콜라겐제 주사와 운동 유발 기계적 과부하 결합: 무릎 골관절염 과부하 스트레스 손상을 시뮬레이션하는 마우스 모델

요약

이 프로토콜은 관절 내 콜라겐제 주사와 운동 유발 과로를 결합하여 과부하 스트레스 유발 무릎 골관절염의 마우스 모델을 구축하여, 퇴행성 병태 연구를 위한 최소 침습 플랫폼을 제공합니다.

초록

무릎 골관절염(KOA)은 생물학적 조직 파괴와 지속적인 기계적 과부하가 복잡하게 작용하여 발생하는 다인성 퇴행성 관절 질환입니다. 기존의 외과 동물 모델은 종종 외상 후 관절 파괴를 유발하는데, 이는 인간 퇴행성 KOA의 점진적이고 누적적인 발병 기전을 정확히 재현하지 못합니다. 이 번역 간극을 메우기 위해, 본 연구는 경미한 효소 연골 분해와 지속적인 기계적 부하를 시너지 내어 과부하 스트레스 유발 KOA를 시뮬레이션하는 새롭고 재현 가능한 마우스 모델을 확립하였습니다. 구체적으로, 표준화된 관절내 주입인 2형 콜라게나제가 엄격한 보정된 회전근 피로 장치를 통해 4주간 매일 기계적 과운동을 병행하였다. 이 이중 요인 중재의 효능은 포괄적인 행동, 조직학, 분자 분석을 통해 검증되었습니다. 자동 보행 분석 결과, 결합 그룹에서 심각한 운동 기능 결함이 발견되었습니다. 이 수술들은 보폭, 보폭, 그리고 최대 발바닥 면적이 크게 줄어든 것이 특징이었습니다. 사프라닌 O-fast 그린 염색을 이용한 조직형태학적 평가는 이러한 기능적 결함을 확인했으며, 연골 구조 손상, 표면 결함, 그리고 초기 및 중기 인간 KOA의 병리학적 특징을 충실히 반영하는 골관절염 연구학회(OARSI) 점수가 유의미하게 상승한 것으로 나타났습니다. 더 나아가, 면역조직화학적 평가는 관절 연골세포에서 기계적 민감성 채널 과도적 수용체 전위 바닐로이드 4(TRPV4)의 현저한 상향 조절과 중요한 기질 단백질인 콜라겐 II 알파 1형(COL2A1)의 감소를 동시에 보여주었습니다. 국소적인 관절 불안정성과 통제된 기계적 스트레스를 통합함으로써, 이 최소 침습 전략은 수술 모델과 관련된 급성 외상을 피할 수 있습니다. 이 프로토콜은 동적 분자 기전 추적, 만성 통증 표현형 평가, 초기 골관절염에 대한 장기 치료 중재 검증을 위한 임상적으로 중요한 실험 플랫폼을 구축합니다.

서론

골관절염(OA)은 비만, 기계적 부담, 외상 등의 요인에서 발생하는 통증, 부기, 뻣뻣함, 기능 저하를 특징으로 하는 다요인 퇴행성 질환입니다^. 무릎 골관절염(KOA)은 매우 흔하며 노화에 따라 점점 흔해지지만, 임상 증상이 다양하기 때문에 임상 시험 범위가 제한되는 경우가 많습니다. 따라서 효과적인 치료법 개발을 위해서는 적절한 동물 모델이 필요합니다^. OA의 본질적인 이질성을 고려할 때, 보편적으로 인정받는 '골드 스탠다드' 모델은 존재하지 않으며, 연구자들은 자신의 과학적 탐구에 부합하는 특정 모델을 식별해야 합니다.

