C57BL/6 마우스에서 MNU 유발 망막 퇴행에서 ALDH2-SIRT1-소포체 스트레스 축의 약리학적 조절: 체내 연구

요약

이 연구는 C57BL/6 마우스에 메틸-니트로소레아를 투여하여 망막 손상을 유도한 후, SIRT1 및 소포체 스트레스(ERS) 조절제와 함께 ALDH2 활성화제 및 억제제를 투여하는 방식으로 진행되었습니다. 이 프로토콜은 이러한 치료가 망막 퇴행에 미치는 보호 효과와 알데히드 대사에 미치는 영향을 조사하는 것을 목표로 했습니다.

초록

본 연구는 C57BL/6 마우스에서 메틸-니트로소레아(MNU) 유발 망막 손상에 대한 알데히드 탈수소효소 2(ALDH2) 활성화, 다이진을 통한 ALDH2 억제, 그리고 시르투인 1(SIRT1) 및 소포 스트레스(ERS) 조절이 메틸-니트로소레아(MNU)로 인한 망막 손상에 미치는 보호 효과를 조사했습니다. 72마리의 쥐가 무작위로 8개 그룹에 배정되었으며, 여기에는 대조군, MNU 단독 그룹, 다양한 치료 조합군이 포함되었습니다. 쥐에게는 ALDH2-SIRT1-ERS 축을 각각 표적으로 하는 작용제와 억제제의 복막 내 주사를 투여하였습니다. 치료 후 2일과 4일째에 체중, 망막층 두께, 알데히드 대사 바이오마커를 평가하였다. MNU 투여는 망막 퇴화를 유도하여 대조군을 제외한 모든 그룹에서 상당한 체중 감소를 초래했습니다. 알다-1 치료는 망막 손상을 완화시켰고, 다이진은 이를 악화시켰습니다. SIRT1의 약리학적 억제(EX-527 경유)는 Alda-1의 보호 효과를 약화시켰고, ERS 유도(TUN)는 그 효능을 거의 없애버렸다. 반대로, SIRT1 활성화(SRT1720를 통해)는 다이진의 부작용을 완화했고, ERS 억제(4-PBA를 통해)는 다이진의 영향을 부분적으로 완화했다. 더 나아가 MNU는 알데히드 대사 지표(malondialdehyde [MDA]와 4-hydroxy-2-nonenal [4-HNE])의 수치를 증가시켰으며, Alda-1은 이를 감소시키고 Daidzin은 이 수치를 높였습니다. 또한, SIRT1/ERS 경로의 약리학적 조절이 알데히드 대사에 대한 Alda-1과 Daidzin의 조절 효과에 개입했습니다. 전반적으로 ALDH2 활성화는 망막 구조를 보호하고 알데히드 대사를 조절하여 ALDH2-SIRT1/ERS 신호 축이 망막 퇴행 완화에 중요한 역할을 한다는 점을 강조했습니다.

서론

망막 변행은 전 세계적으로 실명의 주요 원인으로, 망막색소변성성(RP), 노화 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 망막병증(DR)과 같은 질환들이 포함되며, 이들은 수백만 명에게 영향을 미치며 상당한 사회경제적 부담을 안긴다 ^1,2,3. 그러나 임상 실습에서 이러한 실명성 망막 질환의 진행을 막을 수 있는 매우 효과적인 약물 치료법이 부족합니다. 망막 변성의 병인은 산화 스트레스, 만성 염증, 그리고 망막 세포 항상성을 교란하는 소포체 스트레스(ERS)를 포함하는 다요인적입니다. 이러한 스트레스 요인은 종종 내부 대사 조절 장애(예: 미토콘드리아 기능 장애)에 의해 촉발되며, 궁극적으로 세포자멸사와 되돌릴 수 없는 망막 손상으로 이어집니다⁴. 강력한 DNA 알킬화제인 메틸-니트로소레아(MNU)는 망막 퇴행 모델링을 위한 널리 사용되는 화학 유도제로 등장했습니다⁵. MNU 유도 망막 질환 모델은 질병 기전을 조사하고 잠재적 치료 개입을 평가하는 데 유용한 도구로 활용됩니다. 기전적으로 MNU는 활성 산소종(ROS)을 생성하고 산화환원 균형을 깨뜨려 광수용체 막과 소기관을 손상시켜 산화 스트레스를 유발합니다. 이로 인해 알데히드 대사에도 영향을 미쳐 지질 과산화의 해독을 저해할 수 있습니다. 이후 독성 알데히드의 축적은 산화 손상을 악화시켜 광수용체 세포자멸사를 증폭시킬 수 있습니다^.

