
   4. 케이블 타이를 두 개의 1/8인치 슬롯에 꿰어 튜브를 고정합니다(그림 1B). 1번 피팅의 수컷 루어를 포트 밖으로 뻗은 실리콘 튜브에 삽입합니다(그림 1C).
      참고: 피팅 1의 호스 바브는 노출되어 있어야 합니다.
   5. 빈 주사기 통에 유리솜을 채우고 끝부분을 알루미늄 호일 조각으로 막아 준비하세요(그림 1C).
   6. 주사기 배럴의 루어 락 끝에 짧은 실리콘 튜브를 연결하세요(그림 1C).
   7. 똑같은 주사기 통 두 개를 준비하세요. 준비된 주사기 배럴 중 하나를 포트 밖으로 뻗은 튜브에 있는 피팅 1의 노출된 호스 바브에 연결하세요(그림 1D).
   8. 일시정지: 조립된 도전자기는 나중에 실험용으로 보관할 수 있습니다.

그림 1: 포트 조립체. A) 와이어 메시와 호스 클램프로 막힌 포트 바닥. (B) 화분 상단 가장자리의 관개구. (C) 관개관은 준비된 주사기 통이 있는 피팅 1의 노출된 호스 바브로 끝납니다. (D) 닫힌 관개관이 있는 조립된 화분. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

2. 실험을 위한 화분 준비 (새로운 실험 전에 수행)
   1. 화분 바닥에 유리섬유 파이프 랩 두 개의 미리 잘린 원을 깔아주세요(그림 2A).
   2. 토양 기질은 점토 2부분과 모래 1부분을 섞어 준비하세요. 화분에 840mL의 기질을 넣으세요.
   3. 화분을 플라스틱 캡으로 덮고 테이프로 고정하세요(그림 2B).
   4. 오토클레이브로 121°C의 드라이 사이클에서 30분간 냄비를 채웠습니다. 화분에 플라스틱 캡을 씌워 하룻밤 식히세요. 121°C에서 드라이 사이클에서 30분간 다시 오토클레이브합니다. 완전히 식히세요. 화분은 플라스틱 뚜껑으로 덮어두세요.
      참고: 다른 토양 기질도 사용할 수 있으나, 화분당 필요한 양은 사전에 최적화해야 합니다. GNOVA는 100% 점토 800mL와 100% 모래 1리터로도 테스트되었습니다. 다른 토양 기질은 완전한 멸균을 위해 더 많은 오토클레이브 사이클이나 다른 설정이 필요할 수 있습니다.
      주의: 오토클레이브에서 냄비를 제거할 때는 재료가 뜨거워져 호스 클램프가 느슨해질 수 있으므로 주의해야 합니다. 식힌 후에는 호스 클램프가 손가락으로 꽉 조여지도록 하세요.
   5. 냉각된 포트를 3D 프린팅된 베이스에 삽입하세요. 흙이 채워진 화분을 3D 프린팅된 받침대 안에 넣으세요. 포트를 받침대를 잡으세요, 가장 약한 부분인 개구 기둥을 잡지 마세요.
   6. 관개 튜브를 3D 프린팅 받침대의 하단 구멍 중 하나를 통과시킵니다(그림 2C).
      참고: 3D 프린팅 지지 받침대를 오토클레이브하지 마세요. 이 경우 부품이 녹을 수 있습니다. 60 °C 이상의 온도가 필요한 실험은 대체 내열 필라멘트가 필요할 수 있습니다( 재료표 참조).
   7. 오토클레이빙 후에는 냄비를 실온에 보관하고, 최종 실험 설정 전까지 플라스틱 캡이나 준비된 주사기를 제거하지 마세요.

그림 2: 준비된 화분 삽화. (A) 유리섬유 파이프 랩으로 안감한 화분 바닥. (B) 냄비 뚜껑을 플라스틱 뚜껑으로 닫아. (C) 최종 3D 프린팅 베이스 디자인 안에 빈 냄비가 들어간 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 유리 실린더 준비 (각 새로운 실험 전에 수행)
   1. 유리 실린더 한쪽 끝을 미리 잘라진 DW4 필터로 덮고 비닐 테이프로 고정하세요(그림 3A).
   2. 유리 실린더를 반대쪽 열린 끝을 향하게 돌려 튜브 안에 면 링을 14cm 떨어진 곳에 끼우세요. 면 링은 수술용 테이프로 고정하세요(그림 3B).
   3. 실린더 하단을 두 개의 고무줄로 멸균 랩으로 닫으세요(그림 3B).
   4. 준비된 유리 실린더를 121°C에서 30분간 건조 사이클에 오토클레이브하여 사용 전에 보관합니다. 오토클레이션 후에는 무균 유리 실린더를 랩을 떼지 않고 필요할 때까지 실온에 보관하세요.

그림 3: 유리 실린더 조립체. (A) DW4 필터 매체와 비닐 테이프로 닫힌 유리 실린더 상단. (B) 유리 실린더의 하단 끝에 면 고리가 부착되고 멸균 랩과 고무줄로 닫힌 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 관개 필터 준비 (1.4.4–1.4.6 단계는 한 번만 수행해야 하며, 각 급수 이벤트 전에 수행)
   1. PES 필터 멤브레인(그림 4A.4)을 필터 홀더(그림 4A.5)와 필터 디스크(그림 4A.3) 사이에 배치하여 필터 홀더를 조립합니다.
   2. 필터 막의 매끄러운 면을 유출 방향으로 향하게 하여 필터 홀더 상단을 향하도록 하세요(그림 4A.1).
   3. O-링(그림 4A.2)을 필터 홀더 상단(그림 4A.1)에 끼웁니다. 필터 상단을 필터 홀더에 부착하세요. 손으로 조여 주세요.
   4. 커넥터를 부착하세요. 필터 홀더 상단 포트에 피팅 2의 수컷 슬립을 삽입하세요.
   5. 필터의 호스 바브 끝에 짧은 실리콘 튜브 조각을 연결하세요(그림 4B). 1.1.6 단계(그림 4B)에서 준비된 다른 주사기 배럴 끝에 피팅 1의 수컷 루어를 삽입합니다.
   6. 필터를 준비된 주사기 배럴의 호스 바브 피팅에 연결하세요.
   7. 조립된 필터를 121°C에서 30분간 건조 사이클로 오토클레이브합니다. 필터가 식으면 사용 전에 꼭 조여주세요.
      참고: 필요한 모든 필터를 준비하여 닫힌 폴리프로필렌 상자에 오토클레이브하는 것이 권장됩니다. 오토클레이션된 후, 준비된 주사기를 제거하지 않는 한 관개 필터는 사용 전까지 실온에서 멸균 상태로 유지할 수 있습니다.

