방법 논문

산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석

534 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70637

⸱

2026년 3월 31일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 산화성 가자형상근에서 온전한 단일 근섬유를 분리하고, 이 섬유에서 유래한 고정제된 근모아 배양을 구축하는 과정을 설명합니다. 최적화된 절차는 마우스당 약 300–500개의 온전한 근섬유를 신뢰성 있게 얻어 하위 분자 및 세포 분석을 가능하게 합니다.

초록

골격근은 다핵 근섬유로 구성되어 있으며, 이 근육의 완전성과 기능은 움직임과 전반적인 건강에 필수적입니다. 신경근 질환에서는 근육군이 질병 유형과 단계에 따라 다르게 영향을 받을 수 있으므로, 기전적 연구를 위해 대표적인 근육에서 생존 가능한 단일 섬유를 분리하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 목적은 섬유 길이와 취약성 때문에 해리가 어려운 쥐 자자미근근(SOL) 근육에서 온전한 단일 근섬유를 고수량으로 분리하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공하는 것입니다. 콜라겐제 농도와 소화 시간을 최적화함으로써 섬유질 손실을 최소화하고 해리 중 생존력을 유지합니다. 최적화된 작업 흐름은 분리된 섬유에 잔여 조직의 부착을 현저히 줄여 비섬유 세포의 이동을 제한하고 교차세포 오염을 최소화합니다. 이 기술은 단일 섬유 분석뿐만 아니라 위성 셀 분리 및 이후 증식에도 최소한의 오염 조건에서 적합합니다. 이 최적화된 워크플로우를 사용하면, 우리는 고효율로 면역표지할 수 있고 섬유아세포 오염이 최소화된 고품질 위성 세포 집단을 생성할 수 있는 온전한 SOL 유래 단일 근섬유를 정기적으로 얻습니다. Extensor Digitorum Longus(EDL) 근육을 비교 분석하여 신경근질환 연구에서 치료법을 평가하는 데 있어 맞춤형 근육 특이적 접근법의 가치를 강조하여, 후보 약물 개입을 작고 조절 가능한 실험 시간 내에서 시험할 수 있음을 강조합니다.

서론

골격근은 인체에서 가장 풍부한 조직으로, 전체 체중의 약 40–50%를 차지합니다. 골격근은 글리코겐 형태로 에너지 저장소 역할을 합니다. 추운 노출 시 열생성을 통해 열을 제공하며, 무엇보다도 이동 수단을 제공합니다. 골격근은 다핵화된 유사분열 후 근섬유로 구성되어 있습니다. 근육 성숙과 수리를 유지하기 위해, 골격근의 주재 줄기세포인 위성 세포(SC)가 새로운 근핵을 생성합니다. 척추 섬유는 출생 후 골격근섬유 2,3,4의 말초에 위치합니다. SC는 전사 인자 Pax7로 식별되며, 이 인자는 휴면 상태와 활성화 상태 모두에서 발현됩니다 3,5. 손상이나 비대 자극 시 SCs는 근로증을 활성화하고 상향 조절하며, 근원성 프로그램에 진입하고 증식하며, 궁극적으로 기존 또는 새로 형성된 근섬유와 융합하여 근육 기능을 회복합니다 6,7,8. SC는 줄기 능력, 배아학적 기원(체성 섬유 vs 비체형), 출생 후 성장 단계(젊음 vs 노년), 근육 구성(빠른 섬유 vs 느린 섬유)에서 이질적입니다9,10,11.