알데히드 탈수소효소 2(ALDH2)는 미토콘드리아 NAD⁺ 의존 효소로, 4-하이드록시-2-노네날(4-HNE)과 말론디알데히드(MDA)와 같은 독성 알데히드를 덜 반응성 있는 카복실산으로 전환하여 해독하는 데 중요한 역할을 하여 산화 손상을 방지합니다⁷. 강한 ALDH2 활성은 산화환원 항상성 유지에 매우 중요하며, ALDH2 기능 저하는 가속화된 노화 및 신경퇴행성 병리와 연관되어 있습니다⁸. 특히 소분자 작용제 Alda-1을 통한 ALDH2의 약리학적 활성화는 다양한 모델에서 세포 보호 효과를 발휘하는 것으로 입증되었습니다 ^9,10. 시르투인 1(SIRT1)은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 + (NAD+) 의존성 디아세틸화효소로, p53과 핵 인자 카파 B(NF-κB)¹¹을 포함한 전사 인자를 조절하여 스트레스 반응과 에너지 대사를 조절합니다. SIRT1 활성화는 미토콘드리아 기능과 세포 생존 증진에 유망한 것으로 나타났으며, 연구에서는 상향 조절이 망막 변행에서 산화 손상 및 염증 감소와 연관되어 있습니다¹². 소포체 스트레스(ERS)는 잘못 접힌 단백질의 축적에 의해 촉발되며, 만성 스트레스 하에서 접히지 않은 단백질 반응(UPR)을 활성화하여 세포자멸 촉진 연쇄 반응이 될 수 있습니다. ERS는 망막 퇴행과 관련이 있으며, 광수용체 세포자멸사에 기여하는 것으로 알려져^{있습니다.} 이러한 발견에도 불구하고, MNU 유도 망막 퇴행 모델 맥락에서 ALDH2, SIRT1, ERS 간의 구체적인 상호작용은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 또한, 이러한 상호 연결된 경로들의 조정된 역할은 추가적인 체계적 연구가 필요합니다.

따라서 본 연구는 ALDH2-SIRT1-ERS 축의 핵심 구성 요소인 ALDH2(Alda-1 또는 Daidzin 경유), SIRT1(SRT1720 또는 EX527 경의), ERS(4-PBA 또는 TUN 경의)가 C57BL/6 마우스에서 MNU 유발 망막 손상에 미치는 영향을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 조직병리학적 및 생화학적 분석을 통해 이 축을 표적으로 삼는 것이 광수용체 생존과 알데히드 대사에 어떤 영향을 미치는지 조사했습니다. 우리는 ALDH2의 조정된 활성화, SIRT1의 증진, ERS 억제가 MNU로 인한 망막 퇴행을 시너지 효과로 완화할 것이라 가설을 세웠으며, 이를 통해 망막 퇴행성 질환에서 이 축을 표적으로 삼을 근거를 제시하였습니다.

프로토콜

윤리적 선언
모든 실험 프로토콜은 푸젠 의과대학 푸종임상의과대학의 실험동물 관리 및 사용 위원회에서 검토 및 승인되었으며, 시각 및 안과 및 시각 연구 협회(ARVO)의 안과 및 시각 연구에 동물 사용 성명을 엄격히 준수하였습니다.

동물과 그룹 배분
인증된 공급자로부터 총 72마리의 수컷 C57BL/6 마우스(8–10주, 체중 20–25g)를 확보했으며, 이는 실험실 동물 육종에 관한 국가 기준을 준수하였습니다. 쥐들은 12시간의 빛과 어둠 주기, 온도 조절(22 ± 2 °C), 상대 습도(50% ± 10%) 등 표준화된 환경 조건 아래 개별 환기된 우리에 수용되었으며, 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있었습니다. ALDH2, SIRT1, ERS 경로가 MNU로 인한 망막 손상에 미치는 조절 효과를 조사하기 위해, 쥐들은 무작위 8개의 실험군(n=9개, 둘째 날군은 n=5개, 넷째 그룹은 n=4)으로 무작위로 배정되어 선택 편향을 최소화하였습니다. 연구의 그래픽 초록은 그림 1에 나와 있습니다.