그림 4: 필터 홀더 조립체. (A) 분해된 필터 홀더 부품: 1. 필터 홀더 상단, 2. O-링, 3. 필터 디스크, 4. 필터 멤브레인, 5. 필터 홀더. (B) 조립된 필터 홀더와 그에 상응하는 준비된 주사기 배럴. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 실험 설정

1. 실험 시작 최소 하루 전에 용액과 재료를 준비하고 멸균하세요.
   1. 제조사의 지침에 따라 0.5X 무라시게와 스쿠그 식물 성장 배지를 준비하세요. 오토클레이브 매체를 액체 사이클로 121°C에서 30분간 사용하세요.
   2. 분해한 병뚜껑 디스펜서를 121°C에서 30분간 건조 사이클에 오토클레이브하세요. 121 °C에서 액체 사이클로 1L 오토클레이브를 30분간 가열합니다.
   3. 오토클레이브 유리 페트리 접시, 500mL 비커, 차 체, 핀셋을 121°C에서 하루 30분간 드라이 사이클로 준비하세요.
      참고: 별도의 언급이 없는 한, 다음 단계는 층류 후드에서 무균 기법을 사용하여 수행해야 합니다.
2. 씨앗은 표면에서 멸균하세요.
   참고: 표면 씨앗 멸균 프로토콜은 사용할 식물 종에 따라 다릅니다. 이 그노토바이오틱 시스템은 다음과 같은 씨앗 불임 프로토콜을 사용하여 밀과 옥수수 모두에서 시험되었습니다.
   주의: 표백제와 차아염소산나트륨을 다룰 때는 실험실 가운, 장갑, 보호 안경을 착용하세요. 이 화학물질들은 피부와 눈에 자극을 주거나 부식시킬 수 있습니다. 에탄올은 가연성입니다; 가까운 열화(open flame)는 사용하지 마세요.
   1. 밀 씨앗 불임²⁵
      1. 비커 2개에 95% v/v 에탄올 150mL, 비커 1개에 희석되지 않은 가정용 표백제 150mL, 비커 2개에 150mL 물을 채우세요.
      2. 밀씨앗을 차 체에 넣으세요. 씨앗이 든 차 체를 95% v/v 에탄올이 섞인 비커에 담아 1분간 부드럽게 저어줍니다.
      3. 씨앗을 새 차 체로 옮기세요. 씨앗이 표백제에 담긴 차 체를 10분간 부드럽게 저어줍니다.
      4. 씨앗을 새 차 체로 옮기세요. 다른 비커에 씨앗이 든 차 체를 95% v/v 에탄올로 살짝 저어줍니다.
      5. 씨앗이 든 차 체를 멸균된 이온수에 30초간 부드럽게 저어줍니다. 씨앗이 든 차 체를 다른 비커에 살짝 저어서 멸균된 탈이온수로 2분간 저어주세요. 멸균 씨앗을 빈 멸균 페트리 접시에 넣으세요.
   2. 옥수수 씨앗 불임²⁶
      1. 옥수수 씨앗을 50mL 원뿔형 튜브에 넣으세요. 원뿔형 튜브에 70% v/v 에탄올을 채우세요. 원뿔 튜브를 3분간 부드럽게 뒤집어 주세요.
      2. 70% 에탄올을 디캔트하고, 원뿔형 튜브에 2% v/v 차아염소산나트륨이 들어간 씨앗을 채웁니다. 원뿔 튜브를 3분간 부드럽게 뒤집어 주세요.
      3. 2% 차염소산나트륨을 디캔트하고 멸균된 탈이온수로 씨앗을 헹구세요. 물을 빼내고 씨앗을 물로 네 번 헹구세요. 옥수수 씨앗을 멸균 페트리 접시에 넣으세요.
3. 미생물 접종체를 배지에 넣으면 됩니다.
   참고: 노토바이오틱 시스템의 최적화 및 멸균 시험 중에는 미생물 접종을 적용하지 않았습니다.
4. 병뚜껑 디스펜서를 조립해서 미디어 병에 부착하세요.
   참고: 이 시스템은 개방형이므로, 흐름 매체를 수집할 용기를 준비하는 것을 권장합니다. 베이킹 트레이를 사용하면 이동이 쉬워지지만, 자주 비워야 한다는 것을 알게 되었습니다.
5. 플라스틱 뚜껑을 화분에서 떼고 378mL의 미디엄을 냄비에 붓습니다.
   참고: 이는 약 70%의 물로 채워진 기공 공간(WFPS)에 해당하며, 다른 토양 기질을 사용할 때는 이를 조정해야 합니다. 점토에는 360mL, 모래에는 358mL를 사용하세요.
   1. 멸균된 씨앗을 멸균 핀셋으로 적절한 깊이까지 뿌리세요.
   2. 밀은 1/2인치 깊이로, 옥수수는 1인치 깊이로 파종하세요. 또는 불임 발아 전부터 발아된 묘목을 GNOVA로 파종할 수도 있습니다. 옥수수 성장 검사에는 발아 전 씨앗을 사용하세요.
   3. 화분 위에 있는 플라스틱 캡을 다시 덮으세요.