신체 부위에 따라 골격근은 해당 부위의 에너지와 기능적 요구에 맞게 조정됩니다. 이러한 근육 섬유의 이질성은 수축성과 산화 능력 때문에 가능하다. 실제로 근섬유는 느린 근육 위축 산화 섬유(I형과 IIa형)와 빠르게 수축하는 당분해 섬유(설치류에서는 IIx형, IIb)로 구성되어 있습니다12,13. 이 아름답고 기능적인 섬유 모자이크 덕분에 우리는 일상생활에서 자유롭게 움직일 수 있습니다. 예를 들어, 자레근(SOL)과 척추 기립근과 같은 자세 근육은 만성적이고 저수준 활성화 상태에 있어 느린 산화성 I형과 II형 근섬유가 높은 비율을 포함하고 있습니다. 반면, 짧지만 빠르게 작용하는 근육인 장신근(EDL)은 주로 당분해성 IIx형과 II형 B형 섬유로 구성되어 있습니다. 하지만 섬유 구성은 고정되어 있지 않으며; 오히려 근섬유는 기능에 따라 빠른 속도에서 느린 속도로, 또는 그 반대로 이동할 수 있는 역동적인 구조입니다. 섬유질 수축력의 차이는 마이오신 단백질 함량 때문에 가능하다. 이 단백질은 골격근 내 주요 단백질로, 마이오신 경사슬과 중사슬12,14의 아이소폼으로 구성되어 있습니다.

근절(근육에서 힘을 생성하는 가장 작은 기능적 단위) 내부에서는 미오신 머리와 액틴이 상호작용하여 크로스브리지(crossbridge)라는 구조를 형성합니다. ATP의 가수분해를 통해 미오신과 액틴 상호작용의 순환에 의해 에너지가 방출됩니다15,16. 마이오신 중쇄(MyHC)는 섬유 유형 식별에 가장 적합한 지표입니다12,13. MyHC의 아이소폼에 따라 근육 수축 속도가 달라집니다. 앞서 언급했듯이, I형 섬유는 2형 섬유와 달리 산화가 느린 섬유입니다. 제1형 우성 근육군은 산화 효소가 더 풍부하고, 미토콘드리아가 풍부하며, 근육을 관류시키는 밀도 높은 모세혈관 네트워크를 가지고 있습니다(마라톤 러너를 생각하면 됩니다). I형 섬유는 MYH7 유전자에 의해 암호화됩니다13,19. 제2형 섬유는 피로에 빠르고, 당분해 효소 함량이 높으며, 최대 단축 속도가 더 높아 짧은 파워나 움직임에 이상적입니다(파워리프터를 생각하면 좋겠습니다). 설치류에서 Type-IIa, IIx, IIb의 Type-II 섬유는 각각 MYH2, MYH1, MYH4 유전자에 의해 암호화되어 있습니다20,21. 예상대로, 근육 건전성에 영향을 미치는 병태생리학적 손상은 섬유 유형 구성을 변화시키고 근육 기능에 부정적인 영향을 미치며, 잠재적으로 삶의 질을 저하시킬 수 있습니다. 실제로 많은 근이영양증은 위성 세포(위성 세포 오파리)나 근섬유(운동 신경세포 또는 근육 조직에서 유래)에서 시작되며, 섬유 구성유형에 변화를 일으킬 수 있습니다. 22, 23, 24, 25. 예를 들어, 척수 손상, 침상 안정 연구, 우주 비행(미세중력)은 장기간 비활동이 자세 근육을 느린 섬유형 표현형에서 빠른 섬유형 26,27,28,29,30으로 전환시키도록 촉발할 수 있음을 보여줍니다. 반대로, 뒤셴 근이영양증(인간 및 마우스 모델, mdx)에서는 빠른 당분해성 섬유가 느린 섬유보다 더 심각하고 더 심각하게 영향을 받습니다 31,32,33,34. 마찬가지로, 근상추상추상추 근이영양증(FSHD)에서는 I형 섬유의 비율이 더 높고 II형 섬유의 힘 생성이 감소하는 24,35,36에서 빠른 근육 전이가 관찰됩니다.

