연구 논문

시험관 내 인간의 2차 모낭 발달을 지원하는 3차원 배양 모델

DOI:

10.3791/70713

⸱

2026년 6월 16일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 3Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), Ministry of Education, 4Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality, 5Department of Surgical Oncology, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 6The University of Hong Kong- Shenzhen Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 2차기부터 제골기까지 시험 관 내에서 인간 난포 발달을 유지하는 3차원(3D) 배양 모델을 확립했습니다. 이 시스템은 체세포 분자 특징을 보존하면서 난포 성장과 옹추 형성을 가능하게 하여 인간 난포 형성 연구에 중요한 모델을 제공합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 난소 난포 형성은 복잡하고 엄격하게 조절되는 과정으로, 생체 내에서 직접 연구하기가 어렵습니다. 시험 관 내 모델이 기전적 연구에 필수적이지만, 기존 시스템은 난포 발달의 시공간적 역학을 재현하지 못해 최적이 아닙니다. 이 연구는 2차기부터 제구기까지 인간 난포 발달을 지원하는 3D 배양 모델을 제시합니다. 이 모델은 지속된 난포 성장, 10일차부터의 뚜렷한 직경 확장기, 그리고 20일째경의 모형강 형성 등 주요 생체 내 형태학적 사건을 성공적으로 재현합니다. 중요하게도, 이 발달 진행은 생식소포(GV) 단계에서 생존 가능한 난자세포의 성공적인 추출로 절정에 달했습니다. 더 나아가, 면역형광 분석 결과, 체세포에서 생식세포 자극호소 수용체의 뚜렷한 발현 패턴이 나타나 과립세포와 테카세포 동일성과 일치하였습니다. 내부 육아체 유사 세포는 높은 난포자극호르몬 수용체(FSHR)를 보인 반면, 외부 테카 유사 세포는 황체형성호르몬 수용체(LHR) 발현이 높았습니다. 이 모델은 인간 난포 형성과 생식 독성학을 연구하는 데 귀중한 플랫폼을 제공하며, 2차 단계에서 제구기 발달을 위한 시험관 내 난포 배양 시스템 최적화에 참고 자료를 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

난소 난포 발달의 생리학적 과정은 원시기부터 배란 전단계까지 여성 생식력의 근본입니다. 이 과정은 난자 성장/성숙과 과립세포 증식/분화 등 매우 조율된 일련의 사건들을 포함합니다. 이러한 복잡한 메커니즘의 교란은 불임과 난소 기능 장애의 주요 원인이 됩니다. 따라서 파라크린 신호 전달, 난자-체세포 상호작용, 세포외 기질 역학 등 난포 형성의 조절 네트워크에 대한 상세한 이해는 병태생리학적으로 매우 중요합니다. 그러나 인간 난포 생성에 대한 생 체 내 직접 연구는 윤리적·실질적 한계에 의해 제약을 받아 이러한 메커니즘을 밝히기 위한 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델의 필요성을 촉진하고 있습니다. 발전에도 불구하고, 특히 2차기부터 제트랄 단계까지 인간 난포 발달을 지원하는 장기적인 배양 모델이 여전히 심각하게 부족합니다.

2차원(2D) 또는 3차원(3D) 행렬에서의 인간 난포 배양은 초기 난포 발달에 대한 이해를 진전시켰지만, 이러한 시스템은 후기 단계로의 진행을 지원하는 데는 여전히 제한적입니다. 더 큰 난포 크기와 긴 성숙 기간으로 인해 인간의 난포 형성을 시험관 내에서 달성하는 것은 특히 어려운 점입니다. MII 난자를 성공적으로 얻은 소수의 인간 시험관 내 난포 배양 시스템 중에서도 성숙률은 낮게 유지되며(최대 약 20%)6,7,8,9. 아마도 더 근본적인 도전은 2차-제트랄로의 전환을 재현하는 일인데, 이는 아직 시험관에서 충분히 모델링되지 않은 결정적이고 구조적으로 복잡한 단계입니다.

이 연구는 인간 2차 난포가 뚜렷한 공동체 구조를 가진 구외 난포로 시험 관 내에서 발달하는 것을 지원하는 3D 배양 모델을 확립했습니다. 이 모델은 인간 난포 발달의 조절 메커니즘을 더 깊이 연구할 수 있는 기초 플랫폼을 제공하며, 2차에서 항상으로 발달하는 난포 배양 시스템의 향후 최적화를 위한 참고 자료가 됩니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구 프로토콜은 베이징대학교 제3병원 윤리위원회(승인번호 M2024151)에서 검토 및 승인되었습니다. 연구에 참여하는 미성년자의 모든 법적 보호자는 사전 동의서에 서명했습니다.