3. 최종 조립 및 실험 운영

1. 화분과 유리 실린더를 성장실로 옮기세요. 유리 실린더를 바닥이 아래로 향하게 하여 냄비 가까이에 대세요.
2. 화분에서 플라스틱 캡을 빠르게 제거하고, 유리 실린더에서 멸균 랩을 제거하세요. 유리 실린더를 위쪽에 내려놓고, 3D 프린팅된 받침대의 선반에 올려놓으세요.
   참고: 성장 시스템 최종 조립 시 화분 옆에 불꽃(예: 휴대용 분젠 버너)을 설치하여 오염 위험을 더욱 줄일 수 있습니다.
   주의: 열린 불꽃을 사용할 때는 주변에 다른 가연성 물질이 없는지 반드시 확인하세요. 화상 부상을 방지하기 위해 불꽃의 몸 대비 위치를 주의하세요.
3. 식물 종에 따라 4주에서 17주 사이에 식물을 키우고, 종별 성장 조건을 적용하세요.
4. 밀은 낮과 밤 22°C/16°C, 옥수수는 27°C/23°C에서 재배하세요. 두 식물의 광주기는 형광등 아래에서만 12시간입니다.

4. 관개

1. 병뚜껑 디스펜서에 긴 실리콘 튜브를 연결하세요.
2. 휴대용 불꽃을 사용해 물을 줄 때는 멸균을 유지하세요. 휴대용 불꽃이 불가능하다면, 표백제를 이용해 관개하여 멸균을 유지하세요.
3. 휴대용 불꽃을 이용한 관개.
   주의: 신체 부상과 시설 손상을 방지하기 위해 열린 불꽃 주변에서 주의 깊게 작업하세요.
   1. 관개관 근처에 불꽃을 두세요. 주사기 배럴을 관개 라인에서 분리하고 필터 홀더를 설치하세요. 모든 튜브 끝은 불꽃 구역 내에 두세요.
   2. 필터 홀더를 관개 라인에 연결하세요. 두 개의 주사기 통을 서로 연결하세요. 병 상단 디스펜서의 다른 긴 실리콘 튜브를 필터 홀더의 하단 포트에 연결하세요.
   3. 0.5X 무라시게와 스쿠그 배지 150mL를 분사하세요. 두 개의 주사기 배럴을 분리하세요.
   4. 필터 홀더에서 실리콘 튜브를 분리하고 하나의 주사기 배럴로 교체하세요.
4. 10% 표백제를 이용한 관개
   참고: 대규모 실험(n> 50)에서는 이 관개 전략을 사용하여 물 주기 중 처리량을 높이는 것을 권장합니다.
   주의: 표백제 취급 시 실험실 가운, 장갑, 보호 안경을 착용하세요.
   1. 10% v/v 표백제 용액을 두 개의 작은 플라스틱 비커에 분배해 관개 라인 근처에 놓으세요. 주사기 배럴을 관개 라인에서 분리하고 필터 홀더를 설치하세요.
   2. 필요할 때까지 모든 튜브 끝을 10% 표백제 용액에 담가두세요. 과도한 표백제 용액을 털어내세요. 필터 홀더를 화분의 관개 라인에 연결하세요.
   3. 병 상단 디스펜서의 다른 긴 실리콘 튜브 조각을 필터 홀더 하단 포트에 연결하세요.
   4. 0.5X 무라시게와 스쿠그 배지 150mL를 분사하세요. 실리콘 튜브를 필터 홀더에서 분리하세요.
      참고: 관개 용량은 모래 120 mL, 점토 360 mL입니다.
   5. 과도한 표백제를 털어낸 후 관개 라인의 필터를 주사기통으로 교체하세요.
      참고: 관개 용량이 변할 경우, 관개 라인을 프라이밍할 약 20mL의 매체를 고려하세요.
5. 화분에 일주일에 한 번 관개하세요. 실험 목적과 사용된 토양 기질에 따라 관개 부피와 빈도를 조정하세요. 100% 모래를 사용할 경우, 관개 빈도를 주 2회로 늘리세요.

5. 수확

참고: 이 수확 프로토콜은 그노토바이오틱 시스템의 테스트 및 최적화 과정에서 따랐습니다. 채취 프로토콜은 특정 연구 목표와 처리되는 샘플의 양에 맞게 수정되어야 합니다.