왜 특정 근섬유 유형이 특정 질병에서 선택적으로 영향을 받거나 제외되는지는 여전히 명확하지 않습니다. 이러한 패턴이 무작위적이지 않다는 사실은 단일 섬유 분리가 강력하고 널리 사용되는 기법으로 부상한 근본 메커니즘의 중요성을 강조합니다. 실제로 1980년대 중반 Bischoff37에 의해 처음 도입된 이 필수 도구는 지속적으로 개선되고 적응되어 근육 생물학 38,39,40의 정밀한 연구가 가능해졌습니다. 중요한 점은, 단일 섬유 분리가 심리섬유를 생리학적 지위에 최대한 가깝게 유지하여 분자 활성을 충분히 관찰할 수 있게 한다는 것입니다. Flexor digitorum brevis(FDB)와 EDL과 같은 근육군은 비교적 쉽게 추출할 수 있지만(41, 42, 43), SOL 근육은 온전한 섬유를 풍부하게 얻는 데 가장 어려운 근육 중 하나입니다. 이는 강성, 긴 섬유 길이, 손상에 취약하기 때문입니다. 이를 해결하기 위해 본 연구에서는 고품질의 생존 가능한 섬유 집단을 견고하게 생성하는 기술을 최적화하였습니다. EDL 섬유 분리와 결합하면, 이 접근법은 서로 다른 근육군에서 섬유 및 유도 세포(위성 세포, 근모세포, 근관)를 배양할 수 있게 합니다. 무엇보다도, 이 플랫폼은 다양한 근육 병리에 차별적으로 기여할 수 있는 분자 요인을 체계적으로 조사할 수 있게 하며, 근육 유형별 반응을 밝혀내고 궁극적으로 골격근 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원하는 방식으로 약물 개입을 검증하는 강력한 수단을 제공한다.

프로토콜

모든 동물은 도쿄도립대학 동물 시설에 보관되었습니다(허가 번호: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). 모든 동물은 특정 병원체 없는 상태(SPF) 조건 하에 관리되었습니다. 본 연구에서 사용된 동물 취급 및 실험 절차는 도쿄도립대학교 안전 윤리 위원회의 지침을 엄격히 준수하였습니다.

1. 시약 준비

  1. 항상 장갑을 끼세요. 25mL 원심분리관에서 고포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) + GlutaMAX, 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 현탁액(AB)과 함께 콜라게나제 1형 용액 0.5%를 준비합니다. 콜라게나제가 충분히 용해된 후(필요 시 튜브를 가볍게 두드려) 0.22 μm 저단백질 결합 필터를 통해 용액을 멸균합니다.
    참고: 콜라겐제 용액 2.5mL는 두 마리(한 마리 쥐)에게 충분합니다.
  2. 5% 소 혈청 알부민(BSA) 10mL를 인산 완충 식염수(PBS)에 조제합니다. 60 °C에서 30분간 열로 비활성화한 후, 0.22 μm 저단백질 결합 필터로 용액을 걸러냅니다.
    참고: PBS 용액 내 5% BSA는 최대 10일간 4°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 자레근 해리

  1. 근육 해부용 레이아웃 장비(그림 1A).
  2. C57BL/6 마우스를 복막 내 주사로 1 mg/mL 메데토미딘 하이드로클로라이드, 5 mg/mL 미다졸람, 5 mg/mL 부토르파놀 타르트레이트를 포함한 복막 내 주사로 마취한 후 경추 탈구로 안락사시킨다.
  3. 뒷다리에 순차적인 피부 절개를 하고 피부를 벗겨내세요. 표면 막막을 제거하세요.
  4. 플랜타리스(PLA) 힘줄을 비복근(GAS)과 자레우스(SOL) 힘줄 다발에서 분리하세요. PLA를 힘줄에서 당겨 부드럽게 제거하세요(그림 1B).
  5. GAS와 SOL 힘줄 다발을 잘라내고 근육을 노출하세요. GAS와 SOL 근위 힘줄 사이의 틈에 핀을 삽입합니다(그림 1C).
  6. 바늘을 원위 쪽으로 조심스럽게 밀어 SOL 근육과 GAS 근육을 분리합니다(그림 1D).
  7. GAS 쪽에서 힘줄 다발을 절단합니다(그림 1E).
  8. 가스에 의존하세요. SOL의 위치를 조심스럽게 조절하여 근위 힘줄을 노출시키고, 마이크로 가위로 절단하세요(그림 1F).
  9. SOL을 해부 테이블 위에 놓고 남은 힘줄을 제거하세요(그림 1G).
    참고: 이 단계는 선택 사항입니다; 남은 힘줄은 결과에 영향을 주지 않습니다.