조직 공급원
이 프로토콜에서 사용된 인간 난소 수질 조직은 난소 기형종 진단을 받은 4명의 소아 환자(2, 6, 13, 16세)로부터 연구 목적으로 난소 조직을 기증한 것이었습니다 (표 1). 난소 피질은 난소 조직 냉동 보존 연구에 사용되었고, 나머지 수질 조직은 시험관 내 난포 배양에 사용되었습니다. 총 33개의 2차 난포가 분리되었으며, 이 중 16개는 대조군에, 17개는 3D 배양 그룹에 배정되었습니다.

시약 준비
운반 배지는 Leibovitz의 L-15 배지에 10% 혈청 대체 보충제를 첨가하여 4°C에서 보관했습니다. 완전한 소화액은 MEMα에 0.04 mg/mL 리베라제 DH, 10 IU/mL DNase I, 100 IU/mL 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 -20 °C에서 보관하여 제조하였다. 소화 중단액은 DPBS에 10% 혈청 대체 보충제를 첨가하여 4°C에서 보관했습니다. 완전 성장 배지는 MEMα에 10% 혈청 대체 보충제, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 50 μg/mL L-아스코르브산, 2 mM 피루빈 나트륨, 100 IU/mL 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 준비하였다. 매지는 4°C에서 보관되었습니다. 재조합 인간 난포자극호르몬(FSH)은 배양 시작 시 최종 농도인 100 mIU/mL로 첨가되었으며, 이는 이전 연구에서 설명된 것입니다10. 초기 주체형성이 시각적으로 감지된 후(약 20일째), 배지 교환 중에 재조합 인간 황체형성호르몬(LH)을 최종 농도인 10 mIU/mL로 보충하였습니다. 고체 배양 매트릭스는 70%(v/v) 기저막 매트릭스와 30% 얼음 냉각 완전 성장 배지를 혼합하여 준비했으며, 모든 작업 동안 얼음 위에 보관하였습니다.

조직 소화 및 2차 난포 분리
난소 조직을 운송 배지에 넣어 4°C에서 실험실로 운반했습니다. 멸균 상태에서 난소 연수 박리는 메스를 사용했습니다. 조직은 얇은 조각(~3 × 3 × 1 mm)으로 절단된 후, 조직 절단기로 작은 조각(~0.5 × 0.5 × 1 mm)으로 잘게 만들었으며, 조직을 전체적으로 촉촉하게 유지했습니다. 다진 조직은 35mm 접시에 옮겨졌고, 100mg 조직당 2mL의 미리 가열된 완전 소화액을 첨가했습니다. 37°C에서 45–80분(평균 60분± 15분) 부화했으며, 10분마다 부드럽게 혼합했습니다. 현미경 검사에서 기질 기질이 느슨해지고 개별 난포가 방출되는 것이 확인되면서 소화가 종료되었습니다(그림 1). 건강한 2차 난포(직경 100–200 μm, 2개의 과립생물 세포층과 ≥ 개의 난자층 포함)를 입체현미경으로 유리 입구 제어 피펫(내경 200 μm)으로 선별하고, 미리 가열된 완전 배양지로 두 번 세척하였습니다.

3D 임베딩과 장기 문화
세포 배양 인서트를 35mm 접시에 넣고, 2mL 완전 배양지를 적셔 인큐베이터(37 °C, 5% CO₂)에서 2시간 동안 평형으로 유지했습니다. 선택된 2차 난포를 삽입물로 옮겨 같은 조건에서 하룻밤 동안 사전 배양했습니다. 배양 전 단계에서는 대조군의 난포가 삽입물 내에서 직접 배양되었습니다(2D 배양). 반면, 3D 배양군에 지정된 난포는 성장 인자 감소된 저저막 기질(총 단백질 8~12 mg/mL)에 삽입하기 위해 준비되었다. 매트릭스는 얼음 위에서 해동한 후 30%(v/v) 얼음처럼 차가운 완전 성장 배지와 혼합되었습니다. 혼합물 40 μL 방울을 35mm 접시(접시당 최대 6방울 포함)에 배치하여 약 1.5mm 높이의 균일한 젤 층을 형성했습니다. 그 후, 유리 입으로 제어되는 피펫을 사용해 각 방울에 단일 2차 난포를 이식하여 방울이 가라앉지 않도록 중상부 3분의 1 지점에 신중하게 배치했습니다. 접시는 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 30분간 넣어 젤화를 허용했습니다. 고체 후 완전 배양지 2mL를 접시에 부드럽게 첨가하여 장기 배양을 시작했습니다.

