선형 이온 트랩 질량분석법을 기반으로 한 화오샹 정기 경구 액체 내 미확인 화합물 구조 분석의 기술적 접근법

Summary

여기서는 다단계 질량분석기와 화향정기(Huoxiang Zhengqi) 경구용 액체를 기반으로 한 단편화 과정을 결합한 표준 프로토콜을 보여줍니다.

Abstract

중국 한방 화합물(CHC)은 중국 의학에서 대체 불가능한 역할을 하며, 그 복잡한 성분을 규명하는 것이 최근 몇 년간 중요한 연구 초점이 되었습니다. 화향정기(Huoxiang Zhengqi) 경구용 액체는 분자 수준에서 화학 조성이 추가적인 연구가 필요한 고전적인 중국 특허 의약품입니다. 전통적인 질량분석기(time of-flight and Orbitrap)는 일반적으로 2차 파편 정보만 제공합니다. 선형 이온 트랩 질량분석기를 기반으로 화합물을 더 철저하게 분해하여 더 깊은 조각 정보를 얻을 수 있었습니다. 본 논문은 시료 전처리, 초고성능 액체 크로마토그래피 준비, 질량 분석법 준비, 전스펙트럼 시험, 2차 질량 분석법, 다단계 질량분석법 및 결과 분석을 포함하는 CHC 내 미확인 화합물에 대한 구조 탐구 기법을 개발합니다. 대표적인 결과는 복합 구조의 유도 과정을 보여줍니다. 이성질체, 폴리하이드록시 화합물, 기기 해상도 등 실험 기법에 영향을 미치는 요인들에 대해 논의합니다. 다단계 질량분석법을 통해 미확인 화합물의 미세 분자 구조를 도출한 결과, 확립된 실험 방법은 전통 중의학에서 생리활성 소분자의 구조 특성 규명과 약리학적 메커니즘과의 연관성에 다재다능하고 적용 가능합니다.

Introduction

중국 한방 화합물(CHC)은 전통 중의학(TCM)의 귀중한 자산으로서 수천 년에 걸친 검증된 임상 경험을 축적해 왔습니다^. 이들은 질병 예방, 치료 개입, 재활 분야에서 대체 불가능한 역할을^{수행합니다.} 다중 허브 시너지를 통해 CHC는 인체를 전체적으로 치료하며, 전체론과 증후군 차별화 기반 치료의 핵심 원칙을 실현합니다^. 현대 의학 체계 내에서 CHCs는 다표적 경로를 관여하는 다약물학적 메커니즘으로 전 세계적으로 인정받고^{있으며, 소}화 장애, 호흡기 감염, 면역조절 등 광범위한 응용을 지니고 있습니다^. 화향 정기(HXZQ)는 고전적인 CHC 제형의 전형^입니다. 이 조성은 파출리, 페릴라 잎, 당골 다후리카, 아트라크틸로데스, 포리아, 말린 귤 껍질 등 여러 약용 허브를 통합합니다. 이 식물은 땀을 내고, 열 제거하며, 습기를 해소하며, 비장 위장 강화 효과를 부여하는 것으로 유명합니다⁷. HXZQ는 습기성 인플루엔자 유사 증후군, 상복부 팽창, 구토, 설사 질환에 임상적으로 적용됩니다^. 기술의 발전으로 CHC 연구는 현상학적 관찰에서 분자, 기전, 화합물 수준 연구로 전환^{되었으며, 프로}테오믹스와 대사체학 기법을 활용해 활성 성분을 규명함으로써 TCM 세계화의 과학적 토대를 마련하고 있습니다. 따라서 HXZQ의 화학 성분과 약역학에 대한 엄격한 분석은 CHC 표준화를 진전시킬 뿐만 아니라 혁신적인 신약 개발을 촉진합니다^.