KOA는 현대 의학에서 관절 연골과 연골 주위 조직에 기계적 요인과 생물학적 요인이 상호작용하는 상태로 특징지어집니다. 이 복잡한 상호작용의 결과는 주로 관절 연골과 그 주변 기반의 점진적인 악화^입니다. 기계적 스트레스는 관절 세포^{와 조직 내} 다양한 생리적·병리학적 과정을 지배하는 중요한 전도 신호로 작용합니다. 관절 연골을 건강한 상태로 유지하려면 생리적 범위 내에서 적절한 기계적 부하가 필요했다. 반대로 과도한 부하 과부하는 연골 퇴행과 KOA⁵ 발병을 초래하는 경우가 많습니다. 자발적 모델은 상당한 시간과 경제적 투자로 인해 방해받^{으며, 외과}적 유도 모델은 주로 중후기 KOA를 나타내는 파괴적 접근법을 사용하며, 자연스러운 퇴행 진행과 벗어난다 ^7,8. 반대로, 화학적으로 유도된 모델은 콜라겐 기질을 표적으로 하지만, 기계적 스트레스 없이 사용할 경우 인간 퇴행성 골관절염의 포괄적인 변화를 포착하지 못합니다^. 효소 분해와 기계적 과다 과로를 결합하면 과부하 스트레스 손상의 점진적 발병 기전을 보다 충실하게 재현함으로써 이러한 공백을 해소할 수 있습니다. 본 연구의 목표는 관절 내 II 콜라겐제 주사와 회전 휠 피로 장치를 이용한 과운동을 결합하여 KOA의 새로운 마우스 모델을 확립하고 검증하는 것입니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 상하이 중의학대학교 동물 관리 및 이용위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 실험은 상하이 중의학 대학 실험동물센터가 부여한 프로젝트 라이선스(번호: PZSHUTCM201016022) 하에 수행되었으며, 이는 미국 국가연구위원회(NSC) 실험동물 관리 및 사용 가이드 업데이트 위원회의 지침에 따른 것입니다.

1. 동물 모델 생산 프로토콜

1. 10주 된 C57BL/6 쥐 32마리를 무작위로 네 그룹에 배치합니다: 대조군, 콜라겐제, 과도한 운동, 콜라겐제+과도한 운동군.
   1. 모델 절차를 시작하기 전에 모든 쥐를 표준 먹이 및 주거 환경에서 1주일간 적응시키세요.
2. 배정된 실험 그룹에 따라 4주 동안 동물 모델을 유도합니다.
   1. 콜라겐제 그룹 쥐에게 관절 내 주사를 통해 II형 콜라게나제를 투여합니다.
   2. 과도한 운동 그룹의 쥐들에게 회전 바퀴 장치를 이용한 운동 훈련을 시키세요.
   3. 관절 내 콜라겐제 주사와 회전 휠 운동 훈련을 콜라겐제 + 과도한 운동군 쥐에게 모두 적용하세요.
   4. 모든 관련 운동 그룹에서 동일한 훈련 빈도와 시간을 유지하세요.