1. 수확 최소 하루 전에 모든 용액과 재료를 준비하고 멸균하세요.
   1. 오토클레이브 4L의 탈이온수와 0.145M NaCl 500mL를 121°C의 액체 사이클로 하루 30분간 미리 투여합니다.
   2. 오토클레이브 가위와 핀셋은 121°C에서 하루 30분간 건조 사이클에 사용하세요.
      참고: 별도의 언급이 없는 한, 다음 단계는 층류 후드에서 무균 기법을 사용하여 수행해야 합니다. 샘플 채취에 멸균이 필요하지 않은 경우, 이 모든 단계는 층류 후드 외부에서도 수행할 수 있습니다.
2. 성장실에서 그노토바이오틱 시스템을 실험실로 옮겨 층류 후드 근처에 설치하세요.
3. 유리 실린더를 포트에서 분리하고 빠르게 파미너 플로우 후드에 포트를 넣으세요. 3D 프린팅된 베이스에서 화분을 빼세요.
4. 식물을 밑동에 고정하고 흙 기질 용기에 버리세요. 뿌리에서 큰 흙 덩어리를 부드럽게 털어내세요.
   참고: 토양 기질 샘플은 수확의 이 단계에서 특정 연구 목표에 따라 수집 및 처리할 수 있습니다. 여기서 간략히 설명한 프로토콜은 토양의 무균성을 테스트하는 데 사용되었습니다.
5. 토양 박테리아 수확²⁷ , 단일 플레이트 연속 희석 스포팅²⁸.
   1. 96웰 플레이트의 웰에 0.145 M NaCl 270 μL를 채웁니다. 첫 번째 줄은 비워 둬. 15mL 원뿔형 튜브에 9mL 0.145 M NaCl을 넣은 토양 기질 1g을 추가합니다.
   2. 최대 속도로 5분 동안 소용돌이. 샘플 30 μL를 96웰 플레이트의 빈 웰에 옮깁니다.
   3. 각 샘플을 7회 연속 희석하여 각 샘플 30 μL을 아래 웰에 피펫팅하여 270 μL NaCl 용액을 준비합니다.
   4. 각 이동 사이에 피펫팅을 위아래로 흔들어 잘 섞으세요.
   5. 각 샘플의 단일 플레이트 연속 희석 스포팅을 준비하는데, 각 시료당 10 μL의 연속 희석액을 단일 R2A 판에 도금합니다.
   6. 접시를 기울여 방울 부위를 넓히세요. 상온에서 배양판을 보관하세요.
   7. 군집 형성 단위(CFU)를 세고 토양의 CFU/g를 계산하세요.
6. 살균 가위를 사용해 뿌리에서 새싹을 분리하세요. 신선한 샷 무게를 기록하세요.
7. 뿌리를 비커에 담아 부드럽게 흔들어 디이온수로 청소하세요. 뿌리를 닦고 말린 후 신선한 무게를 기록하세요.
   참고: 이 지점에서 지상 및 지하 물질을 수집하여 관심 있는 하류 분석에 가장 적합한 방법론에 따라 처리할 수 있습니다.

결과

우리는 식물-미생물 상호작용을 관찰하는 데 필요한 멸균되고 통제된 환경을 가능하게 하는 새로운 식물 그노토바이오틱 시스템인 GNOVA를 개발했습니다. 이 새로운 시스템은 24.4인치(62cm)의 수직 슛 공간과 여러 토양 기질과 호환되는 1.3L 화분을 제공합니다. 완전히 조립된 시스템은 높이 약 3피트(92.4cm), 너비 4.57인치(11.6cm)입니다(그림 5A–C). 다른 시스템과 비교했을 때, 이 산은 수직 성장 능력이 가장 높고 두 번째로 큰 뿌리 공간을 가지고 있습니다(보충 표 1). GNOVA는 성장실에 0.0135 m^² 의 표면적만 필요로 하므로, 이 시스템은 컴팩트하고 기동성이 좋습니다. 이 시스템은 수직 간격 1.22m의 리치인 성장실에서 사용할 수 있습니다. 이 시스템의 모든 부품은 3D 프린팅된 베이스를 제외하고, 24인치× 24인치× 36인치(너비× 길이× 높이; 61cm × 61cm × 91cm)의 오토클레이브와 호환됩니다. 이로 인해 개별 부품의 수동 멸균을 우회하여 실험 절차가 간소화됩니다. 또한 이 시스템의 대부분 구성 요소는 재사용 가능하여, 초기 설치 비용인 단위당 54달러를 제외하면 실험당 사용 비용이 약 6달러 수준으로 유지됩니다(보충 표 2). GNOVA 내 환경 조건은 일주일 된 옥수수 식물로 시스템의 온도와 상대습도를 3일간 추적하여 결정되었습니다. GNOVA 내 온도는 평균적으로 성장실보다 +1.3 °C 높았습니다(보충 그림 1). 시스템과 챔버 내 온도 차이는 빛 주기(평균 +2.5 °C)에서 더 컸으며, 암흑 주기(평균 +0.4 °C)보다 컸다. GNOVA 내 상대습도는 평균 63%였으며, 성장실에서는 34%였다.

그림 5: GNOVA 시스템의 렌더링. (A) 지지대 최종 설계의 3D 모델 (B) 지지대 3D 모델의 단면적 (C) 완전 조립된 GNOVA의 3D 모델 단면도 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

시스템 내 무균을 보장하기 위해 우리는 관개되지 않은 시스템과 식물이 없는 관개 시스템을 대상으로 4주간 시험을 진행했습니다. 유리 실린더의 오염은 직접 면봉 도금을 통해 면 링 위아래를 샘플링하여 확인했습니다. 비관개(n=4)와 관개된 샘플(n=6) 모두에서 면화 링 위에서 세 개의 군락 이상(즉, 표적의 3분의 1당 단일 군락)이 검출되지 않았습니다(보충 그림 2A). 면화 링 아래에서는 관개되지 않은 한 복제에서 성장이 관찰되었으나, 관개 시스템에서는 성장이 관찰되지 않았습니다(보충 그림 2B). 이는 미생물 성장이 식물과 접촉하지 않은 면화 링 아래에서 제한된 복제만 존재했기 때문에 유리 실린더에서 오염 가능성이 낮음을 시사합니다. 토양 오염은 R2A 플레이트에 연속 희석 현상을 발견하여 평가하였다(보충 그림 2C). 두 조건 모두에서 유의미한 미생물 증식은 검출되지 않았으며, 연속 희석으로 인한 집단 형성 단위 수가 < 개의 관개 복제 단일 복제체(즉, 30개 군락)가 관찰되었습니다. 멸균 테스트 외에도, GNOVA 내에서 재배된 밀과 옥수수의 성능 비교를 표준 2주간의 봉지 시스템 내 Gnotobiotic 성장 프로토콜과 비교했습니다¹⁹. 작은 크기와 관개 부족이 식물 성능에 미치는 영향을 이해하기 위해, 우리는 봉지 내 성장 기간을 GNOVA 내의 성장 기간과 맞추도록 연장했습니다. 두 시스템 설치 시 사용된 초기 토양 수분 함량이 일치했음에도 불구하고, GNOVA는 주간 비료를 받았던 반면 백은 그렇지 않았습니다. 모든 비교에서는 백 시스템을 기준으로 삼았는데, 이것이 우리 연구실의 초기 그노토바이오틱 세트업이었기 때문입니다. GNOVA 내에서 밀과 옥수수 모두 100% 발아를 달성한 반면, 백 시스템에서는 밀이 67%(n = 3), 옥수수는 75%(n = 8)에 불과했다(그림 6).