배양 유지 및 모니터링
신선한 완전 배양지(FSH 포함)를 사용한 50% 배지 교환을 48시간마다 시행했습니다. 난포는 매일 입체현미경으로 관찰되었고, 그 직경과 형태학적 특성이 기록되었습니다. 초기 antrum 형성이 시각적으로 감지된 후(약 20일), 이후 변화 과정에서 재조합 인간 LH가 배지에 추가되었습니다. 배양은 최대 30일간 유지되었고, 또는 난포가 정서기(직경 400 μm, 명확한 체액 채취 공동)에 도달할 때까지 > 진행되었습니다.

배양 후 세포 해리
배양 종료 시, 모낭은 신선한 DPBS가 포함된 접시로 옮겨져 멸균 29게이지 주사기로 기계적으로 해리되었습니다. 분리된 적운-난자 복합체(COCs)는 추가 분석을 위해 별도의 접시로 옮겨졌습니다. 남은 과립 및 테카 세포 현탁액은 2 mL 사전 가열된 완전 배양지를 담은 새로운 35mm 접시로 옮겨졌으며, 고르게 분포되도록 부드럽게 휘저어 48시간(37 °C, 5% CO₂) 배큐팅했습니다.

면역형광 분석
배양 후 세포는 4% 파라포름알데히드로 상온에서 30분간 고정되었습니다. 그 후 샘플을 PBS로 세 번 세척하고, 0.5% Triton X-100으로 20분간 투과시킨 후, PBS에 1% BSA를 사용해 4°C에서 하룻밤 동안 차단했습니다. 세포는 4°C에서 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 인큐베이팅되었습니다. 주요 항체는 항-FSHR(토끼, 1:200)과 항-LHR(마우스, 1:100)이었습니다. 인큐베이트 후에는 1% BSA를 함유한 PBS로 각각 15분씩 세 차례 세척했습니다. 이후 형광 2차 항체(항토끼 및 항생쥐, 1:200)와 함께 실온에서 어두운 환경에서 2시간 배양하였습니다. 마지막으로, 세포들은 각각 20분간 세 번의 최종 세척을 거쳤습니다. 핵은 실온에서 5분간 DAPI로 염색되었습니다. 그 후 샘플을 3회 5분간 세척했으며, 1% BSA가 포함된 PBS를 사용했습니다. 영상은 Operetta CLS 고함량 영상 시스템을 공초점 모드로 사용해 수행되었습니다. 형광 신호는 DAPI(405 nm), Alexa Fluor 488(LHR), Alexa Fluor 647(FSHR)의 채널을 사용하여 모든 샘플에서 일관된 노출 설정을 사용하여 포착되었습니다.