3. 자레근의 소화

  1. 온전한 가자미를 준비된 0.5% 콜라겐제 용액이 담긴 25mL 원심분리관으로 옮깁니다. 37°C에서 130분간 배양하세요.
    참고: 15분에서 20분마다 샘플을 수동으로 교반하여 섬유를 약간 분리하고 콜라겐제 활성을 지원할 수 있습니다.

4. 입체 현미경 하에서의 단일 섬유 분리

  1. 파스퇴르 피펫 두 개를 잘라 하나는 넓은 구경, 다른 하나는 좁은 구멍을 가졌습니다(그림 2A). 불 속에서는 근육 손상을 방지하기 위해 구멍을 소독하고 매끄럽게 하세요.
  2. 격리 중 섬유 부착을 방지하기 위해 Pasteur 피펫과 50mm 페트리 접시 3개에 5% BSA/PBS를 코팅하세요.
    참고: 격리 단계 전반에 걸쳐 입체현미경(그림 2B)이 사용되었습니다.
  3. 근육 소화 후에는 과도한 콜라겐제 용액을 버리고 자형상어를 1% AB가 포함된 첫 번째 DMEM 접시로 옮깁니다(그림 2C).
  4. 광구경 파스퇴르 피펫을 사용해 섬유를 부드럽게 위아래로 헹구어 해리합니다(그림 2D).
  5. 좁은 구경의 파스퇴르 피펫을 사용하면, 근육 섬유 길이를 따라 온전한 단일 섬유를 두 번째 접시로 옮깁니다. 이 기회를 이용해 이물질이나 줄어든 섬유를 제거하세요(그림 2E, F).
  6. 고품질(전체 길이/온전한) 단일 섬유를 좁은 구경의 파스퇴르 피펫으로 세 번째 접시로 옮겨 순도를 보장한다(그림 2G,H).
  7. 섬유를 BSA 코팅된 25mL 원심분리관에 모으세요. 현탁액을 부드럽게 저은 후 실온에서 5분간 두어 섬유가 튜브 바닥에 침전되도록 하세요.
  8. 좁은 구경의 파스퇴르 피펫을 사용해 상정액을 조심스럽게 버리고 남은 이물질을 제거합니다. 약 500 μL의 DMEM과 1% AB 용액을 남겨둡니다. 이 침전물에는 고도로 정제된 단일 근섬유 집단이 포함될 것입니다(그림 2G,H).
    참고: 이 기술은 300개의 단일 섬유를 얻을 수 있으며>, 단백질 및 mRNA 추출 및 후속 분석에 사용할 수 있습니다.

5. 가자치사 섬유에서 고도로 정제된 근모세포 배양 설립

  1. 마트리젤 매트릭스를 0.1 mg/mL로 희석하여 100mm 배양 접시를 코팅합니다. 접시를 37°C에서 30–60분 동안 배양하여 코팅이 고르게 중합될 때까지 보관하세요.
  2. 같은 양의 Accutase를 근섬유 현탁액에 넣고 실온에서 10분간 배양하세요. 그 후 10mL의 성장 배양액(30% 태아 소 혈청, 1% GlutaMAX, 1% 닭 배아 추출물, CEE, 1% AB, 0.01 μg/mL 기본 섬유아세포 성장 인자 bFGF)을 포함한 무포당 DMEM으로 구성)44를 추가합니다.
    참고: 이 경우 동일한 양의 Accutase는 4.8절에 설명된 500 μL입니다. Accutase는 근섬유의 부드러운 해리를 촉진하고 위성 세포를 방출하여 근모세포 배양의 후속 확장을 지원합니다.
  3. 10mL의 Accutase 처리된 근섬유 현탁액을 Matrigel 코팅된 접시에 옮기세요. 약 4개의 단일 섬유가 100mm 배양 접시에첨가됩니다. 섬유가 배양 접시 전체에 고르게 퍼져 있는지 확인하세요.
  4. 배양지에서 3일 동안 배양하면 근모세포 군락이 관찰됩니다. 근모세포가 필요한 개체 수에 도달할 때까지 매일 배양지를 교체하세요. 보통 6일째에는 근모세포 배양이 실험 단계에 충분히 합쳐져 있습니다(그림 3A).
  5. 트립신을 사용해 원래 배양 배양 배열에서 근모세포를 분리하고 37°C에서 2분간 배양합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 근형성 진행에 필요한 웰 크기와 세포 융합 정도에 따라 세포 수를 세고 씨앗을 심습니다.
    참고: 100mm 접시의 경우 트립신 1mL를 추가하세요.