그림 6: GNOVA(보라색)와 백 시스템(녹색) 내에서 밀(n = 3)과 옥수수(n = 8)의 발아. 각 복제의 발아 결과는 y축 위의 점으로 나타내며, 각 gnotobiotic 시스템에 대해 발아 없음 또는 발아됨으로 표시됩니다. 막대는 서로 다른 시스템 내에서 각 식물 종의 발아율(%)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

GNOVA 내에서 최대 생존 가능한 성장 기간과 식물 성능을 결정하기 위해 밀과 옥수수의 성장 시험도 수행되었습니다. 표준 가방 프로토콜은 2주간의 성장만 요구하지만, 두 시스템 간의 비교를 위해 가방 내 성장 기간을 2주 이상 연장했습니다. 2주 후, GNOVA(n=3) 내에서 재배된 밀은 이미 자독 성장 단계(GS) 13에 도달했으나(그림 7A), 봉지 내에서는 GS11에 머물렀다. 5주차에 식물들은 GNOVA 시스템 내에서 경운기(tiller)의 출현으로 GS21에 도달했습니다(그림 7B). 반면, 경운기는 가방 시스템에서 제외되었고, 식물은 GS13에 남아 있었습니다. 이러한 성장 지연과 주머니 시스템 내 시절학적 변화 부족으로 인해 6주 차에 이 시스템의 식물들이 중단되었습니다. GNOVA 내에서 밀 식물은 5주 더 자라며, 잎 수와 생체량이 증가하는 것이 관찰되었다(그림 7C). GNOVA 내에서 12주 성장 후 밀 생체량이 시각적으로 증가했음에도 불구하고, 식물은 엽록화 잎이 더 많이 나타나기 시작했고, 유리 원통형 부피는 식물 생체량으로 채워졌습니다(그림 7D). 밀은 그 후 2주 더 재배되었다(그림 7E, F). 그러나 생체량의 시각적 증가는 없었고, 따라서 성장 테스트는 성장 17주에 종료되었습니다. 또한 GNOVA 내에서 4주간 옥수수의 성장을 평가하고, 봉지에서 재배한 옥수수와 비교하였습니다(그림 8A,B). 이 실험에서는 옥수수 씨앗을 GNOVA 또는 봉지 시스템 내에서 파종하기 전에 멸균하고 사전 발아했습니다. 옥수수의 신선한 새순과 뿌리 무게는 두 시스템 간에 유의미하게 달랐다(두 표본 t-검정, p값 < 0.05, 보충표 3). GNOVA에서 재배된 옥수수는 신선한 새싹과 뿌리가 각각 평균 11.2g과 5.7g의 무게를 가졌습니다(그림 8C,D). 반면, 봉지 내에서 재배된 옥수수의 새싹과 뿌리는 각각 1.29g과 1.15g의 신선한 무게를 가졌습니다. 전반적으로 GNOVA 내에서 재배된 옥수수의 신선한 생체량은 봉지 시스템에서 재배된 옥수수 대비 593% 증가했습니다. 더불어, GNOVA 내에서 줄기와 뿌리 길이가 각각 백 내보다 89%와 57% 유의하게 더 길었습니다(그림 8E, F).

그림 7: GNOVA 프로토타입 내 밀 성장 현황. (A) 자독 성장 단계 (GS) 13 2주 차의 밀. (B) 봉지 내 5주 성장 후 밀과 GNOVA 비교. 경운기는 GNOVA(GS21) 내에 존재하며, 가방(GS13)에는 없습니다. (C) 성장 10주 후 밀의 생체량 증가. (D) 성장 13주에 밀의 생물량이 증가하며 엽록화 잎이 나타난다. (E) 성장 15주 시점에 밀의 바이오매스 추가 증가. F) 밀 바이오매스는 성장 17주 동안 이용 가능한 성장량의 대부분을 차지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 8: GNOVA(보라색) 프로토타입 내 옥수수의 성장과 백 시스템(녹색)의 비교. 막대는 표준오차 (n=4) (A) ± 평균 값을 나타내며, GNOVA와 봉지 시스템에서 4주간 재배한 옥수수입니다. (B) GNOVA와 봉지 시스템에서 재배된 수확 식물의 크기 비교. (C) 신선한 새싹 무게 (평균±SE). (d) 신선한 뿌리 무게 (평균±SE). (e) 발사 길이 (평균±SE). F) 근 길이 (평균±SE). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 1: GNOVA(보라색)와 성장실(주황색) 내에서 측정된 상대 습도 및 온도의 시간적 역학. 데이터는 3일 동안 5분 간격으로 기록되었습니다. GNOVA 내 데이터는 7주 된 옥수수 식물을 대상으로 기록되었습니다. 연한 파란색으로 음영된 구역은 밤 시간대에 해당합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 2: 관개 없이 식물을 투여하지 않은 상태(대조군)와 관개 상태를 허용한 경우(관개됨)에서 발생한 미생물 증식. (A) 면 링 위의 유리 실린더 샘플. (B) 면 링 아래의 유리 실린더 샘플. (C) 토양 샘플의 단일 판 연속 희석 도금. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 1: GNOVA와 기존 다른 식물 그노토바이오틱(EcoFAB, 마젠타 박스, 백, FlowPot, GnotoPot, EcoFAB 3.0)과의 특징 비교. 시스템은 식물 높이 용량, 근원량 용량, 관개 제어 등 실험 설계와 관련된 주요 매개변수를 비교합니다. 정보는 출판된 문헌과 이용 가능한 시스템 설명에서 수집되었으며; 데이터가 명시적으로 보고되지 않은 경우에는 추정치가 표시됩니다. † 문헌에 명시되지 않은 경우 최적 근사; ‡ 시스템은 작업을 수행하기 위해 분해되거나 층류 후드로 옮겨질 필요가 없습니다; * 시스템 수정 시 가능; 비용 범주는 다음과 같이 정의됩니다: 저(< 단위당 30달러), 중간 단위(단위당 30-100달러), 고가(>단위당 100달러). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보충표 2: 단일 GNOVA 유닛의 조립 및 운영에 필요한 자재명세서(BOM) 및 추정 비용. 자재는 재사용 가능 또는 일회용 부품으로 분류되며, 이에 대응하는 단위 비용, 시스템별 필요한 수량, 시스템당 총비용도 포함됩니다. 재사용 가능한 부품은 초기 설치 비용에 기여하며, 일회용 재료는 실험당 소모 비용을 나타냅니다. * 비용 효율적인 요금을 위해 협상된 대량 가격을 바탕으로 산출; ** 필요한 양은 실험 기간, 사용된 토양 기질, 연구 목표에 따라 다릅니다. 점토와 모래 혼합물을 이용한 주간 관개 일정으로 4주간 실험 가치; † 시스템당 필요한 자재량의 대략적인 비용; ‡ 실험 목적에 따라 달라질 수 있으므로 영양액이나 토양 기질의 가격은 포함되지 않습니다. 이파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보충 표 3: 옥수수 성장에 대한 두 표본 t-검정의 p-값은 GNOVA와 백 시스템 내에서 성장한 변수들을 측정했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