시약 준비 및 처리 방법
이 연구에 사용된 실험 시약은 재료표에 나열되어 있으며, 준비 및 투여량에 대한 자세한 정보는 다음과 같습니다. (1) MNU (50 mg/kg): 100 mg의 MNU를 2 mL의 생리식염수에 용해하여 50 mg/mL 용액을 제조하였습니다. 그 후 이 용액 1.4 mL를 5.6 mL의 일반 식염수로 희석하여 최종 농도인 10 mg/mL로 하여 동물 투여를 마쳤습니다. (2) 알다-1 (10 mg/kg): 50 mg의 알다-1 분말을 1 mL의 디메틸 설폭화물(DMSO)에 용해하여 50 mg/mL 용액을 만들었고, 이를 24 mL의 일반 식염수로 희석하여 최종 농도인 2 mg/mL로 만들었습니다. (3) 다이진 (10 mg/kg): 50 mg의 다이진 가루를 1 mL의 DMSO에 용해하여 50 mg/mL 용액을 만든 후, 24 mL의 생리식염수로 희석하여 최종 농도인 2 mg/mL로 만들었습니다. (4) EX-527 (10 mg/kg): 5 mg의 EX-527 분말을 0.1 mL의 DMSO에 용해하여 50 mg/mL 용액을 만들었고, 이를 2.4 mL의 일반 식염수로 희석하여 최종 농도인 2 mg/mL로 만들었습니다. (5) SRT1720 (10 mg/kg): 5 mg의 SRT1720 분말을 0.1 mL의 DMSO에 용해하여 잘 혼합했습니다. 그 후 PEG300 400 μL, Tween-80 50 μL 및 생리식염수 450 μL 첨가하여 2 mg/mL 작동 용액을 만들었습니다. (6) TUN (10 mg/kg): 5 mg의 TUN 분말을 0.1 mL의 DMSO에 용해하여 50 mg/mL 용액을 만든 후, 2.4 mL의 생리식염수로 희석하여 최종 농도인 2 mg/mL로 만들었습니다. (7) 4-페닐부티레이트(4-PBA; 10 mg/kg): 4-PBA 분말 2mg을 1 mL의 식염수에 용해하여 2 mg/mL 용액을 제조하였다. 위의 모든 투여량은 5 × M 밀리리터(여기서 M = 동물 체중 kg)였습니다. 그 후, 쥐들은 다음 치료 프로토콜을 따라 8그룹으로 나뉘었습니다:

대조군: 복막 내 생리식염수 단일 주사.
MNU 그룹: MNU의 복강 내 단일 주사.
MNU + Alda-1 그룹: Alda-1 복막 내 주사 후 2시간 후 MNU 단일 투여. 이후 Alda-1은 하루 한 번 복강내 투여되었습니다.
MNU + 다이진 그룹: 다이진 복막 내 주사 후 2시간 후 단회 투여 MNU 주사. 그 후 다이진은 하루 한 번 복강 내 투여를 받았다.
MNU + Alda-1 + EX-527 그룹: Alda-1 복막 내 주사, 1시간 후 EX-527 주사, 1시간 후 MNU 주사(단독 투여). 이후 Alda-1은 하루 한 번 복강내 투여되었습니다.
MNU + Alda-1 + TUN 그룹: 복막 내 주사 후 1시간 후 TUN, 1시간 후 MNU 주사. 이후 Alda-1은 하루 한 번 복강내 투여되었습니다.
MNU + 다이진 + SRT1720 그룹: 복강내 다이진 주사, 1시간 후 SRT1720 주사, 1시간 후 MNU 주사. 그 후 다이진은 하루 한 번 복강 내 투여를 받았다.
MNU + 다이진 + 4-PBA 그룹: 다이진 복막 내 주사, 1시간 후 4-PBA 주사, 1시간 후 MNU 주사. 그 후 다이진은 하루 한 번 복강 내 투여를 받았다.

체중 모니터링
MNU 투여 후 4일 연속으로 각 쥐의 체중을 매일 기록하여 전신 독성 및 치료 관련 생리학적 효과를 모니터링하였다. 체중은 정밀 디지털 저울로 측정되었으며, 정확도는 ±0.1g이었고, 그룹 간 체중 감량 또는 증가 추세를 추적하는 데이터가 문서화되어 치료 내성과 전신 스트레스의 간접 지표로 작용했습니다.

망막 조직병리학 검사
실험 후 2일과 4일째 시점에 쥐들은 마취 후 경추 탈구로 인해 복막 내 펜토바르비탈 나트륨 주사(50–60 mg/kg 체중 용량)를 투여하여 안락사되었으며, 이는 기관 안락사 지침을 엄격히 준수하였습니다. 눈, 특히 왼쪽 눈은 즉시 제거되었습니다. 적출 전에 방향을 표시하기 위해 비 변두리에 작은 절개를 했습니다. 그 후 구체들은 4% 파라포름알데히드(PFA)를 인산염 완충식염수(PBS, pH 7.4)에 24시간 동안 4°C에서 24시간 동안 담가 고정시켰습니다. 고정된 눈은 등급별 에탄올 시리즈(70%, 80%, 95%, 100%)를 통해 탈수되고, 자일렌으로 정화된 후 조직학적 처리를 위해 파라핀 블록에 삽입되었다. 삽입 시에는 표시된 비강 쪽을 아래로 위치시켜 방향을 표준화했습니다.