결과

우리 기술은 자자미근(SOL)과 장두근(EDL) 근의 분리된 섬유가 Pax7에 대해 효율적으로 면역표지할 수 있음을 입증합니다(그림 3B). 이 분리된 섬유는 부유 배양 배지(DMEM + GlutaMAX와 10% 말 혈청, 1% AB, 0.5% CEE 포함)에 3일간 보관한 후 면역 표지(그림 3B)를 할 수 있습니다. 플로팅 섬유를 4일 이상 보관하는 것은 권장하지 않습니다. 설명된 부유 섬유 조건에서는 근섬유가 이 시간 이후에 뭉치는 경향이 있어 이후 면역 표지 분석에 불리합니다.

제시된 기술은 근원 프로그램 전반에 걸친 면역블롯팅에도 추가로 활용될 수 있습니다(그림 3C). 실제로 SOL과 EDL 유래 근모세포는 약 70% 합류율에서 24웰 플레이트에 플레이트되었습니다. 세포는 성장 배양지에서 1일간 유지되었고(근아세포), 또는 2일 또는 4일간 분화하도록 유도되었으며(각각 조기 형성 및 분화 근관) 사용되었습니다. 면역블롯 분석을 위해 단백질 5 μg가 적재되었습니다.

MyHC I 발현은 SOL 유래 근섬유에서 거의 특이적으로 발현되었으며, 근관에서는 거의 발현되지 않았고 근아세포에서는 거의 발현되지 않았습니다(그림 3C). MyHC II는 SOL과 EDL 근섬유 모두에서 발현되었습니다. 이 표현은 주로 I형과 IIa형으로 구성된 SOL을 반영하며, EDL은 주로 IIx와 IIb 섬유로 구성됩니다. 근모세포는 MyHC II를 발현하지 않았으나, 분화 과정에서 점진적으로 발현이 증가했습니다. 산화성 관련 단백질인 PGC-1α와 COXIV는 SOL 유래 섬유에서 기대되는 더 높은 발현을 보여주었습니다. 또한, 분리된 SOL 섬유에서 EDL 섬유보다 GLUT4의 발현이 더 높게 검출되었습니다. 골격근 생물학자들이 직면할 수 있는 문제 중 하나는 α-튜불린, β-액틴, GAPDH, 그리고 폰소 S를 포함한 총 단백질 염색과 같은 널리 사용되는 하우스키핑 단백질과 부하 조절 장치가 근모세포, 근관, 고립된 근섬유 사이에서 안정적이지 않으며, 각각 뚜렷한 변동성을 보인다는 점입니다. α-튜불린과 β-액틴의 신호 강도는 근관에서 가장 높았으나, 폰소 S 염색은 근아세포에서 상대적으로 약했다. 반면, GAPDH는 EDL 근섬유에서 더 강한 발현을 보였습니다. 그럼에도 불구하고 실험적 목적에 따라 이러한 하우스키핑 단백질 중 하나가 여전히 적용될 수 있으며, 또는 열충격 단백질 70(HSP70)과 같은 정규화 인자를 탐색할 수도 있습니다.