여기서 소개된 식물 그노토바이오틱 시스템인 GNOVA는 곡물 작물에서 식물-미생물 상호작용을 연구하는 데 접근하기 쉽고 다재다능한 도구를 제공합니다. 주요 특징으로는 성장 능력 증가와 내장 관개 시스템이 있어, 무균 조건에서 묘목 단계 이후로 곡물의 성장을 연장합니다. 이 시스템의 성능은 EcoFAB 3.0과 비교할 만하며, 접근성 높은 대안 식물 그노토바이오틱 시스템을 제공합니다. 이 시스템은 비용, 단순성, 중형 오토클레이브와의 호환성을 고려해 상업적으로 구할 수 있는 부품으로 구성되어 실험실 전반에 걸쳐 채택을 촉진합니다. 조립과 운영은 간단하며 전문 장비가 필요하지 않아 구현 장벽을 줄여줍니다. GNOVA는 다양한 토양 기질, 종자 멸균 프로토콜, 미생물 접종제(무균, SynCom, 자연 군집), 다양한 하위 분석 방법과의 호환성 덕분에 다양한 연구 목표에 맞게 조정될 수 있습니다.

식물 그노토바이오틱 실험에서는 관찰된 효과가 오염물이 아닌 관심 미생물에 기인할 수 있도록 최소화하는 것이 필수적입니다. GNOVA의 간단한 작동 방식은 오염 위험을 줄여줍니다. 엄격한 무균 기법 준수와 다음 주요 권고사항이 불임 유지를 보장합니다. 실험 설정 중에는 미생물 접종제 간 층류 후드의 소독을 권장하여 처리제의 교차 오염을 최소화할 것을 권장합니다. 처리 순서도 교차 오염을 줄일 수 있습니다. 생미생물 치료를 하기 전에 무균 처리제를 사용하는 것이 이상적입니다. 외래 미생물은 씨앗을 통해 유입될 수도 있습니다. 따라서 표면 종자 멸균 프로토콜은 각 식물 종이나 씨앗 공급원에 맞게 불임과 발아의 균형을 맞추기 위해 최적화되어야 합니다²⁶. 수수²⁴, 보리²⁹, 스위치그래스, 귀리²³ 과 같은 비모델 곡물에 대한 멸균 프로토콜은 GNOVA에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 불임이 발아에 부정적인 영향을 미칠 경우, 발아 전 씨앗을 사용할 수 있습니다. 관개는 유토바이오틱 시스템에서 주요 오염원입니다. 이 과정에서 가장 중요한 지점은 필터를 관개 라인에 부착하는 것입니다. 관개 라인과 필터의 튜빙 끝은 이 과정에서 멸균 상태를 유지해야 합니다. 화염 멸균은 손재주가 필요하며, 특히 대규모 실험에서 노동 집약적일 수 있습니다(n >50). 따라서 대규모 실험이나 화염 멸균이 실용적이지 않을 때는 표백제 기반 대체 방법이 권장됩니다. 추가 멸균 필터를 유지하고, 물 주입 시 표백제나 에탄올을 준비하는 것도 관리 시스템 재료 오염 시 권장됩니다. 또한, 오염 관리 장치(즉, 식물 없음, 미생물 처리 금지, 관개 수입 포함)의 포함이 불임 모니터링과 오염물질 식별을 위해 강력히 권장됩니다.