2. 제2형 콜라겐제 관절내 주사 프로토콜

1. 마취
   1. 보정된 가스 마취기를 통해 투여된 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다. 2%–3% 이소플루란 농도로 신속 유도를 수행합니다.
   2. 마취는 1.5%–2% 이소플루란 유지. 마취 청소 시스템의 적절한 작동을 보장하여 직업적 노출을 방지합니다.
   3. 시술 내내 마우스의 호흡 속도와 반사 신경을 지속적으로 모니터링하세요.
2. 피부 준비
   1. 왼쪽 무릎 관절 주변 부위에 제모 크림을 바르세요. 스크래퍼로 털을 완전히 제거하세요.
   2. 노출된 피부를 꼼꼼히 깨끗이 닦아주세요. 준비 과정 내내 무균 상태를 유지하세요.
3. 제2형 콜라겐제 준비
   1. II형 콜라게나제 분말을 멸균된 생물안전 캐비닛에서 30분간 실온에 평형으로 맞추세요. 용해 공정의 용매 및 완충제는 무균 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2–7.4)를 독점적으로 사용한다.
   2. 분석 저울을 사용해 콜라겐제 가루의 필요한 질량을 정확히 계량하세요. 멸균 PBS를 분말에 천천히 첨가하여 최종 작동 농도인 0.04 U/μL에 도달합니다.
   3. 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 투명하고 보이는 입자가 없을 때까지 부드럽게 섞으세요. 이 단계에서 격렬한 소용돌이 현상을 피하여 효소 활성 손실을 방지하세요.
   4. 준비된 0.04 U/μL 용액을 1,000 rpm에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 이로 인해 용해되지 않은 미세입자가 제거되고 이후 주사 시 바늘이 막히는 것을 방지합니다.
   5. 상정액을 멸균 튜브에 흡입한 후 즉시 사용할 수 있도록 4°C 얼음 욕조에 보관하세요. 각 세션마다 용액을 신선하게 준비하여 최대한의 효소 활성을 보장하세요.
4. 관절 내 주사
   1. 비우세 손의 엄지와 검지로 쥐의 등 피부를 잡으세요. 무릎 관절을 자연스럽게 펴고 주사 부위를 완전히 노출시키기 위해 약지와 새끼손가락으로 양쪽 팔다리를 고정하세요.
   2. 30G 바늘이 장착된 10μL 마이크로주사기를 들고 있습니다. 바늘을 피부 표면과 평행하게 약 0.2cm 정도 피부층 입구에 삽입합니다.
   3. 조직 저항이 줄어들 때 바늘 방향을 피부에 대해 수직 방향으로 천천히 조정하세요.
   4. 바늘을 약 0.3–0.5cm 정도 계속 앞으로 나가다가 저항이 약해지면 관절 공간에 진입할 수 있음을 나타냅니다. 주사기 플런저를 천천히 빼서 역류가 없는지 확인하세요.
   5. 2형 콜라겐제 용액 5 μL(농도: 0.04 U/μL)을 일정 속도¹⁰으로 관절 공동에 주입합니다.
   6. 주사 직후 바늘 위치를 유지하세요. 주사 부위 주변 피부를 10–15초 부드럽게 누르세요.
   7. 바늘을 천천히 빼세요. 진입 부위를 멸균 거즈로 30초간 가볍게 눌러 약물 누출을 방지하세요.
   8. 쥐를 따뜻하고 건조한 집 케이지에 넣으세요. 마취에서 동물이 자연스럽게 회복할 수 있도록 보통 5–10분 정도 걸립니다.
   9. 쥐가 완전히 회복되면 표준 주거 및 먹이 환경을 재개하세요.
   10. 이 관절 내 주사는 주사마다 주 2회, 주사 사이에 3–4일 간격을 두고 4주 모델링 기간(초기 1주 적응 후)에만 시행하세요.
   11. 모든 샤프는 즉시 승인된 생물학적 위험 용기에 폐기하십시오.
       참고: 모든 주사는 훈련된 인력이 수행하도록 하여 관절 손상과 실험적 변동성을 최소화하세요.