중앙 망막 영역의 대표적인 샘플링을 위해 시신경두(ONH)를 관통하는 회전식 미세토름을 사용하여 5μm 두께의 일렬 절편을 준비하였습니다. 구체적으로, 상부에서 표시된 비강 지점 쪽으로 절개를 하여 모든 단면이 ONH를 통과하도록 했습니다. 그 후 양전하를 띤 유리 슬라이드에 단편을 장착했습니다. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색은 표준 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 망막 형태는 400× 배율의 광학 현미경으로 평가되었습니다. 측두망막에서 ONH로부터 미리 정해진 거리(200, 400, 600, 800, 1000, 1200 μm)에서 체계적으로 측정이 이루어졌다. 각 위치에서 총 망막 두께, 내부 및 외부 분절(IS/OS) 길이, 외부 핵층(ONL) 두께, 외부 플렉시폼층(OPL) 두께, 내핵층(INL)을 측정하였습니다.

객관성을 확보하고 측정 편향을 최소화하기 위해 엄격한 품질 관리 프로토콜이 도입되었습니다. 구체적으로, 8개의 실험 그룹 각각은 다섯 개 또는 네 개의 하위 그룹(예: 하위 그룹 1, 2, 3, 4, 5)으로 세분화되었습니다. 그룹 배정에 눈이 멀어진 5명 또는 4명의 독립 관찰자가 모든 실험 그룹에서 동일한 대응 하위 그룹을 측정하도록 배정되었다(예: 관찰자 A는 항상 모든 그룹에서 하위 그룹 1을 측정했다). 각 측정 지점에서 ~5 μm 범위 내에서 세 가지 측정값을 취하고(예: 200 μm, 195 μm, 205 μm) 기술적 오차를 최소화하기 위해 평균화했습니다. 정량적 측정은 ImageJ 소프트웨어(버전 1.54g)를 사용해 수행되었으며, 각 점의 평균 두께 값을 계산하여 재현성을 보장하였습니다.

알데히드 대사 지표
산화 스트레스와 알데히드 대사를 평가하기 위해 혈청 샘플에서 MDA와 4-HNE 수치를 분석하였으며, 이들은 지질 과산화와 알데히드 스트레스의 주요 바이오마커입니다. 구체적으로, 모든 마우스는 체중당 50–60 mg의 복막 내 펜토바르비탈 나트륨 주사로 마취를 받았습니다. 쥐들이 깊은 마취를 받은 후, 경추 탈구를 통해 안락사가 이루어졌습니다. 안락사 직후 안구를 적출하고 신속히 후구혈을 채취했다. 샘플은 상온에서 30분간 응고된 후, 3,000 × g 에서 10분간 원심분리했습니다. 혈청 분획은 효소가 없는 미세원심분리관으로 조심스럽게 옮겨져 -80°C에서 보관하여 후속 분석이 진행되었습니다. 혈청 MDA 수치는 제조사 프로토콜에 따라 시판된 효소 연관 면역흡착 검사(ELISA) 키트를 사용하여 측정되었습니다. 간단히 말해, 표준 및 샘플은 미리 코팅된 마이크로플레이트에 추가되고, 특이적 1차 항체와 함께 배양되었으며, 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거한 후, 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합된 2차 항체와 반응했습니다. 그 후 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 첨가하고 반응을 황산으로 종료했습니다. 광학 밀도(OD) 값은 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm에서 측정되었고, MDA/4-HNE 농도는 알려진 분석 물질 농도를 이용해 생성된 표준 곡선과 OD 값을 비교하여 결정하였습니다.

통계 분석
모든 데이터는 평균± 표준오차(SE)로 제시되었습니다. 2일차 그룹은 n = 5, 4일 그룹은 n = 4)로 인해 부트스트랩 검정 통계 방법을 사용했습니다. 구체적으로, 부트스트랩 재샘플링 방법(1,000회 반복 및 대체 기준)을 사용하여 그룹 평균의 95% 신뢰구간(CI)을 추정하고 그룹 간 차이를 비교했습니다. 각 결과(예: 무게, 망막 두께, MDA/4-HNE 수치)에 대해 원래 데이터셋에서 부트스트랩 샘플을 추출하여 각 재샘플의 평균을 계산했습니다. 95% 신뢰구간은 부트스트랩 분포의 2.5^분 도와 97.5^분 위수에서 도출되었습니다. 신뢰구간을 검토하여 다음과 같은 접근법을 통해 유의성을 간접적으로 평가하였습니다. 부트스트랩 결과의 신뢰구간에 0이 포함되지 않았다면, 이는 일반적으로 차이가 유의미함을 나타내는 것이었습니다(두 그룹 이상의 평균 비교를 가정할 때). 도형은 Graphpad 소프트웨어(버전 5.01)를 사용해 생성되었습니다.