HXZQ는 복합 식물 성분¹¹에서 비롯된 고유한 화학적 복잡성을 가진 다중 허브 제형입니다. 휘발성 오일, 쿠마린, 리그난, 다당류, 알칼로이드 등 다양한 식물화학적 계열로 특징지어지는 HXZQ는 잘 특성화된 생리활성 화합물과 구조적으로 주석이 없는 상당한 구성 요소 풀을 포함하고 있습니다¹². 주요 성분(예: 휘발성 오일, 플라보노이드, 알칼로이드)의 동적 변동은 추출 프로토콜과 저장 조건의 차이로 인해 발생할 수 있으며, 이는 체계적인 화학 프로파일링의 중요성을 강조합니다^. 전통 중의학(TCM) 현대화의 틀 안에서, HXZQ와 같은 고전 제형의 심층 조성 분석은 치료 효능의 소재를 명확히 할 뿐만 아니라 품질 관리, 표준화된 제조, 부작용 모니터링에 대한 실증적 지원도 제공합니다¹⁰. HXZQ의 고분비 화합물은 광범위하게 문서화되었으나, 그 화학 성분의 상당 부분은 아직 특성화되지 않았습니다¹³. 구성 요소의 구조적 다양성과 많은 잠재적 생활성 분자의 낮은 함량은 크로마토그래피나 분광학과 같은 기존 분석 기법만으로는 포괄적인 식별에 큰 도전을 제기^합니다. 특히, HXZQ에서는 쿠마린, 리그논, 다당류 등 여러 식물화학적 계열에서 이성질체가 널리 퍼져 있어 구조적 분화를 더욱 복잡하게 만듭니다¹⁵. 정확한 복합물 주석의 추가 장애물로는 낮은 분석 물질 함량과 매트릭스 간섭 효과가 있습니다. 이 요소들은 HXZQ 연구의 핵심 영역, 즉 전체 화학적 순체를 정밀하고 고범위하게 식별하기 위한 견고한 분석 전략 개발을 강조합니다.

현대 질량분석(MS) 플랫폼은 복잡한 행렬을 특성화할 때 이온 공용(coilution arties)과 불완전한 스펙트럼 데이터베이스 커버리지 등 본질적인 한계에 부딪힙니다. 이러한 맥락에서 탠덤 질량분석법(MS/MS)과 다단계 질량분석법(MSⁿ)은 미^{지의 화}합물에 대한 새로운 구조 규명을 위한 필수적인 분석 전략으로 부상했습니다. 쿼드러폴 비행 시간(Q-TOF) MS와 오비트랩 MS와 같은 기존의 고해상도 MS 시스템은 고품질 MS/MS 조각 데이터를 생성하지만, 그 유용성은 단일 단계 단편화 이벤트에 한정됩니다. 이러한 한계에도 불구하고, 이 플랫폼들은 특히 복잡한^{혼합물을 분석}할 때 뛰어난 감도와 해상도로 풍부한 구조적 통찰을 제공합니다. 반면, 선형 이온 트랩(LIT) MS는 다단계 충돌 유도 해리(CID) 모드를 사용하여 분자 이온의 순차적이고 반복적인 단편화를 가능하게 합니다. 이 독특한 기능은 복합물 골격과 작용기의 단계적 해부를 가능하게 하여, 구조적으로 다양한 미지의 분석물의 명확한 질적 식별을 가능하게 합니다^. 복잡한 CHC 매트릭스의 포괄적인 특성화에 대한 충족되지 않은 필요성을 해결하기 위해, 본 연구는 미지의 화합물 식별에 맞춘 LIT-MS 기반 분석 워크플로우를 제시합니다. LIT의 높은 이온 포획 효율과 빠른 스캔 속도를 활용하여 이 접근법은 신규 구조 주석의 처리량과 정확성을 향상시킵니다. 이 워크플로우를 HXZQ에 적용하는 목적은 다음과 같습니다: (1) HXZQ에서 특성화되지 않은 화학 성분을 프로파일링하는 기존 방법론을 보완하고; (2) 다른 CHC 공식화에 대한 표준화 연구를 지원할 기술적 틀 구축; 그리고 (3) 경험적 실천에서 근거 기반의 정밀 의학으로의 중의학 전환을 가속화하는 것.

Protocol

1. 샘플 전처리

1. 상업용 HXZQ 포장을 열어보세요. 정확히 0.1 mL의 HXZQ를 2 mL 샘플 병에 옮긴 후 0.9 mL의 물을 추가하세요. 용액을 완전히 섞을 때까지 흔들면 됩니다.
2. 주입용 주사기(1 mL)와 미세다공성 막 필터(0.22 μm)를 준비합니다. 용액을 2mL 샘플 병에 걸러서 넣으세요.
   참고: 실험 절차 중에는 적절한 개인 주의를 기울이시기 바랍니다.

2. 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 준비

1. Xcalibur 소프트웨어를 더블 클릭하세요. 다운로드 준비를 클릭한 후 직접 제어 버튼을 클릭하세요. 팝업 창에서 펌프 모듈 열을 클릭하고, %B를 50, %C를 0, %D를 0으로 설정하세요(그림 1).
2. 모터 버튼을 클릭하면 켜짐 상태로 전환됩니다. 더 많은 옵션 버튼을 클릭하고, 팝업 창에서 유량을 5 [mL/min], 시간을 180 [s]로 설정하세요. Purge 버튼을 클릭한 다음, 팝업 창에서 OK 버튼을 클릭하세요.
   참고: 크로마토그래피 컬럼이 없을 때 50% A(0.1% 제형산 용액)와 50% B(아세토니트릴)를 사용하여 이동상은 분당 0.3 mL로 일정합니다. 기본 주입량은 보통 1 μL입니다.