통계 분석
5일, 10일, 15일째에 대조군과 3D 배양군 간의 난포 직경 비교는 독립 샘플 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. p 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 대조군의 거의 모든 난포가 15일 이후에는 생존하지 못해 난포 직경에 대한 통계 분석은 수행되지 않았습니다. 이로 인해 표본 크기가 부족하여 신뢰할 수 있고 의미 있는 그룹 비교가 불가능해졌습니다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism(버전 9.0)을 사용하여 수행되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 난포 성장을 지원하는 3D 배양 모델 개발
난소 난포 연구의 주요 과제는 완전한 난포 발달을 지원하는 시험관 내 배양 시스템을 개발하는 것이며, 그중 제골강 형성이 중요한 이정표입니다. 따라서 본 연구는 시험 관 내 인간 난포에 대한 3D 배양 모델을 확립하였습니다(그림 2). 총 33개의 2차 난포가 4명의 기증자로부터 분리되었으며, 이 중 16개는 대조군(2D 삽입 기반 배양)에, 17개는 3D 배양 그룹에 배정되었습니다 (표 1). 배양 10일째에 대조군에서 9개의 난포가 생존했으며(생존율: 56.3%), 3D 배양군에서는 10개의 난포가 생존했습니다(생존율: 58.8%) (표 1). 20일째까지 대조군에서는 난포가 생존하지 않았으며(생존율: 0%)...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2차 난소에서 항구로의 전환을 통해 인간 난소 난포를 시험관 내에서 성공적으로 유지한 것은 중요한 기술적 진보를 의미합니다. 본 연구에서는 적절한 생물물리학적 지원과 단계별 호르몬 신호를 제공하는 3D 배양 시스템이 이 진행을 가능하게 했습니다. 이 결과는 조직 생리를 재현하기 위해 3D 배양 시스템의 필요성을 강조하는 최근 증거와 일치합니다. 기존 2차원 단일층은 조작적으로 단순하지만, 천연 세포-세포 및 세포-기질 상호작용에 필요한 공간 구조가 부족하여 종종 분화와 기능에 변화를 초래합니다11,12. 본 연구에서 4명의 기증자로부터 유래한 대조군 16개의 난포는 모든 환자 샘플에서 일관된 퇴행성 역학을 보였으며, 10일째에 퇴행이 시작되었고, 15일 이후에는 생존 난포가 남아 있지 않았으며, 배양 기간 내내 제트랄강 형성도 관찰되지 않았습니다. ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자들은 서로 상충하는 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 베이징 자연과학재단(Z230013), 중국 국가자연과학기금(T2293764, 82501980, 82288102); 국가 핵심기술 연구(NATIONAL KEY TECHNOLOGY R&) 중국 D 프로그램(2022YFC2703000); 베이징대학교 임상 의학 플러스 X - 청년 학자 프로젝트(PKU2025PKULCXQ033); 베이징대학교 제3병원 임상 핵심 프로젝트(BYSYZD2021019); 고혁신 계획(202504841089); 그리고 중국박사후 과학기금(GZC20230145)에서 활동했습니다. 회로도는 https://BioRender.com 년에 제작되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Anti-FSHRHuaBioER1909-08
Anti-LHRSanta Cruzsc-293165
Anti-mouse(secondary)AbcamAB150113
Anti-rabbit(secondary)AbcamAB205718
Basement membrane matrix for organoid cultureMCEK6004 
BSASigmaA1933
Cell culture insert MilliporePICMORG50
Culture dishCorning430165
DAPIBeyotimeC1006
DNase I ThermoEN0525
DPBSGibco14190144
FSHMerckF4021
IncubatorThermoHeracell 3111
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045
L-Ascorbic acidMCEHY-B0166
Leibovitz's L-15 mediumGibco11415064
LHMerckL6420
Liberase DHRoche5401054001
McIlwain Tissue chopperMickle Laboratory Engineering Co. Ltd.MP10180-220
MEMαGibco41061029
ParaformaldehydeSolarbioP1110
PBSGibco10010023
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Serum substitute supplementFUJiFILM Irvine90194
Sodium pyruvateGibco11360070
StereomicroscopeNikonSMZ1270
The high-content imaging systemPerkinElmer Operetta CLS
Triton X-100SigmaX100
```

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., Liu, K. Cellular and molecular regulation of the activation of mammalian primordial follicles: somatic cells initiate follicle activation in adulthood. Hum Reprod Update. 21 (6), 779-786 (2015).
  2. McGee, E. A., Hsueh, A. J. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Rev. 21 (2), 200-214 (2000).
  3. Hovatta, O. Cryopreservation and culture of human primordial and primary ovarian follicles. Mol Cell Endocrinol. 169 (1-2), 95-97 (2000).
  4. Wang, T. R., et al. Basic fibroblast growth factor promotes the development of human ovarian early follicles during growth in vitro. Hum Reprod. 29 (3), 568-576 (2014).
  5. Telfer, E. E. Future developments: In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles. Acta Obstet Gynecol Scand. 98 (5), 653-658 (2019).
  6. Guo, Y., et al. Neurotrophin-4 promotes in vitro development and maturation of human secondary follicles yielding metaphase II oocytes and successful blastocyst formation. Hum Reprod Open. 2024 (1), hoae005(2024).
  7. Xiao, S., et al. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5, 17323(2015).
  8. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Mol Hum Reprod. 24 (3), 135-142 (2018).
  9. Xu, F., et al. Matrix-free 3D culture supports human follicular development from the unilaminar to the antral stage in vitro yielding morphologically normal metaphase II oocytes. Hum Reprod. 36 (5), 1326-1338 (2021).
  10. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  11. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Gandolfi, F. A 3D approach to reproduction. Theriogenology. 150, 2-7 (2020).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Francés-Herrero, E., et al. Bioengineering trends in female reproduction: a systematic review. Hum Reprod Update. 28 (6), 798-837 (2022).
  14. He, X. Microfluidic Encapsulation of Ovarian Follicles for 3D Culture. Ann Biomed Eng. 45 (7), 1676-1684 (2017).
  15. Healy, M. W., et al. Creating an Artificial 3-Dimensional Ovarian Follicle Culture System Using a Microfluidic System. Micromachines (Basel). 12 (3), 261(2021).
  16. Aziz, A. U. R., et al. A Microfluidic Device for Culturing an Encapsulated Ovarian Follicle. Micromachines (Basel). 8 (11), 335(2017).
  17. Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nat Commun. 8, 15261(2017).
  18. Hugues, J. N., Massart, P., Cedrin-Durnerin, I. Assessment of theca cell function: a prerequisite to androgen or luteinizing hormone supplementation in poor responders. Fertil Steril. 99 (2), 333-336 (2013).
  19. Zhu, Z., et al. LSD1 promotes the FSH responsive follicle formation by regulating autophagy and repressing Wt1 in the granulosa cells. Sci Bull. 69 (8), 1122-1136 (2024).
  20. Shao, T., et al. Autophagy regulates differentiation of ovarian granulosa cells through degradation of WT1. Autophagy. 18 (8), 1864-1878 (2022).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

2

관련 논문