결과

체중 변화
실험 이전에는 그룹 간 체중에 유의미한 차이가 없었습니다. 실험 이틀째, 대조군은 체중이 17.0 ± 0.5g에서 17.4 ± 0.4g으로 증가한 것을 제외하고, 다른 모든 그룹의 쥐 체중은 유의미하게 감소했습니다. 구체적으로, MNU 그룹 쥐는 17.4 ± 0.3g에서 16.2 ± 0.2g으로, MNU + Alda-1 그룹은 17.3 ± 0.3g에서 16.7 ± 0.4g으로, MNU + 다이진 그룹은 17.3 ± 0.3g에서 16.2 ± 0.3g으로, MNU + Alda-1 + EX-527 그룹은 17.3 ± 0.4g에서 16.7± 0.2g으로, MNU + Daidzin + SRT1720 그룹은 17.2 ± 0.4g에서 16.2 ± 0.4g으로 감소했습니다. MNU + Alda-1 + TUN 그룹은 17.5 ± 0.3 g에서 16.1 ± 0.2g으로, MNU + Daidzin + 4-PBA 그룹은 17.2 ± 0.2 g...

토론

이전 연구들은 ALDH2 작용제가 MNU에 의해 유발된 망막 변행에 대해 보호 효과를 제공할 수 있음을 시사했다¹⁴. 그러나 억제제의 개입 효과와 SIRT1, ERS와 같은 잠재적 하위 경로에 대해서는 자세히 탐구되지 않았습니다. SIRT1과 ERS가 망막 퇴행 모델, 예를 들어 빛에 의한 망막 퇴행과 망막 변성을 가진 유전자 변형 쥐 등 다양한 모델에 관여한다는 연구가 있습니다^15,16. 이번 연구의 주요 발견은 MNU가 망막 퇴화를 유발하는 동시에 알데히드 수치를 유의미하게 높였다는 점입니다. ALDH2 작용제와 그에 대응하는 억제제는 망막 변행과 알데히드 수치를 완화하거나 악화시킬 수 있습니다. 또한 SIRT1과 ERS의 조절이 ALDH2의 영향에 중간적인 역할을 했습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4HNE 키트	Elabscience, 중국	E-EL-0128	혈청 4HNE 수준 측정용
4-페닐부티르산(4-PBA)	MCE, 미국	HY-A0281	ERS 억제 시약
알다-1	MCE, 미국	HY-18936	연구용 ALDH2 활성제
다이진	MCE, 미국	HY-N0018	연구용 ALDH2 억제제
플루오레세인 나트륨	광저우	N/A	플루오레세인 혈관조영술 시스템을 사용하여 획득됨. 혈관조영 이미지는 누출, 비관류 영역 또는 망막 혈관 형태의 변화 여부를 분석하였다.
ImageJ 소프트웨어	미국 국립 보건원	버전 1.53t
MDA 키트	Beyotime, 중국	S0131S	혈청 MDA 수준 측정용
N-니트로소-N-메틸우레아(MNU)	MCE, 미국	HY-34758	망막 퇴행을 유도하는 DNA 알킬화제
파라포르말데하이드	Sigma-Aldrich, 미국	30525-89-4	망막 조직 섹션용
정밀 디지털 스케일	전자 스케일, 중국	SF-400	용량: 5000 g 및 1 g/177ozX0.10z, 각 마우스의 체중 기록용
프리즘	GraphPad	버전 5.01	통계 분석 소프트웨어
회전식 마이크로톰	LEICA, 독일	RM2016	망막 섹션 준비용
셀리시스타트(EX-527)	MCE, 미국	HY-15452	연구용 SIRT1 억제제
나트륨 펜토바르비탈	Sigma-Aldrich, 미국	1.93248	후속 연구를 위한 복강 내(IP) 주사 마취용
SRT1720	MCE, 미국	HY-10532	연구용 SIRT1 활성제
수만신	길림성다 동물 제약 회사	N/A	후속 연구를 위한 복강 내(IP) 주사 마취용
튜니카마이신(TUN)	MCE, 미국	HY-A0098	ERS 유도 시약

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