그림 1
그림 1. 자레근 해리. (A) 해부에 필요한 장비. 1: 미세 가위, 2: 미세 겸자, 3: 해부 가위, 4: 해리 핀. (B) PLA 힘줄이 GAS와 SOL 힘줄 다발에서 절단되었습니다(노란 화살표). 원위 PLA(흰색 화살표) 힘줄은 겸자로 들어 올렸습니다. (C) 해리 핀이 SOL(빨간 화살표)과 GAS(초록 화살표) 근위 힘줄 사이 공간에 삽입되었습니다. (D) SOL은 해부 핀을 사용해 GAS에서 분리되었다. (E) GAS 및 SOL 힘줄 다발은 GAS 쪽에서 절단되었습니다. (F) SOL 근위 힘줄을 마이크로 가위로 절단했습니다. (G) 추가적인 원위 힘줄 다발이 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2
그림 2. 자궁근 섬유 분리. (A) 격리에 필요한 장비. 1: 구경이 좁고 2호: 구경이 넓은 파스퇴르 피펫. (B) 격리에 사용되는 입체 현미경. (C) 콜라겐아제 소화 자미근사무늬가 1% AB와 함께 DMEM으로 옮겨졌다. (D) 첫 10번의 세척 후 자자미근 섬유가 근육에서 해리됨. (E) 단일 섬유가 두 번째 접시로 옮겨집니다. (F) 깨끗한 섬유가 제거된 이물질과 줄어든 섬유를 보여주는 이미지. (G) 이물질 없는 단일 섬유가 세 번째 접시로 옮겨집니다. (H) 온전한 단일 섬유가 명확히 보입니다. 스케일 바 = 10 mm. 이 도표의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3
그림 3. 세포 배양 확장과 EDL 및 SOL 유래 샘플 분석. (A) 분리 후 6일 후, 증식 배양 샘플은 분리된 자자미근섬유에서 얻은 순수한 근아세포 배양을 보입니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) SOL 및 EDL 유래 단일 섬유는 분리 직후 또는 3일 후에 Pax7(녹색)에 대한 면역표지된 위성 세포를 보여줍니다. MyoD(빨간색)가 없다는 것은 위성 세포가 아직 근생성 활성화에 참여하지 않았음을 확인시켜 줍니다. 섬유는 DAPI(파란색)로 카운터 염색을 처리했습니다. 이후 형광 현미경으로 세포를 관찰했습니다. 스케일 바 = 20 μm. (C) 5 μg의 단백질이 근모세포, 근관, 근섬유 유래 샘플의 면역블롯에 사용되었습니다. 면역블롯 패널에서는 MyHC I, MyHC II, PGC-1α, Cox IV, GLUT4, α-튜불린, β-액틴, GAPDH가 하우스키핑/정규화 표적으로 발현된 것으로 나타났습니다. Ponceau S 염색은 총 단백질 적재 조절제로 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

가자미근에서 많은 근육 섬유를 분리하는 첫 번째 핵심은 해리 중 근육의 구조적 완전성을 유지하는 것입니다. SOL의 상근균이 찢어지거나 근육이 특히 종축을 따라 강하게 당겨지면 분리 수율이 크게 저하됩니다. 이러한 해부 오류는 보통 나중에 쉽게 식별할 수 있습니다. 실제로 콜라겐제 소화 후 근육은 균일하게 수축되어 흰색의 조밀한 덩어리를 형성합니다. 이러한 조건에서는 매우 소수의 생존 가능한 섬유만이 해리될 수 있습니다.

가자매근 분리의 두 번째 결정적 요소는 제1형 콜라겐제 소화의 효율성입니다. 콜라겐제가 최적의 기능을 할 때, 첫 10번의 세척 세션 동안 약 100–200개의 가자미 섬유를 얻을 수 있습니다. 반면, 소화가 최적이 아니면 처음 20번 세척 후에도 50개 미만의 섬유질이 방출될 수 있습니다. 더 높은 섬유 수율을 얻기 위해서는 더 강한 세척과 추가 세척 사이클이 필요합니다. 하지만 SOL 섬유는 매우 약하기 때문에 세척 시 섬유가 수축하는 경우가 많습니다.