3. 회전 휠 유도 과운동 프로토콜

1. 장비 준비 및 안전 점검
   1. 회전자형 피로 장치의 속도를 12 rpm(약 0.063 m/s에 해당)으로 설정하고, 세션당 지속 시간을 2시간으로 설정하세요.
   2. 전기 자극 모듈을 켜. 전류 출력이 0.1–0.3 mA의 사전 설정 안전 범위 내에 있는지 확인하세요. 전류 세기를 수동으로 올리지 마세요.
      주의: 전기 자극 모듈은 쥐를 휠로 다시 안내하는 용도로만 사용하며, 처벌적 자극으로 사용하지 마세요. 장치 배선에 손상이 없는지 점검하고, 작동 전에 전극 접촉이 잘 되어 단락과 감전 손상을 예방하세요.
2. 고산 적응 훈련
   1. 피로 장치의 회전 휠 챔버가 깨끗하고 건조하며 이물질이 없는지 확인하세요. 바퀴 입구의 전기 자극 전극을 비활성화하여 자극 관련 스트레스를 제거하세요.
   2. 쥐 꼬리 밑부분을 조심스럽게 만지거나 멸균된 연조직으로 퍼내세요. 쥐들을 개별적으로 회전 바퀴의 중앙 영역에 배치하세요.
   3. 마우스를 수평 달리기 표면 위에 자연스러운 네 발 서기 자세로 배치하세요. 몸을 바퀴의 중심 회전축과 평행하게 향하게 하고, 앞발은 앞으로 내밀고 뒷발은 약간 뒤로 두세요.
   4. 첫 2분 동안 쥐가 좁은 전극 구역에 들어가지 못하도록 임시적이고 제한이 없는 부드러운 장벽을 사용하세요. 이 기간 후에는 장벽을 제거하여 쥐가 방 전체를 자유롭게 탐색할 수 있도록 하세요.
   5. 처음 3일 동안 매일 10분씩 고정된 기기에 쥐를 두세요. 이 기간 동안 바퀴 회전을 시작하거나 전기 자극을 시작하지 마세요.
   6. 지속적인 얼음이나 과도한 양육 등 심한 스트레스 징후가 있는지 쥐를 관찰하세요. 비정상적인 행동을 보이면 쥐를 부드럽게 중앙 바퀴 부위로 옮겨 자연스러운 자세를 회복시키세요.
   7. 4일째에는 5분의 속도로 바퀴를 30분 동안 시작하세요. 이 단계는 전기 신호 없이 쥐들이 장치의 움직임 리듬에 적응하도록 돕습니다.
   8. 리듬 적응 단계에서 쥐가 떨어지거나 멈추면 수동으로 바퀴 중앙으로 유도하세요. 4일간의 적응 기간 내내 전기 자극이 비활성화된 상태를 유지하도록 하세요.
      주의: 적응 단계에서는 공포로 인한 스트레스 반응을 예방하고 향후 훈련 준수를 위해 전기 자극 사용을 피해야 합니다.
3. 공식 훈련 실행
   1. 정식 훈련은 매일 정해진 시간(예: 오전 9시–11시)에 실시하세요. 쥐를 회전근 피로 장치에 넣을 때 단열 장갑을 착용하세요.
   2. 장치 문 닫아. 12 rpm(~0.063 m/s)이라는 사전 설정된 파라미터를 시작하여 세션당 최대 2시간 동안 진행할 수 있습니다( 그림 1 참조).
      주의: 훈련 중에는 쥐를 지속적으로 관찰하세요. 쥐가 1분 이내에 3번 이상 계속 넘어질 경우, 심한 탈진과 스트레스로 인한 부상을 방지하기 위해 훈련을 5분간 중단하세요.
4. 피로 종점 결정 및 자극
   1. 쥐들의 피로 상태를 지속적으로 모니터링하세요. 쥐가 네 가지 특정 피로 기준 중 최소 두 가지를 충족한다면, 과도한 스트레스를 피하기 위해 2시간 전체를 강요하지 않고 훈련 세션을 일찍 종료하세요.
   2. 기준 1을 낙하하기 전에 5초 이상 주행 바퀴에 머무를 수 없는 것으로 정의하라. 기준 2를 1분 내에 3번 이상 현저히 증가한 낙하 빈도로 정의하라.
   3. 기준 3을 자발적으로 바퀴로 돌아가려는 의도가 없는 경우, 즉 마우스가 전기 자극에도 불구하고 움직이지 않거나 잠깐만 움직이는 경우로 정의하세요.
   4. 기준 4를 비정상적인 운동 자세의 표현으로 정의하세요. 팔다리가 끌리거나 비틀거리는 보행 같은 명백한 징후를 찾아보세요.
   5. 쥐가 스피너 입구에 떨어질 때 장치가 자동으로 가벼운 전기 자극을 작동하도록 허용하세요. 마우스가 휠¹¹로 돌아오면 전기 자극이 즉시 중단되도록 하세요.
      주의: 쥐가 경련이나 호흡곤란과 같은 이상 상태를 보일 경우 즉시 훈련을 중단하세요. 필요하다면 마우스를 기기에서 제거하고 증상 완화 치료를 하세요.
5. 훈련 후 처리 및 빈도
   1. 훈련이 끝나면 기기 전원을 끄세요. 쥐를 꺼내고 집 우리로 돌려보낼 때는 단열 장갑을 착용하세요.
   2. 쥐들에게 충분한 식수를 제공하세요. 동물의 비정상적인 활동, 정신 상태, 사지 문제(예: 간행 또는 근육 떨림)를 관찰하세요.
   3. 이상 징후를 기록하고 적시에 치료를 제공하세요.
   4. 이 훈련 빈도는 하루 1회, 세션당 2시간씩 4주 연속으로 유지하세요. 훈련 매개변수와 안전 모니터링을 기간 내내 일관되게 유지하세요.
      참고: 매일 훈련 전에 피로 장치와 전기 자극 모듈이 제대로 작동하는지 확인하여 일관된 자극 강도를 유지하세요.