3. MS 준비

1. 소프트웨어 메인 창으로 돌아가서 시 퀀스 설정 뷰 버튼을 클릭하세요. 이미 편집된 템플릿을 가져오려면 Open 버튼을 클릭하고, 메서드 이름을 우클릭한 후 Open File 버튼을 클릭하면 메서드 파일을 엽니다.
2. 팝업 Instrument Setup 창에서 첫 번째 질량(m/z)을 100, 마지막 질량 (m/z)을 1200으로 설정하세요. 저장 버튼을 클릭하여 방법을 저장하세요.
   참고: 기본 MS 조건에는 이온 소스 온도 350°C, 초기 MS 범위 80 – 1200 도서, 충돌 유도 해리(CID) 충돌 모드, 충돌 에너지 35도서가 포함되었습니다.

4. 전면 MS 검사

1. 실행 순서 버튼을 클릭한 다음, 팝업 창에서 확인 버튼을 클릭하세요. 샘플 주입이 완료될 때까지 기다립니다(그림 2).
   참고: 검사 전에 2mL 샘플 병을 기기의 샘플 트레이에 넣어 주세요.
2. 로드맵 뷰 버튼을 클릭하고 Qual 브라우저 아이콘을 클릭하면 Qual 브라우저 창을 열게 됩니다. 열기 버튼을 클릭하고, 폴더 내 .raw 형식의 데이터 파일을 선택한 뒤 더블 클릭으로 파일을 열어보세요.
3. 크로마토그램 창을 우클릭한 후 범위 버튼을 클릭하세요. 스캔 필터 섹션에서 ESI Full MS를 선택하세요. 플롯 유형 섹션에서 TIC를 선택하세요. OK 버튼을 클릭하면 창에 샘플의 총 이온 크로마토그램이 표시됩니다.
4. 질량 스펙트럼 창 오른쪽 상단의 푸시핀 버튼을 클릭하세요.
5. 크로마토그램 창에서 클릭하고 슬라이드하여 상대적 풍부도가 가장 강한 시간 영역 을 선택하세요. 질량 스펙트럼 창은 해당 질량 스펙트럼 이온을 표시합니다. 다음 단계 질량분석법을 위해 m/z 값을 기록하세요.

5. MS/MS 검사

1. 기기 설정 창으로 돌아가기. n=2 행의 부모 질량 열에 이전 단계에서 기록된 화합물의 m/z 값을 입력합니다. 저장 버튼을 클릭하여 방법을 저장하세요.
2. 소프트웨어 창으로 돌아가기. 시퀀스 설정 보기 버튼을 클릭하고, 파일 이름을 수정한 후 저장 버튼을 눌러 시퀀스를 저장하세요.
3. 실행 순서 버튼을 클릭한 다음, 팝업 창에서 확인 버튼을 클릭하세요. 샘플 주입이 완료될 때까지 기다려.
4. 퀄 브라우저 창으로 돌아가기. 열기 버튼을 클릭하고, 폴더 내 .raw 형식의 데이터 파일을 선택한 뒤 더블 클릭해 파일을 열면 됩니다
5. 크로마토그램 창을 우클릭한 후 범위 버튼을 클릭하세요. 스캔 필터 섹션에서 ESI Full MS를 선택하세요. 플롯 유형 섹션에서 TIC를 선택하세요. OK 버튼을 클릭하면 창에 샘플의 총 이온 크로마토그램이 표시됩니다.
6. 질량 스펙트럼 창 오른쪽 상단의 푸시핀 버튼을 클릭하세요.
7. 크로마토그램 창에서 클릭하고 슬라이드하여 상대적 풍부도가 가장 강한 시간 영역 을 선택하세요. 질량 스펙트럼 창은 해당 질량 스펙트럼 이온을 표시합니다. 다음 단계 질량분석법을 위해 m/z 값을 기록하세요.

6. MSⁿ 검사

1. 기기 설정 창으로 돌아가세요. n=3 행의 Parent Mass 열에 이전 단계에서 기록된 화합물의 m/z 값을 입력합니다. 저장 버튼을 클릭하여 방법을 저장하세요.
2. 샘플 주입과 데이터 뷰를 완료하기 위해 4.2부터 4.5까지 단계를 반복합니다. 안정적인 조각 이온이 관찰되지 않으면 MSⁿ 분석을 중단하세요.

