방법 논문

Dioscorea bulbifera L에서 잠재적으로 간독성 푸란 함유 화합물을 스크리닝하기 위한 통합 UHPLC-MS/MS, HRMS 전략.

DOI:

10.3791/70865

⸱

2026년 5월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medicine and Health Management, Guizhou Medical University, 4Guizhou Provincial Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Guizhou Medical University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 Dioscorea bulbifera L에서 잠재적으로 간독성이 있는 퓨란 함유 화합물을 선별하기 위해 UHHPLC–MS/MS와 HRMS를 결합한 통합 전략을 개발하였습니다.

초록

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Dioscorea bulbifera L.(DBL)은 갑상선 질환과 종양 치료에 사용되는 전통 한약으로, 잠재적 간독성 영향으로 인해 상당한 안전성 우려를 제기하고 있습니다. 이전 연구들은 이 간 손상이 DBL에 존재하는 퓨란 함유 화합물(FCC)의 대사 활성화와 관련이 있을 수 있음을 시사합니다. 본 연구에서는 초고성능 액체 크로마토그래피와 탠덤 질량분석법(UHPLC-MS/MS), 초고성능 액체 크로마토그래피와 탠덤 고해상도 질량분석법(UHPLC-HRMS)을 결합한 통합 분석 접근법을 통해 DBL 추출물 내 FCC와 그 반응성 대사산물을 체계적으로 특성화하였습니다. 표적 및 비표적 질량분석법을 모두 사용하여 DBL의 수성 추출물에서 총 849종의 성분을 확인했으며, 이 중 10종은 푸라노디테르페노이드, 17종은 추가 FCC였습니다. 대사 활성화 경로를 밝히기 위해, 우리는 마우스 간 미소체(MLM) 배양 시스템 내에서 글루타치온(GSH)과 4-브로모벤질아민(BBA)을 이중 포획제로 사용했습니다. P450 매개 대사를 통해 디오스불빈 B(DSB), C(DSC), D(DSD), E(DSE), L(DSL), N(DSN), 그리고 2-펜틸푸란에서 유래한 7개의 해당 부가간물이 성공적으로 포획되고 특성화되었습니다. 본 연구는 DBL에서 잠재적으로 간독성 푸란 화합물의 포괄적 프로파일링을 위한 민감하고 구체적인 접근법을 확립하고, 푸란 함유 한약과 관련된 반응성 대사산물 형성과 독성 기전에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.

서론

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전통 중의학(TCM), 특히 약물 유발성 간 손상(DILI)과 관련된 안전성 우려가 광범위한 임상 활용과 현대화를 저해합니다 1,2,3. 점점 더 많은 증거가 중의학의 대부분 성분이 본질적으로 독성이 없다는 것을 시사합니다; 대신 이들의 간 독성은 생체 내 대사 활성화에 의해 발생한다. 1, 4, 5. 푸란 함유 화합물(FCC)은 P450 매개 대사 활성화를 거쳐 매우 반응성 있는 친전자중간체, 특히 시스-엔디얼을 생성하는 주요 간독성 전구체로 잘 알려져 있으며, 이는 간 독성 시작에 중요한 역할을 합니다. 이 친전자성 대사산물은 필수 단백질의 시스테인 티올 및 아미노기와 공유 결합 부가체를 형성하여 독성 효과 6,7,8의 진행을 촉진합니다.