관개 오염 위험을 극복하기 위해 초기 식물 그노토바이오틱 시스템은 완전히 폐쇄되어 관개 기능이 없어 실험 기간이 제한되었습니다. 옥수수는^{19, 30} 봉지, 유리관, 배양 접시¹⁵ 배양 등 2주에서 4주 사이에 유성비합체적으로 재배되었습니다. 식물 성장 중 물과 영양분을 보충하기 위해 EcoFAB²³, FlowPot, GnotoPot²¹과 같은 대체 시스템이 층류 후드 내에서 부분 분해하여 관개를 가능하게 했습니다. 이로 인해 크기와 대형 식물과의 호환성이 제한되었습니다. 관개 라인은 GNOVA 외부에서 쉽게 접근할 수 있어 분해가 필요 없으며, 시스템이 층류 후드 크기에 제한되지 않습니다. 이는 영양분과 수분의 지속적인 공급을 가능하게 할 뿐만 아니라 사용 가능한 성장 공간을 넓혀줍니다. 줄어드는 순 공간은 광합성 능력을 감소시키고 성장 지연에 기여^{하며, 뿌}리 부피 제한은 뿌리 결합을 유발하여 수분과 영양^{분 흡수를} 감소시킬 수 있습니다. 작은 성장 공간과 관개 부족이 결합되어 옥수수와 밀의 생물량 감소와 GNOVA 시스템에 비해 시절적 진행 부족을 설명할 수 있습니다. 이 새로운 시스템은 EcoFAB 3.0²⁴에서 수수와 비슷한 기간 동안 옥수수의 그노토바이오틱 성장을 가능하게 했습니다. 더불어, 수경재배 시스템에서 더 대표적인 토양 시스템에서 밀의 4주 동안 성장하는 것보다 더 높은 성장률을 보입니다(20). 물리적 제약 외에도 노토바이오틱 시스템은 멸균을 유지하기 위해 제한된 공기 흐름에 의존하는 경우가 많습니다. 제한된 공기 흐름은 온도와 습도 상승, 가스 교환률 감소로 이어져 식물 생리학에 영향을 줄 수^{있습니다.} GNOVA에서 사용되는 DW4 필터와 유사하게 작동하는 HEPA 필터³³이 장착된 마젠타 박스와 같이 공기 흐름이 향상된 시스템에서 성장 개선이 보고되었습니다. 마찬가지로 EcoFAB 3.0은 온도와 상대습도가 증가했지만, 여전히 수수²⁴의 그노토바이오틱 성장에 견고한 플랫폼으로 간주되었습니다. 이는 물리적·환경적 제약이 여전히 존재하지만, 여기서 제시된 시스템 설계의 발전은 곡물의 그노토바이오틱 성장을 보다 효과적으로 지원하는 개선된 조건을 제공함을 시사합니다.

수정의 용이성도 GNOVA의 또 다른 핵심 특징입니다. 모듈화된 설계 덕분에 사용자는 연구 필요와 예산에 맞게 개별 부품을 변경할 수 있습니다. 이 시스템은 자연 토양을 포함한 모든 토양 기질과 호환됩니다. 설치 부피, 영양액 농도, 관개 부피 및 빈도의 조정은 토양의 물리화학적 특성에 기반해야 하며, 이는 영양분과 물의 가용성과 분포에 직접적인 영향을 미치기 때문입니다³⁴. 가뭄은 전체 GNOVA 시스템의 무게를 모니터링하고 토양 수분 함량을 중력계로 측정함으로써 유발할 수^{있습니다.} 뿌리 분출물은 수확한 식물을 초순^수수에 배양하거나 시스템을 세척하여 비멸균 침^{출수를 얻}어 파괴적으로 수집할 수 있습니다. 멸균 분출물이 필요할 경우, GNOVA의 포트와 3D 프린팅 지지대를 수정하여 EcoFAB 3.0²⁴ 설계에 포함된 내장 삼출물 수집 기능을 통합할 수 있습니다. 미생물 군집 조립에 미치는 우선 효과³⁸ 을 이해하고자 하는 과학자들은 화분 주변에 추가 관개 라인을 설치할 수 있습니다. 이로 인해 미생물 접종제를 후속 도포하면서 주 관개 라인의 무균성을 유지할 수 있습니다. 환경 조건은 소독된 무선 온도 및 상대습도 센서를 GNOVA 내에 배치하여 모니터링할 수 있습니다. 또는 유리 실린더를 폴리카보네이트 챔버로 교체하고 샘플링 포트²⁴ 를 뚫으면 환경 측정과 가스 샘플링이 가능해졌습니다. 이를 통해_CO2,_O2, 에틸렌과 같은 가스와 휘발성 화합물의 정량화가 가능하며, 이는^{공장 성능에} 영향을 미칠 수 있습니다. 유리 실린더의 면 링을 제거함으로써 시스템으로의 공기 흐름을 높일 수도 있습니다. 그러나 이러한 수정 중 어느 하나가 오염 위험을 높일 수 있으며, 아직 GNOVA 내에서 검증되거나 최적화되지 않았습니다.

GNOVA의 장점과 다재다능함에도 불구하고 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 이 시스템은 온실이나 밭에서 통제되지 않은 환경이 성능을 악화시킬 수 있으므로 통제된 성장실 내에서 사용하는 것이 가장 적합하다는 점을 유의해야 합니다. 밀은 17주 동안 시스템 내에서 성장할 수 있었으나, 성장 약 12주경에 스트레스 징후가 관찰되었습니다. 따라서 밀은 12주 이상 재배해서는 안 됩니다. 더불어, 불임 유지는 4주 성장 기간 동안 주 4회 관개 사건을 통해서만 확인되었습니다; 장기 실험은 오염 위험이 증가합니다. GNOVA가 뿌리 부피 용량을 증가시켰음에도 불구하고, 근 제한은 여전히 가능하며, 근 형태의 시간 평가는 근 결합을 최소화하는 최적의 성장 기간을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 유리 실린더를 폴리카보네이트 실린더로 교체하는 등 일부 시스템 개조는 설치 비용을 단위당 100달러 이상으로 증가시킬 수 있습니다. 현재 GNOVA는 종료 지점 파괴 샘플링만 허용하여, 미생물 역학, 분출 패턴 또는 무균 모니터링의 시간적 연구를 위한 노동 및 복제 요구량을 증가시킵니다. 마지막으로, 설치, 관개, 수확 시 무미지 유지는 시간이 많이 소요되며, GNOVA와 같은 단순화된 시스템도 전담 노력이 필요해 전체 운영 비용이 증가합니다. 이러한 제한 사항들은 이 시스템을 도입할 때 모두 고려해야 합니다. 더불어, 실험 계획과 결과 해석 시 환경 제약을 고려해야 하며, 이는 식물 생리학과 관련된 미생물군에 영향을 미칠 수 있습니다.