순수 SOL 유래 1차 근모세포 배양을 구축하기 위해 콜라겐제 소화가 다시 중요한 역할을 합니다. 소화가 효율적일 때는 잔류 조직에 붙은 섬유가 줄어들고, 섬유를 배양지로 옮기면 섬유아세포 오염이 최소화됩니다. 반면, SOL이 제대로 소화되지 않으면 해리된 섬유가 잔류 조직에 붙어 근모세포 배양을 섬유아세포로 오염시킵니다. 연구자들은 시드 세포 샘플에서 섬유아세포 오염의 전형적인 징후를 찾아야 합니다; 여기에는 부착된 마트리젤 코팅 접시의 훨씬 작고 방추형 위성 세포에 비해 훨씬 큰 세포 크기와 광범위한 세포골격 돌출이 포함됩니다. 오염이 발생할 경우, 연구자들은다른 곳에서 설명한 대로 세포에 사전 플레이트 과정을 적용할 수 있습니다. 간단히 말해, SC는 분리 후 3일간 배양한 후 트립신 추출 후 콜라겐 코팅 접시에 미리 접시됩니다. 15–30분 배양 동안 섬유아세포는 부착되고 SC는 부유된 상태로 유지되어 신선한 마트리겔 코팅된 플레이트로 옮겨집니다.

앞서 언급했듯이, 그리고 우리의 경험과 일치하듯, SOL 섬유는 긴장신근(EDL)과 신근 신근(FDB)의 섬유보다 길고 더 연약합니다. 이로 인해 파스퇴르 피펫을 이용한 섬유 전달이 어렵습니다. 섬유는 중앙에서 끌어내기보다는 세로 축을 따라 흡입하는 것이 필수적입니다; 그렇지 않으면 섬유가 접히고 응력에 의해 수축합니다. 섬유 격리가 성공하는지 직접 결정하는 결정적 요인 외에도, 가자미 섬유 수량을 향상시키기 위해서는 몇 가지 추가적인 기술적 단계가 필수적입니다. 그중 하나는 모든 파스퇴르 피펫, 접시, 수집관에 5% BSA를 코팅하는 것입니다. 이로 인해 새로 해리된 근섬유가 표면에 달라붙는 것을 막아 섬유 접힘과 그에 따른 수축을 방지합니다. 근육 샘플을 분리할 때마다 새로운 열 멸균 BSA 코팅 파스퇴르 피펫을 준비하는 것이 권장됩니다. 또는 연구자들이 장기 사용을 위해 파스퇴르 피펫 세트를 준비할 수도 있습니다. 그렇다면 매번 열 살균하고 사용 전에 BSA로 새로 코팅하세요.

단일 근섬유 분리의 기존 프로토콜은 주로 FDB 및 EDL37과 같은 당분해 근육에 최적화되었습니다. 하지만 SOL과 같은 산화 근육은 구조적으로 구별됩니다. 전사체 분석 결과, 골격근의 세포골격 연결 단백질인 디스트로핀과 같은 유전자를 포함하여 세포외기질(ECM) 관련 유전자 발현이 SOL과 EDL46 간에 차이가 있음을 보여주었습니다. 따라서 0.2% (2 mg/mL) 콜라겐제로 60–90분 동안 EDL 근육 소화를 하는 표준 조건은 SOL 근육에 최적이 아니어, 소화 후 섬유 다발이나 섬유가 줄어드는 현상을 초래합니다. 본 연구에서는 산화성 SOL 근육에 맞게 프로토콜을 조정하기 위한 여러 핵심 단계를 최적화했습니다. 제1형 콜라겐제 농도를 0.5%(5 mg/mL)로 조절하고, 잠복 기간을 130분으로 연장하며, 세척 중 기계적 스트레스를 최소화함으로써, 한 마리 마우스로부터 300–500개의 온전한 섬유를 일관되게 얻을 수 있습니다. EDL과 비교했을 때, SOL 샘플의 섬유 수와 수율은 여전히 적으며(EDL은 > 500개의 섬유를 얻을 수 있습니다); 그럼에도 불구하고, SOL에서 유래한 섬유의 섬유 수와 무엇보다도 높은 품질은 견고하여 면역표지나 면역블로팅과 같은 후속 응용에 적합합니다. 비록 저희의 면역블롯팅 결과는 단일 섬유 샘플을 모은 것이었지만, 본 보고서에서 제시된 기법은 온전한 개별 섬유를 신뢰성 있게 추출할 수 있어 면역블롯, 단백질체학, RNA-시퀀싱47과 같은 후속 응용 분야에 단일 섬유 해상도로 적합합니다. 이 분야의 연구자들은 이 기술을 이용해 산화성 근섬유와 당분해성 근섬유 간의 대사 및 수축 차이를 연구할 수 있습니다.