한의학에서는 Dioscorea bulbifera L.(DBL)이 갑상선 질환, 종양, 피부 질환 치료에 널리 사용되어 왔습니다 9,10. DBL에서 총 152가지 화학 성분이 분리 및 특성화되었으며, 그중 41종은 푸라노디테르페노이드11. 이 중 주요 생리활성 성분인 디오스불빈 B(DSB)는 쥐 모델에서 간손상을 유발하는 것으로 입증되었으며, 이는 DSB에서 유래한 시스-엔데(DDE)의 형성과 밀접하게 연관되어 있습니다12,13. 분석 장비의 발전에 힘입어 질량분석법은 TCM14,15의 복잡한 화학 성분과 대사산물을 분석하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 전통적으로 DSB 대사로 생성된 시스-엔디얼은 N-아세틸-L-라이신과 글루타티온 또는 N-아세틸-L-시스테인을 결합해 전자호화성 종을 포획한 후, 화학적으로 안정된 피롤 유도체에 대한 LC-MS/MS 분석을 통해 검출됩니다16,17. 이 접근법을 바탕으로, 우리는 이전에 GSH 및 BBA와 함께한 퓨란 유래 대사 중간체의 동시 포획을 활용한 개선된 전략을 개발했으며, GSH 부가상물에 대한 129 Da의 중성 손실 스캔과 m/z 272의 전구체 이온 스캔을 이용한 LC-MS/MS 분석, 그리고 BBA 모이에티에서 유도된 m/z 169 및 171의 전구체 이온 스캔을 이용한 피롤 검출을 위한 1:1 전구체 이온 스캔을 결합한 방법을 개발했습니다(그림 1)18. 19살. 알려진 푸라노이드에는 효과적이지만, 이 방법은 복잡한 혼합물, 특히 사전 구조 정보가 부족한 FCC에 적용할 때 주목할 만한 한계를 보입니다. 따라서 복잡한 TCM 매트릭스의 철저한 화학적 특성 분석과 동시에 간독성 전구체의 효율적인 스크리닝을 지원하는 포괄적인 분석 전략이 시급히 필요합니다.

여기서는 DBL에서 잠재적으로 간독성 FCCs의 체계적 특성 분석을 위한 통합 전략을 보고합니다(그림 2). 이 전략은 세 가지 핵심 단계로 구성됩니다: (i) UHPLC–MS/MS를 기반으로 한 광범위한 표적 대사체학(WTM)을 이용한 DBL 수용성 추출물의 포괄적인 화학적 프로파일링; (ii) GFH와 BBA를 가진 FCC에서 생성된 반응성 중간체의 포획; 그리고 (iii) HPLC–MS/MS 및 UHPLC–MS/MS를 이용한 잠재적 독성 성분의 대사 활성화를 통해 형성된 GSH/BBA 부가물의 검출 및 구조적 규명. 이 통합 접근법은 복잡한 TCM 매트릭스에서 DBL 유발 간 독성의 주요 전구체를 명확하게 식별할 수 있게 하며, TCM 안전성 평가를 위한 매우 민감하고 구체적인 틀을 제공합니다.

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프로토콜

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참고: 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. DBL 시험 해법 준비

  1. Dioscorea bulbifera L의 덩이줄기 세 배치를 수집하고 인증하세요. 국가 중의학 가공 규격에 따라 덩이줄기에서 섬유질 뿌리를 제거하고, 먼지를 제거하기 위해 세척한 뒤, 신선할 때 두께 1cm 원형 조각으로 썰고, 60°C의 강제 공기 오븐에서 건조한 후 제거하여 실온20도(H)로 냉각합니다.
  2. 각 배치에서 200g DBL을 무게 달아 고속 분쇄기로 거친 분말(입자 크기 250-850 μm)으로 분쇄합니다.
  3. 원시 분말 20g을 200mL의 탈이온수(1:10, w/v)에 30분간 담가. 동시에, 1.2단계에서 준비한 세 배치의 거친 분말 혼합물을 공정합니다(1:1:1 비율로 혼합).
  4. 역류식으로 60분 가열하여 적신 물질을 추출하세요. 추출물을 거즈나 체로 걸러내어 불용성 잔류물을 제거하세요. 남은 잔류물에 200mL의 탈이온수를 추가하고, 역류 추출을 2회, 각각 60분씩 반복합니다. 세 가지 여과물을 모두 결합한 후 최종 부피 100mL로 끓여 축액을 만듭니다.
  5. 농축된 추출물을 진공 동결 건조기로 옮긴 후 동열하여 분말을 얻습니다.
  6. 추출물 분말 각 배치당 18mg을 정확히 계량하세요. 각각을 50% 아세토니트릴 1.5mL에 녹인 뒤, 균질성을 위해 30초간 혼합물을 소용돌이로 돌립니다.
  7. 용액을 13,800 x g 에서 4°C에서 10분간 원심분리한 후, 상원액을 MLM 배양 용액으로 수집합니다.
  8. 피펫에 20 μL 스톡 용액을 적추고, 50% 아세토니트릴과 함께 1:50으로 희석한 후 30초 동안 소용돌이로 만집니다. 그 후 0.22 μm 미세다공성 멤브레인을 통과시켜 질량분석에 적합한 샘플 용액을 얻습니다.