4. 보행 분석

1. 시스템 개요
   1. 자동화된 보행 영상 시스템을 사용하여 보행 습득 및 분석을 수행합니다.
   2. 4주간의 모델링 기간 후 10주 된 C57BL/6 마우스 32마리에 대해 모든 보행 절차를 시행합니다.
   3. 고속 카메라를 투명한 러닝머신 벨트 아래에 위치시켜 이동 중 복부 이미지를 촬영하세요.
2. 적응 및 설치
   1. 모든 쥐를 러닝머신 장비에 적응시켜 정식 데이터 수집 전에 스트레스를 최소화하세요.
   2. 러닝머신 속도를 20cm/s로 설정해 쥐의 생리적 걷는 속도에 맞추세요.
   3. 쥐당 3건의 독립적이고 유효한 임상시험을 기록하며, 임상시험 사이에 2분의 휴식 간격을 두었습니다.
3. 시험 기록 및 보폭 선발
   1. 각 시도 동안 쥐가 60초 동안 계속 걷도록 허용하세요.
   2. 녹화가 '프리징', 점프, 회전으로 인해 유효하지 않을 경우, 교체 시험을 수행하세요.
   3. 마우스가 최소 10초 동안 안정적이고 일관된 이동을 달성한 후에만 데이터 수집을 시작하세요.
   4. 각 60초 시험에서 최소 4번의 연속된 완전한 보폭을 선택하여 분석합니다.
   5. 두 명의 독립적인 블라인드 관찰자가 보폭 선택을 수행하여 주관적 편향을 제거하세요.
   6. 쥐가 자연스러운 네 발 걷는 자세를 유지하는 것이 갑작스러운 속도 변화나 줄거리 없이 있는지 확인하세요.
   7. 보폭에 체중 지지 자세 단계와 전진 추진 스윙 단계가 모두 포함되는지 확인하세요.
   8. 손실, 흐림, 오염 없이 선명한 발바닥 벨트 접촉 이미지를 확인하세요.
4. 이미지 처리 및 매개변수 추출
   1. 시스템 소프트웨어에 내장된 알고리즘을 사용해 캡처된 이미지를 디지털화하고 발톱 벨트 접촉점을 감지하세요.
   2. 스윙/스탠스 비율을 스윙 페이즈 지속 시간과 스탠스 페이즈 지속 시간의 비율로 계산하세요.
   3. 한 번의 완전한 보폭 동안 이동한 선형 거리(cm)를 측정하세요.
   4. 보폭(cm)을 최대 스탠스 시 반대쪽 뒷발의 내측 가장자리 사이의 수평 거리로 측정하세요.
   5. 최대 체중 지지 시 총 접촉 면적을 나타내는 최대 스탠스 시점의 발바닥 면적(cm²)을 결정합니다.
   6. 발 면적 변동성(cm²)을 연속된 보폭에 따른 접촉면적 변동 계수로 계산합니다.
   7. 각 마우스에 대해 유효한 3가지 시도의 평균 값을 계산하고 최종 데이터셋을 내보내세요.
      참고: 불규칙한 정지, 점프, 방향 전환 행동이 있는 실험은 분석에서 제외합니다.