7. 매개변수 최적화

1. 기기 설정 창으로 돌아가세요. Act 유형 열에서 CID 를 클릭한 후 PQD 또는 ETD 를 선택하여 충돌 모드를 변경하세요.
2. 정규화된 충돌 에너지 열에서 35 를 클릭한 후 20 또는 50으로 설정하면 충돌 에너지가 변경됩니다.
   참고: 모든 화학 잔류물과 용매를 유기물 폐기물 용기에 섞어 넣으세요.

8. 결과 분석

1. 도면 소프트웨어에서 부모 이온과 파편 이온을 수동으로 그려내며, 부모 이온 구조, 화합물명, 질량 대 전하비(m/z) 값을 포함합니다.
2. 예를 들어, m/z=623.21인 미지의 화합물에 대해서는 결과적으로 파편화되는 과정을 관찰합니다. 여기서 조각 중간체는 MS/MS에서 m/z=461.15를 가졌습니다. 질량 차이는 162.06 Da로, 헥소스 구조에 해당합니다.
3. 더 분석해 보면, m/z=461.15의 중간 조각이 MS³에서 다시 분해되어 m/z=315.09의 네오비야칸젤리콜을 형성합니다. 질량 차이는 146.06 Da로, 디옥시헥사메틸로스 구조에 해당한다. 즉, m/z=461.15인 중간체는 neobyakangelicol보다 deoxyhexamethylos 단위가 한 개 더 많았습니다.
4. 네오비아칸젤리콜의 구조에서 결합 위치를 분석하세요. 여기서 노출된 하이드록실기가 디옥시헥사메틸로스와 가장 연결될 가능성이 높은 위치였다. 마찬가지로, 디옥시헥사메틸로스 단위의 C1 하이드록실기가 헥소스와 가장 연결될 가능성이 높았습니다. 마지막으로, m/z=623.21인 미지의 화합물의 구조를 구합니다.

Results

우리는 먼저 모든 m/z 정보를 수집한 후, 부모 이온과 조각 이온 간의 질량 차이를 계산해야 한다고 제안했습니다. 데이터베이스나 문헌에 보고된 화합물을 찾아내고, 그 알려진 구조를 바탕으로 미지의 화합물 구조를 역으로 추론했습니다.

검출된 모든 화합물과 그에 상응하는 조각 이온은 m/z 값으로 제시되었습니다. 이 조각 이온의 일부는 인증된 기준²⁰과 일치할 수 있습니다. 이 구조적으로 진단적인 중간체들의 체계적인 기능기 변형을 통해 알려지지 않은 표적 화합물 구조들은 단계적으로 조립되었습니다.

우리는 m/z=623.21의 미지화 화합물에 대해 MS/MS 단편화를 수행했습니다. 헥소스 단위 하나를 제거한 후, 화합물은 m/z=461.15의 조각 중간체를 얻었다. 3차 질량분석법(MS³) 단편화를 통해 중간체는 한 개의 람노스 단위를 잃고 m/z=...

Discussion

LIT-MS와 MSⁿ 단편화 기술의 결합은 CHC에서 미확인 화합물을 식별하는 방법을 제공합니다. Orbitrap 및 Q-TOF MS의 전통적인 탠덤 MS 모드와 달리, 선형 이온 트랩은 표적 이온을 특이적으로 포획할 수 있어 공용^{출 이온}의 간섭을 효과적으로 방지합니다. 이 방법은 분자 수준의 정밀도를 달성하여 비교적 정확한 화학 구조 정보를 제공하여, 데이터베이스 공백으로 인한 미지의 화합물 선정 문제를 부분적으로 해결합니다.

당체, 다당류, 플라보노이드 및 기타 화합물은 CHCs에 널리 존재합니다²⁴. 선형 이온 트랩에서 이들 성분의 단편화 패턴에 주목할 필요가 있습니다. 다당류의 MSⁿ 절단 과정에서 당시 결합 절단이 가장 쉽게 일어납니다²⁵. 단당...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아세토니트릴	Thermo Scientific	CAS 75-05-8	액체 상태
포름산	Thermo Scientific	CAS 64-18-6	액체 상태
Huoxiang Zhengqi 구강액	충칭 태극 산업 (그룹) 유한 책임 회사	국가 의약품 표준 코드 Z50020409	연구 대상
선형 이온 트랩 질량 분석기	Thermo Scientific	LTQ XL	IT-MS 기기
액체 크로마토그래프	Thermo Scientific	U3000	UPLC 기기
Xcalibur	Thermo Scientific	버전 2.0	UPLC-IT-MS 운영 소프트웨어