2. DBL의 화학적 특성 분석

  1. 크로마토그래피 조건
    1. C18 컬럼(2.1 mm x 100 mm, 1.8 μm)을 사용하고 컬럼 오븐 온도를 40 °C로 설정하세요. 이동상 A는 물에 0.1%(v/v) 형태로, 이동상 B는 아세토니트릴로 준비합니다.
    2. 기울기 용출 프로그램은 다음과 같습니다: 0–10분, 2%–50% B; 10–11분, 50%–95% B; 11–13분, 95% B. 유속을 분당 0.4mL로 설정하고 샘플 2 μL를 주입합니다.
  2. 다음 매개변수를 사용하여 질량분석분석을 수행합니다: 이온 소스: IonDrive Turbo V 전기분사 이온화(ESI); 획득 모드: 양이온 및 음이온 모드에서 동시에 획득하는 다중 반응 모니터링(MRM); 이온 분사 전압: +5.5 kV (양극) / −4.5 kV (음수); 커튼 가스: 35 psi; 원천 온도: 400 °C; 이온 소스 가스 1: 60 psi; 이온 소스 가스 2: 60 psi; 탈클러스터 잠재력(DP): ±100 V.
  3. 데이터 처리
    1. SCIEX 분석가 소프트웨어(v1.6.3)를 사용하여 MRM 데이터를 획득하고 처리할 수 있습니다. 원시 데이터 파일(.wiff)을 MSConvert를 사용해 TXT 형식으로 변환하세요. 독점 BiotreeDB(V2.1) MS 라이브러리를 쿼리하여 검출된 화합물에 주석을 달아주세요. 주석은 보존 시간(RT), 질량-전하 비율(m/z), 파편화 패턴을 실제 표준과 일치시키는 데 기반했습니다.