5. 조직학

1. 조직 채취 및 고정
   1. 4주 유도 기간 후 모든 쥐를 인도적으로 자궁경부 탈구로 안락사시키세요. 왼쪽 무릎 관절을 조심스럽게 해리하고 주변의 과도한 연조직을 제거합니다.
   2. 즉시 시료를 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정제(w/v)에 담가. 고정액 부피가 시료 부피의 10–15배에 달해 조직을 완전히 잠기도록 하세요.
   3. 조직을 실온에서 48시간 고정하세요. 고정 용기를 8시간마다 부드럽게 흔들어 충분한 고정 침투를 보장합니다.
2. 조직 탈석화
   1. 고정된 표본을 천천히 흐르는 물로 10분간 씻어내세요. 이 세척 과정을 세 번 반복하여 잔여 PFA를 제거합니다.
   2. 시료를 0.5mol/L 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 탈석화 용액(pH 7.2–7.4)에 옮깁니다. 탈석화 용액 부피를 시료 부피의 20배로 유지하고 4 °C에 보관하세요.
   3. 조직을 14일에서 21일간 탈석화합니다. 오래된 액체는 3일마다 신선한 EDTA 탈석화 용액으로 교체하세요.
   4. 탈석화 종점을 멸균 바늘로 부드럽게 연골하 뼈를 찔러 검사합니다. 바늘이 저항 없이 부드럽게 침투하면 탈석 과정을 마무리합니다.
   5. 완전히 석회화된 표본을 흐르는 물에 2시간 정도 세척하여 잔여 EDTA를 제거하세요. 이후 인산염 완충 식염수(PBS)로 3차례, 각각 5분씩 세척합니다.
3. 임베딩과 단면
   1. 석회화된 표본을 등급별 에탄올 시리즈(2시간당 70%, 80%, 90%, 1시간당 95%; 절대 에탄올 2회, 각각 1시간씩)를 사용해 순차적으로 탈수합니다.
   2. 탈수 조직을 자일렌에 두 번, 각각 10분씩 제거하세요. 클리어된 조직을 파라핀에 박으세요.
   3. 미세토임을 사용해 파라핀이 박힌 조직을 5μm 두께의 시상형 연속 단면으로 절단합니다. 단면을 폴리-L-라이신 코팅 유리 슬라이드에 장착하고, 60°C에서 슬라이드 건조 핫플레이트에서 2시간 동안 구워 주세요.
4. 조직형태학적 평가
   1. 관절 연골의 조직형을 평가하기 위해 사프라닌 O-fast 그린으로 절편을 염색합니다.
   2. 이중맹검 조건에서 골관절염 연구 학회 국제(OARSI) 점수 체계를 사용하여 연골 퇴행을 평가합니다¹².
5. 면역조직화학(IHC) 핵심 워크플로우
   1. 절편을 자일렌에 두 번씩 각각 10분씩 탈파라핀합니다. 등급 에탄올 시리즈를 통해 순차적으로 절벽을 탈이온수로 재수화합니다.
   2. 0.01 mol/L 시트레이트 버퍼(pH 6.0)에 절편을 담가 마이크로파 유도 열 에피토프 회재를 수행합니다. 버퍼를 고출력으로 끓일 때까지 가열한 후, 중간 출력으로 15분간 부드럽게 끓입니다.
   3. 섹션을 자연스럽게 실온으로 냉각하세요. 슬라이드를 PBS로 세 번, 각각 5분씩 세척하세요
   4. 절편을 3% 과산화수소(H2O2) 메탄올 용액에 20분간 실온에서 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 차단합니다. 슬라이드를 PBS로 세 번, 각각 5분씩 세척하세요.
   5. 5% 염소 혈청 차단액을 절면에 발라주세요. 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 실온에서 60분간 배양하세요.
   6. 차단액은 세탁하지 않고 버리세요. 특정 1차 항체 작용액(일시적 수용체 전위 바닐로이드 4(TRPV4)를 1:100, 카스파제-3(카스파제-3)를 1:200, 또는 콜라겐 II 알파 1(COL2A1)을 1:150 희석)로 적용하세요.
   7. 1차 항체와 함께 절편을 4°C의 가습 챔버에서 하룻밤 동안 12–16시간 배양하세요.
   8. 다음 날 30분간 상온에 맞춰 절면을 평형으로 만든 후, PBS로 세 번, 각각 5분씩 세척합니다. 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합 염소 항토끼 또는 항생쥐 IgG 2차 항체(1:500 희석)를 적용합니다.
   9. 2차 항체와 함께 상온에서 60분간 배양하세요. 슬라이드를 PBS로 세 번, 각각 5분씩 세척하세요.
   10. 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 염색체 용액을 적용하고 실온에서 어두운 곳에서 3–5분간 배양합니다. 현미경 관찰 하에서 맑은 갈색 신호가 나타나면 즉시 이온수로 반응을 멈추세요.
   11. 헤마톡실린 용액으로 5분간 부분을 반염색하세요. 흐르는 물에 10분간 헹구면서 얼룩이 파란색으로 변할 때까지 기다려 주세요.
   12. 1% 산성 알코올 용액으로 30초간 절면을 분리합니다. 슬라이드를 흐르는 물에 5분간 씻어내세요.
   13. 절편을 등급 에탄올 시리즈로 빠르게 탈수한 후, 조직을 자일렌에 두 번씩 각각 10분씩 제거합니다.
   14. 슬라이드를 중성 발삼으로 장착하고 광학 수지 커버슬립으로 덮으세요. 장착된 슬라이드는 실온에서 건조시킵니다.
6. IHC 제어 및 영상 분석
   1. 염색 과정에서 1차 항체를 PBS로 대체하여 음성 대조군을 확립합니다. 항체 효능을 검증하기 위해 알려진 양성 연골 조직 절편을 양성 대조군으로 포함하세요.
   2. 전체 슬라이드 스캐너로 40× 및 100× 배율로 착색된 단면 이미지를 획득하세요.
      참고: 주관적 편향을 줄이기 위해 최소 두 명의 맹검 관찰자가 모든 조직학적 평가를 독립적으로 수행하십시오.