GNOVA는 곡물 작물과 호환되는 다목적 그노토바이오틱 플랫폼을 제공합니다. 이 시스템은 RhizoVision explorer³⁹ 및 ARIA⁴⁰과 같은 뿌리 구조 분석 도구에 적합한 거의 온전한 뿌리 시스템을 복원할 수 있게 하여, 다양한 미생물 접종제와 환경 조건에 반응하는 뿌리 형태를 특성화할 수 있게 합니다. SynCom 및 다중 오믹스 분석과 결합될 경우, GNOVA는 미생물 효과자와 식물 반응 간의 기전적 연관성을 식별하는 데 도움을 줍니다. 더 큰 SynComs(>100명)와 메타게놈 41,42,43 분석을 결합하면 동현 패턴을 조사하고 다양한 조건에서 생태학적 관련성 미생물을 식별할 수 있습니다 ^5,44. 반면, 소규모 SynComs(<50 균주)는 메타전사체체^45,46, 메타프로테오믹 19,47,48, 대사체체 49,50,51과 병용하여 식물과 미생물의 기능 반응을 상세히 특성화할 수 있습니다⁴⁴. 이러한 역량은 GNOVA를 농업 시스템의 지속 가능성을 높이는 새로운 생물접종제 개발을 가속화할 수 있는 핵심 미생물 형질을 식별하는 귀중한 도구로 자리매김합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Powerconnect cordless drill & 100-Piece Kit	Black+Decker	BDC120VA100	1/4"와 1/8" 드릴 비트 필요.
Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards	3M	471	소모품
Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)	Amazon	B001I1QO00	소모품.
Wheat seed			이 실험에서 사용된 품종: Catawba
Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)	Lowe's	28930	2 7/8 " (7.3 cm) 직경의 원으로 절단. 소모품. 원을 대량으로 생산하려면 절단을 위해 절연 테이프를 펼치고 냄비의 열린 가장자리를 사용하여 테이프 절연 위에 냄비를 올려 놓고 압력을 가하고 비틀어 절단합니다.
DW4 필터 미디어, 15" x 75야드로 사전 절단됨  (1 절단 원형 시스템 당)	Class Biological Clean, Ltd	NA	6.3 " (16.02 cm) 직경의 원으로 절단. CBC는 원하는 경우 대신 구매할 수있는 다른 사전 절단 또는 표준 롤 크기를 가지고 있습니다.  소모품. 카드보드에 원형 템플릿을 자르고 전체 영역의 DW4 미디어에 원을 그린 다음 가위로 자릅니다.
Silicon tubing, Versilon SPX-50 고강도, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" 벽 두께	Saint-Gobain	ABX00007	두 개의 긴 조각 (16" // 40.64 cm)과 세 개의 짧은 조각 (2.5" // 6.35 cm)으로 절단
수용성 용액의 5% 이용 가능한 염소	VWR	JT9416-1	옥수수 살균 프로토콜에 사용하기 위해 2% v / v로 희석
Murashige & Skoog 매체, 마이크로 및 매크로 요소. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	0.5x 강도로 희석
Ethanol, 100%, Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	95% v / v로 희석
주사기 3 mL, luer lock 비 멸균  (시스템 당 2개)	Fisher scientific	14-817-117	플런저를 버리고 배럴만 유지하고 유리 솜으로 채우고 호일로 덮으십시오.
유리 비커, 250 mL	VWR	470191-150	밀 종자 살균에 필요한 5 개
옥수수 종자			이 실험에서 사용 된 유전형: Mexico 21 & ndash; 22 B73XMo17
알루미늄 베이킹 트레이 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	플로우 후드의 치수에 맞는지 확인
Sodium Chloride	Fisher scientific	BP358-1	0.145 M 용액 준비.
3D 인쇄 베이스, 폴리 락틱 산 (PLA) 필라멘트 사용 (시스템 당 1개)	Protolabs	NA	인쇄 및 편집 파일은 보충 자료에서 찾을 수 있습니다. Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc 에서 사용할 수 있습니다. PLA가 베이스를 생성하는 데 사용 된 필라멘트 인 경우 자동 청소기를 사용하지 마십시오. PLA는 150 & deg; C 이상에서 녹고 60 & deg; C 이상에서 변형 될 수 있습니다. 40 & deg; C 이상의 온도에서 사용하려면 PLA 3D 인쇄 베이스의 무결성을 테스트하는 것이 좋습니다. PETG (폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜) 또는 PC (폴리 카보네이트)와 같은 고온 저항성 재료를 대신 사용할 수 있습니다. 이는 부품 비용을 높이고 여전히 자동 청소기를 사용할 수 없습니다. 3D 인쇄 베이스 프로토 타입은 256 & times; 256 & times; 256 mm (길이 & times; 너비 & times; 높이)의 빌드 볼륨을 가진 개인 프린터로 수행되었습니다. 속도와 비용 효율성을 위해 현지 상업용 3D 인쇄 서비스 제공 업체에서 대량으로 인쇄하는 것이 좋습니다.
남성 luer to 호스 바브 피팅 1/8 "ID, 동물 파생물이없는 폴리 프로필렌  (시스템 당 2개)	Cole-Parmer	EW-50114-69	프로토콜에서 피팅 1이라고 함
남