3. MLM 인큐베이션에서 생성된 GSH/BBA 결합의 특성화

  1. 다단계 인큐베이션
    1. 쥐 간 미세분체 현탁액을 얼음 위에 천천히 녹여 주세요. 얼음 위에 2mL 마이크로 원심분리관에서 아래에 나열된 성분들을 순차적으로 첨가하여 배양 혼합물을 준비합니다. 마지막으로 NADPH 재생 시스템을 추가하세요. 대조군의 경우, NADPH 재생 시스템을 같은 양의 얼음처럼 차가운 PBS로 교체하세요. 잠깐 보텍스를 섞어.
      1. 다음 성분으로 포함된 배양 혼합물을 준비합니다: 마우스 간 미소염체 현탁액(MLM, 4 mg/mL 단백질): 125 μL; 염화마그네슘(MgCl₂) 용액(32 mM): 10 μL; DBE(12 mg/mL) 또는 DSB 표준 용액(35 mM): 10 μL; 글루타치온(GSH) 용액 (50 mM): 100 μL; BBA 용액(250 mM): 10 μL; PBS 버퍼(pH 7.4, 1.0 mol/L EDTA 및 0.1 mol/L K2HPO4 포함): 145 μL; NADPH 재생 시스템 용액(5.0 mM): 100 μL.
    2. 인큐베이션이 끝나면 즉시 인큐베이터에서 모든 튜브를 제거하세요. 효소 반응을 종료하려면 각 튜브에 1mL의 얼음 냉각 아세토니트릴(-20 °C)을 첨가합니다.
    3. 단백질을 침전시키기 위해 3분간 소용돌이를 가세요. 13,800 x g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기.
    4. 상원액을 수집하고 0.22 μm 막을 통과한 후 여과액을 오토샘플러 바이알로 옮깁니다.
  2. HPLC-MS/MS에 의한 DBL 추출물의 MLM 배큐 예비 스크리닝
    1. 크로마토그래피 조건
      1. C18 컬럼(150mm x 4.6mm, 3μm)을 사용하고 컬럼 온도를 25°C로 설정하세요. 이동상 A는 물에 0.1%(v/v) 형태로, 이동상 B는 아세토니트릴로 준비합니다.
      2. 다음 구사를 진행하세요: 0–2분, 10% B; 2–15분, 10%에서 90% B로 선형 증가. 유속을 분당 0.8mL로 설정하고 준비된 샘플 5 μL를 주입합니다.
    2. 질량분석의 조건. 전체 스캔 범위를 m/z 500–1000으로 설정하세요. 전구체 이온(PI)은 m/z 169와 171에서 스캔하고, 양이온 모드에서는 129 Da의 중성 손실(NL) 스캔, 음이온 모드에서는 m/z 272에서 PI 스캔을 합니다. 주요 매개변수를 다음과 같이 설정하세요: 이온 분사 전압(IS), +5,500 V(양음) / −4,500 V(음수); 탈클러스터 전위(DP), ±70 V; 입구 전위(EP), ±10 V; 충돌 에너지(CE), +35 V(양수) / −40 V(음수); 충돌 셀 출구 전위(CXP), ±10 V; 이온 소스 가스 1 및 2(GS1/GS2), 각각 50 psi; 커튼 가스(CUR), 40 psi; 원천 온도(TEM)는 650 °C입니다.
    3. SCIEX 분석가 소프트웨어(v1.6.3)를 사용하여 모든 질량분석데이터를 수집하고 처리합니다.
  3. UHPLC-HRMS를 이용한 피롤 유도체 및 FCC 식별
    1. 크로마토그래피 조건
      1. C18 컬럼(2.1 mm x 100 mm, 1.9 μm)을 사용하고 컬럼 오븐을 30 °C로 설정하세요. 이동상 A는 물에 0.1%(v/v) 형태로, 이동상 B는 아세토니트릴로 준비합니다.
      2. 경사는 다음과 같이 프로그래밍합니다: 0-20분, 5%-95% B; 20-21분, 95% B. 유속을 0.3 mL/min으로 설정하고 샘플 2 μL를 주입합니다.
    2. 다음 매개변수로 질량분석분석을 수행하십시오: 이온 원원: ESI; 이온 분사 전압: +3.5 KV (양이온) / -2.5 KV (음의 이온); 모세혈관 온도: 320 °C; 프로브 히터 온도: 350 °C; 칼집 가스: 10 Arb; 최대 분무 전류: 100 μA; S-렌즈 RF 레벨: 50%; 충돌 에너지: 35 V(양 이온)와 40 V (음 이온); 스캔 범위: 100-1000 m/z.
    3. 데이터 전처리
      1. DBL에서 확인된 FCC와 포획 메커니즘(그림 1)을 바탕으로 ChemBioDraw Ultra 14.0을 사용해 예측된 GSH/BBA 공액액을 추출합니다(보조 그림 1).
      2. 획득한 HRMS 원본 파일(.raw)을 Xcalibur(V4.1)의 Qual Browser 모듈로 가져오세요. GSH/BBA 동액을 선별하는 소프트웨어 내 식별 워크플로우를 만드세요.
      3. 실험적 MS1 및 MS2 스펙트럼을 FCC에서 유도된 GSH/BBA 공액 공액 조합의 예측 구조(ChemBioDraw Ultra 14.0을 사용)와 비교하며, 알려진 유가 메커니즘을 기반으로 합니다(그림 1 및 보충 그림 1). 모든 모니터링 이온에 대해 최소 최대 강도 임계값을 1 x 105 와 질량 정확도 허용 ± 10 ppm을 사용하세요. MS1 및 MS2 스펙트럼에서 관찰된 특징적인 브로민 동위원소 패턴(약 1:1)을 기반으로 결합 물질을 확인하며, m/z 169와 171의 진단 이온도 포함됩니다.
      4. 관찰된 분자 이온에서 GSH/BBA 태그의 질량을 빼서 모체 FCC의 분자량을 결정합니다. 뺄셈에는 472/474 Da (C17H21O5N4BrS)를 사용하세요.
      5. 위 결과를 바탕으로 UHPLC–HRMS로 DBL의 상위 FCC를 특성화합니다.