전반적으로 이 프로토콜은 가자미근에서 온전한 산화 섬유를 분리하는 재현 가능하고 접근 가능한 방법을 제공하여, 근섬유 유형별 생리학과 분자 메커니즘을 조사할 수 있는 도구 상자를 확장합니다.

공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 과학기술 혁신 창출을 위한 대학 펠로우십 설립(JST, 연구비 번호) JPMJFS2139 to T.H.) 일본학술진흥회(KAKENHI 23H00457, N.L.F.에 수여, 20J12849 Y.Mi., 24K22254 Y. Ma 보조금)를 받았습니다. 이 연구는 또한 도쿄도 정부의 고등연구비[R2-2](Y.Ma., N.L.F.)와 TMU 혁신 연구 프로젝트 전략 연구 기금[R3]의 지원을 받았습니다. 후루이치 야스로의 조언과 유용한 의견에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12제품 이름: Vetorphale 주사
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816제품 이름: Dorbene 주사
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100제품 이름: Dormicum 주사
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Equipment
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100원고에서는 Petri 접시로 언급됨
Anbitodies for immunolabelling
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Anbitodies for immunoblotting
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ horseradish peroxidase
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ horseradish peroxidase
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg coactivator 1 alpha
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

참고문헌

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  3. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).
  4. Zammit, P. S., et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells. J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).
  5. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  6. Günther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  7. Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One. 4 (4), e5205(2009).
  8. Halevy, O., et al. Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).
  9. Biressi, S., Rando, T. A. Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).
  10. Zammit, P. S. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others. J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).
  11. Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research. Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).
  12. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  13. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  14. Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).
  15. Guth, L., Samaha, F. J. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle. Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).
  16. Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. Role of scavengers in providing non-material contributions to people. Ecol Indic. 117, 11(2020).
  17. Sullivan, S. M., Pittman, R. N. Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles. Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).
  18. Fujita, N., et al. Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia. PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).
  19. Narusawa, M., et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle. J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).
  20. Faerman, A., Shani, M. The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis. Development. 118 (3), 919-929 (1993).
  21. Denardi, C., et al. Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene. J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).
  22. Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).
  23. Talbot, J., Maves, L. Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).
  24. Celegato, B., et al. Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes. Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).
  25. Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies. Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).
  26. Gallagher, P., et al. Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles. Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).
  27. Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion. Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).
  28. Shenkman, B. S. From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype. Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).
  29. Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading. J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).
  30. Higashino, K., et al. Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats. J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).
  31. Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 52 (4), 503-513 (1988).
  32. Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).
  33. Rafael, J. A., et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).
  34. Kotelnikova, E., et al. Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy. PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).
  35. Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7. EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).
  36. Lassche, S., et al. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).
  37. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
  38. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
  39. Collins, C. A., Zammit, P. S. Isolation and grafting of single muscle fibres. Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).
  40. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  41. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).
  42. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  43. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).
  44. Omairi, S., et al. Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres. Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).
  45. Moyle, L. A., Zammit, P. S. Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells. Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).
  46. Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice. BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).
  47. Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus. Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).

재인쇄 및 허가

태그

산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.