6. 통계 분석

1. 데이터 처리 및 전반적인 테스트
   1. 모든 데이터 수집 및 분석을 블라인드 조건에서 수행하여 실험 편향을 최소화합니다.
   2. 네 실험군 간의 연속 변수를 분산 일방향 분석(ANOVA)을 사용하여 전체 차이를 검정합니다.
   3. 필요한 모수 가정을 충족하지 못하는 변수에 크루스칼-왈리스 H 검정을 적용한다.
2. 사후 검정 및 유의성 임계값
   1. 초기 ANOVA에서 통계적 유의성이 나타난다면 Tukey 검정을 사용하여 사후 쌍별 비교를 수행하여 특정 그룹 차이를 식별할 수 있습니다.
   2. 가족별 오류율을 통제하려면 오로지 Tukey 검사에만 의존하세요. 이와 함께 추가적인 다중 비교 보정 방법을 사용하지 마십시오.
   3. 통계적 유의성을 일관되게 p < 0.05로 정의한다

결과

보행 분석
보행 주기 매개변수: 스윙/스탠스 비율은 비체중 부하 스윙 단계와 단일 보폭의 체중 부하 자세 단계 간의 비율로 정의되며, 체중 부하와 추진력의 균형을 반영하도록 평가되었습니다. 대조군(2.10 ± 0.06)과 비교했을 때, 관절 내 콜라겐제 주사(1.45 ± 0.05)를 받은 쥐들이나 과도한 운동을 한 쥐(1.68 ± 0.05)는 유의미하게 낮은 스윙/자세 비율을 보였다. 이 감소는 콜라겐제+과다 운동군에서 가장 두드러졌으며(0.93 ± 0.05), 콜라겐제군 또는 과다 운동군 단독 그룹(p < 0.05)보다 더 두드러졌습니다( 그림 2 참조).

거리 매개변수: 거리 매개변수에는 보폭 길이(한 걸음 동안 전진 추진 거리)와 보폭(최대 스탠스 시 반대쪽 뒷발 내측 가장자리 사이의 수평 거리)가 포함되었습니...

토론

본 연구에서는 관절에 과도한 스트레스가 미치는 영향을 모방하는 KOA의 새로운 마우스 모델을 개발하여, 관절에 과도한 스트레스 주입과 바퀴 기반 피로 유발 운동 훈련을 결합하였습니다. 이러한 발견은 KOA가 생물학적 요인과 기계적 요인의 상호작용에서 비롯된다는 개념을 다시 한 번 입증합니다. 이러한 요인을 이해하고 식별하는 것은 무릎 골관절염 환자들의 증상 완화와 삶의 질 향상을 위한 개별화된 치료 계획과 예방 전략을 수립하는 데 큰 희망을^줍니다. 더불어, 콜라겐제는 힘줄과 인대 내 콜라겐 기역을 분해하여 관절 불안정성을 초래할 수 있습니다¹⁴. 과도한 운동은 기계적 과부하를 유발해 궁극적으로 KOA¹⁵를 유발할 수 있습니다. 이전 KOA 모델과 비교했을 때, 이 모델은 병원성 기전 면에서 인간의 기계적 유도 KOA와 더 유사했습니다. 더불어...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4% 파라포름알데히드 고정제	비요타임	P0099
아세트산	시노팜	631-61-8
쥐용 DigiGait 영상 시스템	RWD 생명과학	미-디-미스
EDTA 해법	프로셀	PB180320
카세트 삽입	라이카	IP C
에탄올	시노팜	64-17-5
빠른 녹색 착색	레얀	1085995
제모 크림	베트	G20161330
헤마톡실린	아다마스	61753A
고속 냉장 원심분리기	헤르멜	Z366K
인큐베이터	타이텍	M-210FN
흡입 마취기	레인저	RZ-바이킹
이소플루란	웹비오	W100
미세토름	테드 펠라	10180-220
마우스 회전자형 피로 장치	베이징 즈슈 다오바오 생물학 기술	YLS-10B
중성 발삼	시노팜	96949-21-2
사프라닌 오 스테인	바이오스	S0062
반자동 조직 임베딩 센터	써모피셔	히스토스타
슬라이드 건조 핫플레이트	전자현미경 과학	XH-2002
조직 부상 수조	바이오베이스	BT-I
제2형 콜라게나제	시그마-올드리치	C4-22-1G
전체 슬라이드 스캐너	라이카	아페리오 베르사
자일렌	시노팜	1330-20-7