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결과

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DBL에서 확인된 FCC
DBL의 화학 프로파일을 특성화하기 위해 삼중 쿼드러폴 기반 WTM과 HRMS 프로파일링을 결합하여 사용했습니다. 이 이중 접근법은 추출된 이온 쌍의 포괄적 분석을 가능하게 하여, 매우 유용한 추출 이온 크로마토그램(EIC, 그림 3A)과 총 이온 크로마토그램(TIC, 그림 3B)을 생성할 수 있게 했습니다. 최적화된 크로마토그래피 및 검출 조건 하에서 총 849종의 화합물이 20개 화학 계열에 걸쳐 확인되었습니다(그림 3C). 특히, DBL 추출물에서 27종의 푸라노이드가 검출되었으며, 이 중 10종은 푸라노이드 디테르페노이드입니다: 디오스불빈 B(DSB), C(DSC), D (DSD), E (DSE), G (DSG), J (DSJ), L (DSL)...

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토론

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DBL의 간독성에 대한 이전 연구는 주로 표적 포획 전략을 사용하여 개별 FCC의 대사 중간체에 초점을 맞췄습니다 9,22. 이러한 접근법들은 유용한 기전적 통찰을 제공하지만, 복잡한 허브 행렬에서의 효과는 저함량의 생체활성화 중간체의 검출 가능성이 낮아 제한되는 경우가 많습니다. 본 연구에서는 DBL에서 간독성 FCCs의 체계적 식별을 위한 향상된 분석 워크플로우를 개발하였습니다. 이 전략의 주요 장점은 WTM, 반응성 중간체 포획, HRMS의 통합으로, 복합 추출물 내 생체활성화 푸란의 민감한 검출이 가능하다는 점입니다. 구체적으로, MRM 모드로 작동하는 UHPLC–MS/MS 플랫폼을 사용하여 DBL 추출물에서 총 843개의 화합물이 특성화되었으며, 그중 21개의 FCC가 확인되었으며, 여기에는 4개의 퓨란 디테르페노이드가 포함되었습니다(표 1)...

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공개 사항

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저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국가자연과학기금(번호 82360759), 귀저우성 자연과학기단(번호) ZK [2024]406, ZK [2024] 397, 박사후 연구소 [2021]007, BSH [2024]005), 그리고 구이저우 중의학대학교 TD Hopes [2023]005.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-브로모벤질아민지우딩 케미컬(상하이) 테크놀로지 유한회사X114214A
아세토니트릴시그마-올드리치 (상하이) 트레이딩 컴퍼니 유한회사1000294000
원심분리기우시 백탁케 생명공학 유한회사CR3180
크로마토그래피  샘플  병들저장성 ALWSCI 기술 유한회사C0000008
디오스불빈 B청두 푸페이드 바이오테크 유한회사(Chengdu PufeiDe Biotech Co., Ltd)18022603
Dioscorea bulbifera L.-DBL-1; DBL-2; DBL-3식물 재료는 중국 구이저우 중의학대학교 웨이커 장(Weike Jiang) 교수에 의해 인증되었으며, 표본 표본은 구이저우성 기초약리학 핵심 연구소에 기탁되었습니다.
전자 저울상하이 안팅 전자기기 공장FA1004B
개미산써모피셔 사이언티픽  컴퍼니 주식회사195715
글루타치온시그마-올드리치 (상하이) 트레이딩 컴퍼니 유한회사SLBX5462
고속 및 nbsp; 크러셔용강 비아오 하드웨어 제품 유한회사XC-2000Y
쿤밍 마우스 간 미세체(수컷)대롄 메이룬 생명공학 유한회사.MB12496-1
염화마그네슘베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 주식회사M8161
메탄올시그마-올드리치 (상하이) 트레이딩 컴퍼니 유한회사646377
밀리포어 필터톈진 진텡 실험 장비 유한회사나일론66
NADPH Na4베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 주식회사102X022
오븐톈진 실험실 기기 및 장비 주식회사GFL125
인산 완충 식염수비요타임 바이오테크놀로지  주식회사C0221B
온도조절기와 nbsp; 워터  배스  발진기상하이 자지아 기기 유한회사THZ-82A
초동고써모피셔 사이언티픽  컴퍼니 주식회사TDE60086FV-ULTS
초음파 세척기상하이 자지아 기기 유한회사L10-250A
보텍스 믹서장쑤 하이먼 의료기구 공장VM-D

참고문헌

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